Qui, presentiamo un protocollo per l’analisi genomica contaminazione da DNA (gDNA) in campioni di RNA. Il metodo proposto utilizza gli iniettori specifici per la regione di distanziatore interno trascritti (ITS) di geni ribosomali DNA (rDNA). Il metodo è adatto per il rilevamento affidabile e sensibile di contaminazione da DNA nella maggior parte dei eucarioti e procarioti.
Un metodo ampiamente utilizzato per la quantificazione dei cambiamenti di espressione genica e abbondanze di trascrizione è d’inversione-trascrizione PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Fornisce risultati accurati, sensibile, affidabile e riproducibile. Diversi fattori possono influenzare la sensibilità e la specificità del RT-qPCR. DNA genomico residuo (gDNA) contaminando campioni di RNA è uno di loro. Nell’analisi dell’espressione genica, amplificazione non specifico dovuto contaminazione gDNA sarà sopravvalutare l’abbondanza dei livelli della trascrizione e può influenzare i risultati di RT-qPCR. In genere, gDNA viene rilevato mediante qRT-PCR utilizzando primer coppie ricottura a regioni intergeniche o un introne del gene di interesse. Purtroppo, le annotazioni essone / dell’introne non sono ancora noti per tutti i geni da vertebrato, batteri, protisti, funghi, pianta e specie di Metazoi invertebrati.
Qui presentiamo un protocollo per rilevazione di contaminazione gDNA in RNA campioni usando il DNA ribosomiale (rDNA)-base di primer. Il metodo si basa su caratteristiche uniche di rDNA: loro natura multigenica, sequenze altamente conservate e ad alta frequenza nel genoma. Anche come caso di studio, un unico set di primers sono stati progettati in base alla regione conservata di DNA ribosomiale (rDNA) della famiglia delle graminacee. L’universalità di queste coppie di primer è stata testata da fondere curva analisi e agarosio elettroforesi del gel. Anche se il nostro metodo spiega come primer a base di rDNA possono essere applicate per il dosaggio di contaminazione gDNA della famiglia delle graminacee, potrebbe essere facilmente utilizzato per altre specie prokaryote e dell’eucariota
Esplorare la regolazione trascrizionale di interessante set di gene o reti di segnalazione è essenziale per comprendere i complessi meccanismi molecolari coinvolti in eventi biologici1. Attualmente, l’analisi qPCR è l’approccio più utilizzato per studi di espressione genica che possono essere destinati (genoma) di DNA o RNA (trascrittoma) che consentono analisi methylome e del trascrittoma, rispettivamente. Trascrizione inversa (RT) seguita da qPCR è ampiamente usata per l’analisi del trascrittoma che misurano i livelli di espressione genica in vari settori della ricerca biologica2. Rispetto ad altri metodi come l’ibridazione nordica tradizionale, il rilevamento specifico tessuto via in situ di ibridazione, nelle analisi di protezione della ribonucleasi (RPA) e semi-RT-PCR, la precisione, convenienza, velocità e ampia gamma dinamica del analisi qPCR-based sono altamente notevole3,4. Ci sono diversi fattori importanti che devono essere considerati per una quantificazione affidabile di RNA messaggero (mRNA), tra cui la qualità e la quantità di RNA materiale di partenza. Inoltre, amplificazione aspecifici, l’efficienza di RT-qPCR ed efficienza PCR devono essere considerati5,6.
La presenza di gDNA è un problema inerente durante l’estrazione di RNA, in parte, per le proprietà fisiche e chimiche simili di DNA e RNA7. A causa dell’identità di sequenza di DNA complementare (cDNA) derivate da campioni di mRNA e gDNA, amplificazione aspecifici può verificarsi, che influenzano l’accuratezza dei risultati di RT-qPCR. Il restante gDNA porterà alla sopravvalutazione dell’abbondanza del mRNA di destinazione nel gene espressione analisi8.
Fondamentalmente, l’amplicone non specifici si pone principalmente da formazione di primer-dimero o amplificazione di sfondo non specifico dovuto gDNA, entrambi i quali può essere valutati utilizzando appropriati campioni di controllo. Tali campioni sono senza controllo del modello (NTC) e nessun controllo della trascrittasi inversa (NRT), rispettivamente. Poiché i livelli di contaminazione gDNA nei campioni in fase di studio sono diversi e la sensibilità verso gDNA differisce notevolmente tra i geni analizzati, i controlli NRT sono necessari per ogni coppia di campione/dosaggio. Anche se questo aumenta notevolmente il costo e lavoro negli studi di analisi di RT-qPCR, questi controlli sono necessari7,9.
Metodi alternativi a che fare con gDNA contaminazione includono l’uso di coppie di primer annealing regioni intergeniche o un introne del gene di interesse10e l’uso degli iniettori che fiancheggiano un introne grande o estendersi su una giunzione esone-esone, cioè i siti di ricottura sono assenti nel mRNA maturo sequenza1,4. Tuttavia, le annotazioni di essone / dell’introne per tutti i geni da molti vertebrati, batteri, Protista, funghi, piante e specie di Metazoi invertebrati sono ancora noti. Inoltre, molti organismi eucarioti hanno pseudogeni dagli eventi di duplicazione. Ulteriormente, disegno di primer in introni non garantisce la non-amplificazione di gDNA. Come la cromatina accessibilità delle regioni genomiche di dnasi varia, si raccomanda di progettare coppie di primer diversi cromosomi differenti10di targeting.
I genomi di organismi eucariotici possono comprendere fino a un migliaio di copie di rDNA geni codificanti subunità ribosomali necessaria per formazione di ribosomi. Questi geni rDNA sono spesso organizzati in singole o ripetizione in tandem matrici11. I rRNAs Polycistronic (Figura 1) tra cui la grande unità secondaria (LSU) e la piccola unità secondaria (SSU) sono trascritti dalla RNA polimerasi I (RNA pol io). La risultante pre-rRNA è ulteriormente trattati eliminando le due regioni di distanziatore trascritto interno ITS1 e ITS2. Come prodotti finali, tre coppie i rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S e 25-28S rRNA (LSU) sono generati12. i geni rDNA sono tipici rappresentanti di una famiglia multigenica con sequenze altamente conservate. Si presentano con una frequenza elevata nel genoma e sono potenzialmente presenti in più di una posizione cromosomica13. L’elaborazione del rRNA e il degrado dei distanziali trascritti è un processo veloce nel nucleolo. A causa dell’elevato grado di ripetitività, il rapporto del numero di copie genomiche e premolecules di RNA non trasformati rilevabile è inferiore rispetto alle sequenze di basso-copia introne e precursori unspliced. Queste caratteristiche rendono geni rDNA adatti per rilevamento affidabile e altamente sensibile di gDNA contaminazione nella maggior parte dei eucarioti e procarioti3.
Qui è descritta una procedura innovativa per la rilevazione di contaminazione gDNA in campioni di RNA. Un set di primer universale basata sulla sequenza di rDNA conservato è presentato per gDNA saggi in diverse specie di Poaceae. La specificità e universalità dei primer proposti sono stati testati da analisi della curva di fusione utilizzando il DNA come un modello. Il nostro protocollo non è solo applicabile per Poaceae, ma potrebbe essere anche facilmente adattato ad altre specie eucariotici e procariotici.
Analisi di espressione genica mediante PCR quantitativa sono stato ampiamente applicato negli ultimi anni. Il principale vantaggio di questo metodo rapido, conveniente ed automatizzato è il risultato di preciso e accurato. Tuttavia, guadagnando i benefici ottimali da questi vantaggi richiede una chiara comprensione del setup dei parametri utilizzati per l’esperimento di qPCR. Per ricevere un risultato affidabile in qPCR analisi dell’espressione genica, è necessario evitare l’amplificazione aspecifico che nasce dalla contaminazione primer-dimero o gDNA nel RNA campione3,15. Si prevede che i livelli di trascrizione di RNA saranno essere sopravvalutati sotto gDNA contaminazione8. Qui, le caratteristiche uniche di un gene di rDNA è stato considerato per un dosaggio di contaminazione gDNA nei campioni di RNA.
Proprietà di base della rDNA utilizzata nel presente protocollo: Geni ribosomali sono costituiti i due ITSs, vale a dire ITS1 e ITS2 e i tre geni codificanti di rRNA, 17-18 anni, 5.8S e 25-28S subunità12. Le due regioni ITS non sono parte della sequenza di codificazione delle subunità ribosomali. Che sono stati rimossi da almeno tre attività enzimatiche per elaborare il precursore maturare rRNA: un’attività endonucleasi, elicasi ed esonucleasi. Come il RNA ribosomiale (rRNA) è trascritto come una trascrizione di polycistronic, un prodotto primario contenente il ITSs è sicuramente presente. Il trattamento è molto veloce e si svolge nel nucleolo, e la quantità di molecole precursori rilevabile contenente l’ITS è inferiore al limite di rilevazione del metodo qPCR. Pertanto, quando ITS1 o ITS2 sono amplificati da ITS che fiancheggiano gli iniettori, nessuna amplificazione può essere rilevata in campioni di RNA se non gDNA contaminazione è presente. Il numero di rDNA geni nel genoma di organismi eucariotici è stato stimato per includere fino a un migliaio di copie, che è disposti in singole o in tandem matrici sui cromosomi11. In questo protocollo, vi proponiamo un modo alternativo, invece di NRT, per rilevare gDNA contaminazione, che è usato per ogni reazione/test.
Vantaggi e le limitazioni per quanto riguarda i metodi esistenti: NRT è in genere utilizzato per verificare se il campione di RNA preparato è pulita o contaminati da gDNA. Poiché gDNA contaminazione non è distribuita uniformemente tra i diversi campioni di RNA e la sensibilità di reazione ai gDNA è significativamente influenzata dai geni analizzati, NRT controlli sono necessari per ogni campione/dosaggio coppia7,15. Questo aggiungerà sostanzialmente costi e manodopera durante la manipolazione di molti campioni contemporaneamente3,9. Altri metodi alternativi documentati nella letteratura includono l’uso di introne primer specifici per il rilevamento di gDNA, o primer di progettazione che fiancheggiano un introne o estendersi su una giunzione esone-esone. Le limitazioni di questi metodi derivano dall’indisponibilità di informazioni di sequenza dell’introne, incompleta annotazione della struttura essone / dell’introne e l’assenza di introni nei geni o pseudogeni di interesse1,4,10 . A causa di evoluzione, geni rDNA esistano come famiglie geniche multigenica e altamente conservata. Sono molto abbondanti nel genoma e presenti su cromosomi diversi13. Rispetto ad altri geni di codificazione o nonconding, i geni rDNA Visualizza la misura migliore per la rilevazione della contaminazione gDNA. Nelle analisi trascrittomica comparativa, la normalizzazione dei dati di qPCR di calibratore rRNA non è raccomandata per alcuni problemi, ad esempio differenze nel cDNA preparazione (adescamento di polyA vs casuale hexamer priming), grandi differenze in abbondanza tra mRNA e rRNA , e biogenesi diversa che possono generare fuorvianti risultati10,16. Tuttavia, i problemi che abbiamo appena detto sono un vantaggio per il dosaggio di contaminazione gDNA. Ad esempio, per quanto riguarda la maggiore abbondanza di sito targeting nel genoma e localizzazione su cromosomi diversi, primer a base di rDNA migliorare significativamente la sensibilità di rilevamento di gDNA rispetto a metodi esistenti.
Versatilità di rDNA-based di altro organismo: geni rDNA sono una famiglia di ben studiati geni identificata nella maggior parte degli organismi. Il metodo di base di rDNA proposto rappresenta un sistema semplice, altamente sensibile ed economico per le analisi di contaminazione gDNA che può essere facilmente adattata ad altri organismi eucariotici e procariotici (protocollo n. 2 – 5). Come caso di studio, abbiamo dimostrato qui l’utilità di questo metodo in alcune specie di Poceae (Figura 4 e Figura 5). I primers utilizzati mostrano un alto tasso di trasferibilità ad altre specie di Poceae a causa della struttura altamente conservata di rDNA subunità tra specie. Questo problema diventa ancora più importante, quando non sono disponibile per il disegno dell’iniettore di informazioni di sequenza genomic sufficienti. Così, che fiancheggiano ITS primer disegnati per una specie può essere utilizzato in una specie affini. Inoltre, la 5.8S-primer F/R sono state raccolte basato su un motivo conservato che mostra l’alta somiglianza nella maggior parte delle piante da fiore14. Anche se tecniche di sequenziamento di throughput elevato permanentemente aumentano il numero di genomi noti, l’annotazione di esone-introne della maggior parte degli organismi non è stata completata, e così spesso non è possibile disegnare primers possono estendersi su un bordo di esone-esone. Il nostro metodo spiega come base di rDNA primer può essere applicato per il dosaggio di contaminazione gDNA nell’analisi qPCR di procarioti e negli eucarioti con l’obiettivo di eliminare costosi controlli NRT in ogni combinazione di dosaggio/primer.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dalla genetica e Agricultural Biotechnology Institute di Tabarestan (GAM), Sari Agricultural Sciences e Università di risorse naturali (SANRU). Il gruppo di ricerca junior Abiotic Stress genomica è stato finanziato da IZN (centro interdisciplinare per la ricerca delle piante delle colture, Halle (Saale), Germania. Ringraziamo Rhonda Meyer per la lettura critica del manoscritto.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |