Vi præsenterer her, en protokol for sporing genomisk DNA (gDNA) forurening i RNA prøver. Metoden præsenteres udnytter primere specifikke for regionen indre transskriberede spacer (ITS) i ribosomale DNA (rDNA) gener. Metoden er velegnet til pålidelige og følsomme påvisning af DNA forurening i de fleste eukaryoter og prokaryoter.
En metode, flittigt brugt til kvantificering af gen expression ændringer og udskrift mængder er omvendt-transskription kvantitative real-time PCR (RT-qPCR). Det giver præcise, følsomme, pålidelig og reproducerbare resultater. Flere faktorer kan påvirke følsomheden og specificiteten af RT-qPCR. Resterende genomisk DNA (gDNA) forurener RNA prøver er en af dem. I gen expression analyse, uspecifikke forstærkning på grund af gDNA forurening vil overvurdere overfloden af udskrift niveauer og kan påvirke RT-qPCR resultater. Generelt, gDNA registreres af qRT-PCR ved hjælp af primer par udglødning intergenic regioner eller en intron af gen af interesse. Desværre kendes intron/exon anmærkninger endnu ikke for alle gener fra hvirveldyr, bakterier, protist, svampe, plante og hvirvelløse metazoan arter.
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af gDNA forurening i RNA prøver ved hjælp af ribosomale DNA (rDNA)-baserede primere. Metoden er baseret på de unikke kendetegn ved rDNA: deres multigene karakter, stærkt bevarede sekvenser og høj frekvens i genomet. Også som Case, et entydigt sæt af primere blev designet baseret på regionen bevarede ribosomale DNA (rDNA) i familien (Poaceae). Universel anvendelse af disse primer par blev testet ved at smelte kurve analyse og Agarosen gelelektroforese. Selv om vores metode forklarer hvordan rDNA-baserede primere kan anvendes til gDNA forurening assay i familien (Poaceae), det let kunne bruges til andre prokaryot og eukaryote arter
Udforske transkriptionel regulering af interessant gen sæt eller signalering netværk er vigtigt at forstå de komplekse molekylære mekanismer involveret i biologiske hændelser1. I øjeblikket er qPCR analyse mest udbredte tilgang til gen expression undersøgelser, der kan målrette enten DNA (genomet) eller RNA (transkriptom) som tillader methylome og transkriptom analyse, henholdsvis. Reverse transkription (RT) efterfulgt af qPCR er almindeligt brugt til transkriptom analyse, der måler gen expression niveauer i forskellige områder af biologiske forskning2. Sammenlignet med andre metoder såsom den traditionelle nordlige hybridisering, væv specifik registrerings via in situ hybridisering, ribonuklease beskyttelse assays (RPA) og semi-RT-PCR, nøjagtigheden, bekvemmelighed, hastighed og bredt dynamikområde af qPCR-baserede assays er meget bemærkelsesværdig3,4. Der er flere vigtige faktorer, der skal anses for en pålidelig kvantificering af messenger RNA (mRNA), herunder kvaliteten og kvantiteten af RNA starter materiale. Derudover skal uspecifikke forstærkning, effektiviteten af RT-qPCR og PCR effektivitet overvejes5,6.
Tilstedeværelsen af gDNA er en iboende problem under RNA udvinding skyldes, dels at DNA og RNA7lignende fysiske og kemiske egenskaber. På grund af sekvens identitet gDNA og supplerende DNA (cDNA) afledt af mRNA prøver, kan der forekomme uspecifikke forstærkning, som vil påvirke nøjagtigheden af RT-qPCR resultater. De resterende gDNA vil føre til overvurdering af overfloden af målrette mRNA i gen expression analyse8.
Dybest set, uspecifikke amplikon hovedsagelig udspringer af primer-dimer dannelse eller uspecifik baggrund forstærkning på grund af gDNA, som begge kan vurderes ved hjælp af passende kontrolprøver. Prøverne er ingen template control (NTC) og ingen reverse transkriptase kontrol (NRT), henholdsvis. Da adskiler gDNA forureningsniveauer i prøverne undersøges og følsomhed overfor gDNA varierer meget mellem de gener, der er analyseret, er NRT kontrol påkrævet for hvert tabelpar, prøve/assay. Selv om dette øger betydeligt omkostninger og arbejdskraft i RT-qPCR profilering undersøgelser, er disse kontrolelementer påkrævet7,9.
Alternative metoder beskæftiger sig med gDNA forurening omfatter brug af primer par udglødning intergenic regioner eller en intron gen interesse10, og brugen af primere, der enten flankere en stor intron eller spænder over en exon-exon junction, dvs. de udgloedning websteder er fraværende i den modne mRNA sekvens1,4. Dog er intron/exon anmærkninger for alle gener fra mange hvirveldyr, bakterier, protist, svampe, plante og hvirvelløse metazoan arter kendt endnu. Derudover har mange Eukaryote organismer pseudogenes afledt af dobbeltarbejde begivenheder. Yderligere, primer design på tværs af introns kan ikke garantere ikke-forstærkning af gDNA. Som kromatin tilgængelighed af genomisk regioner til DNase jeg varierer, det anbefales at designe forskellige primer par målretter anderledes kromosomer10.
Genomer af Eukaryote organismer kan omfatte op til tusind eksemplarer af rDNA gener kodning ribosomale underenheder nødvendige for ribosomer dannelse. Disse rDNA gener er ofte organiseret i enkelt- eller tandem repeat arrays11. Polycistronic rRNAs (figur 1) herunder store subunit (LSU) og små subunit (SSU) er transskriberet af RNA polymerase jeg (RNA pol jeg). De resulterende pre-rRNAs behandles yderligere ved at fjerne de to interne transskriberede spacer regioner ITS1 og ITS2. Som færdige produkter, tre modne rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S og 25-28S rRNA (LSU) er genereret12. rDNA gener er typiske repræsentanter for en multigene familie med stærkt bevarede sekvenser. De forekommer med en høj frekvens i genomet og er potentielt til stede i mere end én kromosomale placering13. Behandling af rRNA og nedbrydningen af de transskriberede spacere er en hurtig proces i nucleolus. Den høje grad af repetitiveness, er forholdet mellem genomisk eksemplarnummer og påviselige uforarbejdede RNA premolecules lavere i forhold til lav-kopi intron sekvenser og unspliced prækursorer. Disse funktioner gør rDNA gener velegnet til pålidelig og yderst følsomme påvisning af gDNA forurening i de fleste eukaryoter og prokaryoter3.
Her er en roman procedure til påvisning af gDNA forurening i RNA prøver beskrevet. Et sæt af universal primere baseret på rDNA bevaret sekvens er præsenteret for gDNA assays i flere arter, græs-familien. Specificitet og universelle karakter af de foreslåede primere blev testet ved at smelte kurve analyse ved hjælp af DNA som en skabelon. Vores protokol er ikke kun gældende for græs-familien, men kan også let tilpasses til andre eukaryote og prokaryote arter.
Gen expression analyse af kvantitativ PCR har været udbredt i de seneste år. Den største fordel ved denne hurtige, omkostningseffektive og automatiseret metode er dens præcise og nøjagtige resultat. At opnå optimal fordele fra disse fordele kræver imidlertid en klar forståelse af opsætningen af de parametre, der bruges til qPCR eksperiment. For at modtage et pålideligt resultat i qPCR gen expression analyse, er det nødvendigt at undgå de uspecifikke forstærkning, der udspringer af primer-dimer eller gDNA forurening i RNA prøve3,15. Det forventes, at RNA udskrift niveauer vil være overvurdere under gDNA forurening8. Her, de unikke kendetegn ved et rDNA-gen blev anset for en gDNA forurening assay i RNA prøver.
Grundlæggende egenskaber af rDNA bruges i denne protokol: Ribosomale gener består af de to ITSs, nemlig ITS1 og ITS2, og de tre rRNA kodning gener, 17-18S, 5.8S og 25-28S subunit12. De to ITS regioner indgår ikke i den kodende sekvens af de ribosomale underenheder. De er fjernet ved mindst tre enzymaktiviteter at behandle forløber for at modne rRNA: en endonuklease, helicase og exonuclease aktivitet. Som ribosomale RNA er transkriberet som en polycistronic udskrift, er et primærprodukt, der indeholder ITSs bestemt til stede. Behandlingen er meget hurtig og finder sted i nucleolus, og mængden af påviselige forløber molekyler, der indeholder ITS er under detektionsgrænsen for metoden qPCR. Derfor, når ITS1 eller ITS2 forstærkes af ITS flankerende primere, ingen forstærkning kan påvises i RNA prøver medmindre gDNA forurening er til stede. Antallet af rDNA gener i genomet af Eukaryote organismer blev anslået til at omfatte op til 1.000 eksemplarer, som er arrangeret i enkelt eller tandem arrays på på kromosomer11. I denne protokol foreslår vi en alternativ måde i stedet for NRT, at opdage gDNA forurening, som bruges i hver reaktion/assay.
Fordele og begrænsninger med hensyn til eksisterende metoder: NRT bruges typisk til at teste, om eksemplet rede RNA er ren eller forurenet af gDNA. Da gDNA forurening ikke er fordelt jævnt mellem forskellige RNA prøver, og reaktionen følsomhed over for gDNA påvirket væsentligt af de gener, der er analyseret, er NRT kontrol påkrævet for hver prøve/assay par7,15. Derved føjes væsentligt omkostninger og arbejdskraft ved håndtering af mange prøver samtidig3,9. Andre alternative metoder er dokumenteret i litteraturen omfatter anvendelse af intron specifikke primere til påvisning af gDNA eller designe primere, der enten flankere en intron eller spænder over en exon-exon junction. Begrænsninger af disse metoder stammer fra utilgængelighed intron sekvens oplysninger, ufuldstændige anmærkning af intron/exon struktur og fravær af introns i gener eller pseudogenes af interesse1,4,10 . På grund af udviklingen eksisterer rDNA gener som multigene og yderst velbevarede gen familier. De er meget rigelige i genomet og forekommer på forskellige kromosomer13. Sammenlignet med andre kodning eller nonconding gener, vise rDNA gener den bedste pasform til påvisning af gDNA forurening. I sammenlignende transkriptom analyser, normalisering af qPCR data af rRNA kalibrator anbefales ikke for nogle emner, som forskelle i cDNA forberedelse (polyA priming vs tilfældige hexamer grunding), store forskelle i overflod rRNA og mRNA , og forskellige Biogenese, som genererer vildledende resultater10,16. Men de problemer, vi har netop nævnt er en fordel for gDNA forurening assay. For eksempel med hensyn til højere målretning site overflod i genom og lokalisering på forskellige kromosomer forbedre rDNA-baserede primere væsentligt afsløring følsomhed gDNA i forhold til eksisterende metoder.
Versality af rDNA-baserede til andre organismer: rDNA gener er velundersøgte gen familie identificeret i de fleste organismer. Den foreslåede rDNA-baseret metode repræsenterer et enkelt, meget følsomme og økonomiske system for gDNA forurening assays, der nemt kan tilpasses andre eukaryote og prokaryote organismer (protokol 2 – 5). Som Case, har vi vist her nytten af denne metode i nogle Poceae arter (figur 4 og figur 5). De benyttede primere viser en høj Overførbarhed til andre Poceae arter på grund af den yderst velbevarede struktur af rDNA underenheder blandt arter. Problemet bliver endnu mere vigtigt, når tilstrækkelige genomisk sekvens oplysninger ikke er tilgængelige for primer design. ITS-flankerende primere designet til én art kan således bruges i en beslægtede arter. Også, 5.8S-F/R primere blev plukket baseret på en bevaret motiv, der viser stor lighed i de fleste blomstrende planter14. Selvom høj overførselshastighed sekventering teknikker permanent øger antallet af kendte genomer, exon-intron anmærkning af de fleste organismer er ikke afsluttet, og så er det ofte ikke muligt at designe primere til at spænde en exon-exon grænse. Vores metode forklarer hvordan rDNA-baserede primere kan anvendes til gDNA forurening assay i qPCR analyse af prokaryoter og eukaryoter med henblik på at eliminere dyre NRT kontrol i hvert assay/primer kombination.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af den genetiske og landbrugs bioteknologi Institute af Tabarestan (GABIT), Sari Jordbrugsforskning og naturressourcer Universitet (SANRU). Forskningsgruppen for junior abiotisk Stress genomforskning blev finansieret af IZN (tværfagligt center for afgrøde planteforskning, Halle (Saale), Tyskland. Vi takker Rhonda Meyer for kritisk læsning af manuskriptet.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |