ここでは、RNA サンプルでゲノム DNA (gDNA) 汚染をトレースするためのプロトコルを提案する.提案手法では、リボソーム DNA (rDNA) 遺伝子の内部転写スペーサー領域 (ITS) に特異的なプライマーを利用しています。メソッドは、ほとんどの真核生物と原核生物の DNA 汚染の信頼性と機密性の高い検出に適しています。
遺伝子発現変動とトラン スクリプトの存在量の定量化のため広く使用されて 1 つの方法は、逆のトランスクリプション量的なリアルタイム PCR (RT qPCR) です。正確な敏感な信頼性が高く、再現性のある結果を提供します。いくつかの要因は、RT qPCR の特異性、感度に影響を与えます。RNA のサンプルを汚染残留ゲノム DNA (gDNA) は、それらの 1 つです。遺伝子発現の分析で gDNA 汚染による非特異的増幅はトラン スクリプト レベルの豊富なを過大評価して Rt-qpcr 結果に影響を与えることができます。QRT PCR によって gDNA を検出する一般的に、プライマーを用いた遺伝子間領域または興味の遺伝子のイントロンに焼鈍のペアします。残念ながら、イントロン/エクソンのアノテーションがまだ知られていないすべての遺伝子のため脊椎動物、細菌、原生生物、菌類、植物、および無脊椎動物の後生動物種から。
ここで提案するプロトコル リボソーム DNA (rDNA) を使用して、サンプルの rna gDNA 汚染の検出のためのプライマーをベースします。RDNA のユニークな特徴に基づく: その発現の自然、非常に節約されたシーケンス、およびゲノムの高周波。また事例研究としてプライマーの一意のセット リボソーム DNA (rDNA) イネ科の保存領域に基づいて設計されました。これらのプライマー対の普遍性は、メルトのカーブ解析と agarose ゲル電気泳動によってテストされました。方法で、私たちが rDNA のプライマーは、イネ科 gDNA 汚染の試金のため適用することができます、方法、それを他の原核生物と真核生物の種に簡単に使用できます。
転写制御遺伝子セットを面白いか、シグナル伝達ネットワークの探索は、生物学的イベント1に関与する複雑な分子機構を理解に不可欠です。現在、qPCR 分析は最も広く遺伝子発現研究 (ゲノム) DNA または RNA (トランスクリプトーム) のいずれかを対象とするそれぞれメチロームとトランスクリプトーム解析を可能にするためのアプローチを使用します。QPCR 続く逆のトランスクリプション (RT) は、トランスクリプトーム解析2の生物学的研究のさまざまな領域における遺伝子発現レベルを測定するために使用されています。他の伝統的な北の交配などの方法、組織特異的検出原交配、リボヌクレアーゼの保護試金 (RPA), と半 RT-PCR 法、正確性、利便性、スピード、そして広いダイナミック レンジを経由と比較してください。qPCR ベースのアッセイは、非常に顕著な3,4です。メッセンジャー RNA (mRNA)、RNA の開始材料の量と質などの信頼性の定量化のために考慮する必要があるいくつかの重要な要因があります。さらに、非特異的増幅、RT-qPCR の効率性と PCR 効率を5,6を考慮されなければなりません。
GDNA の存在は、固有の問題 RNA の抽出中にため、一部では、DNA および RNA の7のような理化学的性質。GDNA と相補的 DNA (cDNA) mRNA サンプル由来のシーケンス id のため Rt-qpcr 結果の精度に影響を与えるが非特異的増幅は発生できます。残り gDNA の豊富の過大評価につながる遺伝子発現解析8で mRNA のターゲットします。
基本的には、非特異的増幅はほとんどプライマー二量体形成または gDNA、適切なコントロールのサンプルを使用して、どちらの形で得られる非特異的背景増幅から発生します。そのようなサンプルは、テンプレート コントロール (NTC) して、逆転写酵素コントロール (NRT)、それぞれ。研究されているサンプルで gDNA 汚染のレベルが異なる gDNA に対する感度は、遺伝子解析によって大きく異なりますので、成田コントロールがサンプル/アッセイのペアごとに必要です。これは実質的にコストと Rt-qpcr プロファイリング研究労働増加しますが、これらのコントロールが必要な7,9です。
GDNA 汚染を取扱うことの代替方法がありますプライマー組の遺伝子間領域または利息10の遺伝子と大きなイントロンの側面またはエクソン エキソン接合、すなわちにまたがるプライマーの使用のイントロンに焼鈍アニーリングのサイトが存在しない成熟した mRNA シーケンス1,4。ただし、多く脊椎動物、細菌、原生生物、菌類、植物、および無脊椎動物の後生動物種からすべての遺伝子のイントロン/エクソンのアノテーションはまだ知られています。さらに、多くの真核生物的偽遺伝子に由来する複製イベントがあります。さらに、イントロンのプライマー デザイン gDNA の非増幅とは限りません。クロマチンとしてDNaseをゲノム領域のアクセシビリティ異なります、ターゲットの異なる染色体10異なるプライマー対を設計する勧めします。
真核生物のゲノムは、リボソーム形成に必要なリボソームのサブユニット rDNA 遺伝子のコピーを千まで取囲むことができます。これらの rDNA 遺伝子頻繁、単一またはタンデム繰り返し配列11で構成されます。大サブユニット (LSU) と小サブユニット (SSU) を含むコードする Rrna (図 1) は、RNA ポリメラーゼによる転写が私 (RNA ポル私)。結果前 Rrna は、さらに its 1 領と ITS2 2 つの内部転写スペーサー領域を排除することによって処理されます。最終製品として 3 成熟 Rrna、17-18 s rRNA (SSU)、5.8 s、および 25-28 s rRNA (LSU) は、生成された12。rDNA 遺伝子は非常に節約されたシーケンスと多重遺伝子族の代表です。彼らはゲノムの高頻度で発生、潜在的に 1 つ以上の染色体13の存在です。転写スペーサーの劣化や、rRNA の処理は、核小体の高速プロセスです。園児の度が高いため遺伝子コピー数と検出可能な未処理 RNA premolecules の比率は低コピー イントロン配列や, 前駆体と比較して低いです。これらの機能を行う rDNA 遺伝子のほとんどの真核生物と原核生物3gDNA 汚染の信頼性の高い、高感度の検出に適しています。
ここで RNA サンプルで gDNA 汚染を検出するための新規手順を説明します。保存 rdna に基づく普遍的なプライマーのセットは、いくつかのイネ科植物種間で gDNA 試金のため提示されます。DNA をテンプレートとして使用融解曲線分析による提案のプライマーの普遍性と特異性を調べた。我々 のプロトコルのみイネ科のために適当ではないも簡単に他の真核生物と原核生物の種に適応することができます。
定量的 PCR による遺伝子発現解析は、近年広く適用されています。この急速なコスト効果の高いと自動化された方法の主な利点は、その精密で正確な結果です。ただし、これらの利点から最適利点を得る qPCR 実験に使用するパラメーターのセットアップの明確な理解が必要です。QPCR 遺伝子発現解析で信頼性の高い結果が表示されます、RNA サンプル3,15プライマー二量体または gDNA 汚染に起因する非特異的増幅は避けるべきです。GDNA 汚染8RNA 転写レベルが過大評価することが期待されます。ここでは、rDNA 遺伝子のユニークな特徴は、RNA サンプルで gDNA 汚染分析のためと考えられました。
このプロトコルで使われる rDNA の基礎的性質:リボソーム遺伝子から成っている 2 つの ITSs、its 1 領と ITS2、および 3 つの rRNA エンコーディング遺伝子、17-18 歳、すなわち、5.8 s、25-28 サブユニット12。2 つの ITS 領域はリボソームのサブユニットのコーディング シーケンスの一部ではないです。RRNA を成熟への前駆物質を処理する少なくとも 3 つの酵素活性によって削除される: ヘリカーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ活性。リボソーム RNA をコードするトラン スクリプトとして転写されると ITSs を含む主な製品は、確かにあります。処理は非常に高速と qPCR 法の検出限界値以下、ITS を含む検出可能な前駆体分子の量は、核小体で行われる。したがって、its 1 領または ITS2 は、プライマーの側面により増幅されるとき、増幅検出できますなし RNA サンプルで gDNA 汚染が存在しない限り。真核生物のゲノムにおける rDNA 遺伝子の数は、千コピーの染色体11のシングルまたはタンデム配列で整理されると推定されました。このプロトコルでは各反応/試金で使用される gDNA 汚染を検出する成田ではなく、別の方法を提案する.
の利点と既存のメソッドに関して制限:成田は通常準備された RNA のサンプルがきれいか gDNA によって汚染されたかどうかをテストする使用されます。RNA の異なるサンプル間 gDNA 汚染は均一に分布しない gDNA を反応感度は遺伝子解析によって著しい影響を受けるので、成田コントロールが各サンプル/アッセイ ペア7,15必要です。これは実質的にコストを追加され、労働の多くを処理するときのサンプル同時に3,9。文献に記載されている他の代替方法には、イントロン、gDNA の検出のための特異的プライマーあるいはイントロンの側面またはエクソン エキソンジャンクションにまたがる設計プライマーの使用が含まれます。これらのメソッドの制限はイントロン配列情報、イントロン/エクソン構造の不完全な注釈および遺伝子のイントロンの不在または金利1,4,10 的偽遺伝子の使用不能から生じます.進化のため、rDNA 遺伝子は発現と非常に節約された遺伝子ファミリーとして存在します。高度のゲノムの豊富なと13の異なる染色体上に存在です。他のコーディングや nonconding 遺伝子と比較して、rDNA 遺伝子表示 gDNA 汚染の検出に最適です。比較トランスクリプトーム解析による rRNA キャリブレータ qPCR データの正規化は cDNA の違いなど、いくつかの問題のため推奨されません (ランダム hexamer プライミングとプライミング ポリア) の準備、rRNA と mRNA の豊富に大きな違い、と誤解を招く可能性があります生成する異なる器官結果10,16。しかし、我々 だけ言及している問題、gDNA 汚染測定のための利点です。たとえば、高いターゲット サイト豊富なゲノムと異なる染色体上の局在について rDNA のプライマーは大幅 gDNA 既存手法と比較して検出感度を向上します。
RDNA に基づく他の生物への versality: rDNA 遺伝子はほとんどの有機体の識別された遺伝子家族。RDNA に基づく手法は、他の真核生物と原核生物 (プロトコル 2 – 5) に簡単に適応させること gDNA 汚染の試金のための単純な非常に敏感な経済システムを表します。事例研究として我々 はここでいくつかの Poceae の種 (図 4および図 5) でこのメソッドの有用性を実証しました。使用されるプライマーは表示への移転その他 Poceae 種の種間の rDNA サブユニットの非常に節約された構造のための率が高いです。ゲノム配列に十分な情報がプライマー デザインのため利用できない場合、この問題がより重要になります。したがって、その側面プライマーの 1 つの種のために設計は、近縁種で使用できます。また、5.8 s ・ F ・ R プライマーは、高い類似性は、ほとんどの顕花植物14保存モチーフに基づいて選ばれました。高スループット シーケンス技術は完全に知られているゲノムの数を増やすがほとんど生物のエキソン ・ イントロン アノテーションが完了していないと、それが頻繁エクソン エクソン国境にまたがるにプライマーを設計することが可能。提案手法を説明どのように rDNA のプライマー分析/プライマーの組み合わせごとに高価な成田コントロールを排除することを目標に原核生物と真核生物の qPCR 分析 gDNA 汚染の試金のため適用することができます。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、遺伝子と農業バイオ テクノロジー研究所の Tabarestan (GABIT)、サリ農業科学および天然資源大学 (SANRU) によって支えられました。非生物的ストレス ゲノミクス ジュニア研究グループ資金が供給された IZN (ドイツ、ハレ (ザーレ) 作物植物研究の学際的な中心。原稿の批判的読解ありがとうロンダ マイヤー。
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |