여기, 선물이 RNA 샘플에 게놈 DNA (gDNA) 오염 추적에 대 한 프로토콜. 제시 방법 뇌관 특정 ribosomal DNA (rDNA) 유전자의 내부 베낀된 공백 지역 (ITS)을 활용합니다. 메서드는 대부분의 진핵생물과 원핵생물에서 DNA 오염의 안정적이 고 민감한 검출에 적합 합니다.
진 식 변화와 성적 나타났는데의 정량화에 대 한 광범위 하 게 사용 하는 한 가지 방법은 반전 전사 양적 실시간 PCR (RT-정량)입니다. 그것은, 민감한, 신뢰할 수 있는, 정확 하 고 재현 가능한 결과를 제공합니다. 여러 가지 요인 감도 실시간 정량 Pcr의 특이성을 달라질 수 있습니다. 잔여 genomic DNA (gDNA) RNA 샘플 오염 그들 중 하나입니다. 유전자 표정 분석에서 gDNA 오염으로 인해 일반적인 증폭 사본 레벨의 풍부를과 대 평가 것입니다 하 고 실시간 정량 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로, gDNA qRT-PCR에 의해 검출 된다 intergenic 지역 또는 관심사의 유전자의 intron 어 닐 링 쌍 뇌관을 사용 하 여. 불행히도, intron/exon 주석 알려져 있지 않습니다 아직 모든 유전자에 대 한 척추, 박테리아, 원생 생물, 균 류, 식물, 및 무척 추 동물 metazoan 종에서.
RNA에서 gDNA 오염 탐지 ribosomal DNA (rDNA)을 사용 하 여 샘플에 대 한 프로토콜 여기 제시-뇌관을 기반으로. 메서드는 rDNA의 독특한 기능에 기반으로: 그들의 multigene 자연, 높은 보존된 시퀀스, 그리고 게놈에 높은 주파수. 또한 사례 연구로 서 뇌관의 고유한 집합 Poaceae 가족에서 ribosomal DNA (rDNA)의 보존된 지역에 따라 설계 되었습니다. 이 뇌관 쌍의 보편성은 용융 곡선 분석 및 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 시험 되었다. 우리의 방법에 설명 합니다 있지만 어떻게 rDNA 기반 뇌관, Poaceae 가족에서 gDNA 오염 분석 결과 대 한 적용할 수 있습니다. 다른 원핵생물과 진핵생물 종에 쉽게 사용 될 수
재미 있는 유전자 세트 또는 신호 네트워크의 transcriptional 규칙을 탐구 생물 학적 이벤트1에 관련 된 복잡 한 분자 메커니즘을 이해 하는 것 필수적 이다. 현재, 정량 분석은 가장 널리 사용 되는 접근 유전자 표현 연구 (게놈) DNA 또는 RNA (transcriptome) 대상 수 각각 methylome 및 transcriptome 분석을 허용 하는. 반전 녹음 방송 (RT) 정량 다음 transcriptome 분석 생물학 연구2의 다양 한 분야에서 유전자 식 수준을 측정 하는 널리 사용 됩니다. 다른 전통적인 북부 교 잡 같은 방법, 조직에 제자리 교 잡, ribonuclease 보호 분석 실험 (RPA) 및 세미-RT-PCR, 정확도, 편의 속도, 및의 넓은 동적 범위를 통해 특정 검색에 비해 정량 Pcr 기반 분석 실험은 매우 놀라운3,4. 메신저 RNA (mRNA), RNA 시작 물자의 양과 품질 등의 신뢰할 수 있는 정량화에 대 한 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 요인이 있다. 또한, 일반적인 증폭, 실시간 정량 Pcr의 효율성 및 PCR 효율5,6간주 해야 합니다.
GDNA의 존재는 고유의 문제입니다 RNA 추출 시 인해, 부분적으로, DNA와 RNA7의 유사한 육체 및 화학 재산에. GDNA 및 보완 DNA (cDNA) mRNA 샘플에서 파생 된 시퀀스 id, 때문에 일반적인 확대는 실시간 정량 Pcr 결과의 정확도 영향을 미칠 것입니다 발생할 수 있습니다. 나머지 gDNA의 풍요로 움과 이어질 것입니다 유전자 표정 분석8에서 mRNA를 대상.
기본적으로, 일반적인 amplicon 뇌관 이합체 형성 또는 불특정 배경 증폭 gDNA, 둘 중 적절 한 컨트롤 샘플을 사용 하 여 평가 될 수 있다 때문에에서 주로 발생 한다. 이러한 샘플은 서식 파일 제어 (NTC)와 역전사 제어 (NRT), 각각. 공부 되 고 샘플에서 gDNA 오염 수준의 다른 gDNA 향해 감도 분석 유전자 사이 크게 다릅니다 때문에, NRT 컨트롤은 각 샘플/분석 결과 쌍에 대 한 필요. 이 실질적으로 비용 및 실시간 정량 프로 파일링 연구에 노동 증가 시키지만, 이러한 컨트롤은 필요한7,9.
Intergenic 지역 또는 관심10, 유전자와 큰 intron 측면 또는 스팬 엑손-엑손 교차점, 즉, 뇌관의 사용의 intron 단련 하는 뇌관 쌍의 사용을 포함 하는 gDNA 오염 처리 방법 어 닐 링 사이트는 성숙한 mRNA에서 시퀀스1,4. 그러나, 많은 등뼈 동물, 박테리아, 원생 생물, 균 류, 식물, 및 metazoan 무척 추 동물 종에서 모든 유전자의 intron/exon 주석 아직 알려져 있습니다. 또한, 많은 진 핵 유기 체 pseudogenes 중복 이벤트에서 파생 된 있다. 또한, 뇌관 디자인 introns에 걸쳐 증폭 gDNA 보장 하지 않습니다. 염색 질으로 DNase 를 게놈 지역 접근성 다릅니다, 것이 좋습니다 다른 염색체10를 대상으로 하는 다른 뇌관 쌍을 디자인.
진 핵 생물의 게놈 ribosomal 소 단위 리보솜의 형성에 필요한 인코딩 rDNA 유전자의 한 천 부까지 포괄 수 있습니다. 이러한 rDNA 유전자 종종 단일 또는 탠덤 반복 배열11구성 됩니다. Polycistronic rRNAs (그림 1) 큰 소 단위 (LSU) 등 작은 소 단위 (SSU)는 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 수 난 (RNA pol I). 결과 사전 rRNAs ITS1와 ITS2 두 내부 베낀된 공백 영역을 제거 하 여 추가로 처리 됩니다. 최종 제품으로 3 성숙 rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S, 및 25-28S rRNA (LSU)는 생성 된12. rDNA 유전자는 매우 보존 시퀀스 multigene 가족의 전형적인 대표자. 그들은 게놈에 고주파 발생 되며 하나 이상의 염색체 위치13에 잠재적으로 존재. rRNA의 처리와 베낀된 스페이서의 저하는 핵소체에서 빠른 프로세스입니다. 반복성의 높은 학위 때문 게놈 사본 수와 감지 처리 RNA premolecules의 비율 낮은 복사 intron 시퀀스 및 unspliced 유도체에 비해 낮은. 이러한 기능 대부분의 진핵생물과 원핵생물3에서 gDNA 오염의 안정적이 고 매우 민감한 탐지 적합 rDNA 유전자 확인 합니다.
여기 RNA 샘플에서 gDNA 오염 검출을 위한 새로운 절차 설명 되어 있습니다. 보편적인 뇌관 rDNA 보존 순서에 따라 집합 여러 Poaceae 종에서 gDNA 분석에 대 한 제공 됩니다. 특이성 및 제안 된 뇌관의 템플렛으로 DNA를 사용 하 여 용융 곡선 분석에 의해 시험 되었다. 우리의 프로토콜만 Poaceae, 적용 되지 않습니다 하지만 다른 진 핵 prokaryotic 종에도 쉽게 적용할 수 있습니다.
양이 많은 PCR에 의해 유전자 표정 분석 최근 몇 년 동안에서 널리 적용 되었습니다. 이, 비용, 신속 하 고 자동화 된 방법의 주요 이점은 그것의 정확 하 고 정확한 결과입니다. 그러나, 이러한 장점에서 최적의 혜택을 얻고 정량 실험에 사용 되는 매개 변수 설정에 대 한 명확한 이해 필요. 정량 유전자 표정 분석에서 신뢰할 수 있는 결과 수신, RNA 샘플3,15뇌관 이합체 또는 gDNA 오염에서 발생 하는 일반적인 증폭을 피할 필요가 있다. 그것은 RNA 사본 수준 gDNA 오염8에서 대 평가 될 것으로 예상 된다. 여기, rDNA 유전자의 독특한 특징은 RNA 샘플에서 gDNA 오염 분석 결과 대 한 고려 되었다.
이 프로토콜에 사용 되는 rDNA의 기본 속성: Ribosomal 유전자 구성 두 ITSs, 즉 ITS1 ITS2, 그리고 3 개의 rRNA 인코딩 유전자, 17-18, 5.8S, 및 25-28S 소 단위12. 두는 지역 ribosomal 소 단위의 코딩 시퀀스의 일부가 되지 않습니다. 그들은 성숙 rRNA 전조 처리를 3 개 이상 효소 활동에 의해 제거 됩니다: endonuclease, helicase, 및 exonuclease 활동. 리보솜 RNA는 polycistronic 사본으로 복사할 수 있습니다, 포함 하는 ITSs 기본 제품 확실히 존재 이다. 처리가 매우 빠른 이며, 핵소체에서 이며 ITS를 포함 하는 감지 선구자 분자의 양을 정량 방법의 검출 한계 미만. 따라서 때 ITS1 또는 ITS2는 증폭 ITS에 의해 측면에 서는 뇌관, 아니 증폭 감지할 수 있습니다 RNA 샘플에서 gDNA 오염 존재 하지 않는. 진 핵 생물의 게놈에 있는 rDNA 유전자의 수는 염색체11에 단일 또는 협동 배열에서 배열 최대 천 복사본을 포함 하도록 추정 되었다. 이 프로토콜에서 대체 하는 방법, NRT, 대신 gDNA 오염, 각 반응/분석 결과에 사용 되는 검색 제안 한다.
이점 및 기존의 방법에 관하여 제한: NRT는 일반적으로 깨끗 한 또는 gDNA에 의해 오염 된 준비 RNA 샘플 인지 테스트 하는 데 사용 됩니다. GDNA 오염은 다른 RNA 샘플 사이 하지 균일 하 게 분산 되 고 반응 감도 gDNA 분석 하는 유전자에 의해 크게 영향을 받습니다, NRT 제어는 각 샘플/분석 결과 쌍7,15필요 합니다. 이것은 실질적으로 비용을 추가 및 노동 많은 처리 하는 경우 동시에3,9합니다. 문학에서 문서화 하는 다른 대체 방법 intron gDNA의 검출에 대 한 특정 뇌관 또는 그는 intron 측면 또는 스팬 엑손-엑손 접합 설계 뇌관의 사용을 포함 합니다. 이러한 방법의 한계 intron 시퀀스 정보, intron/exon 구조의 불완전 한 주석 및 유전자에서 introns의 부재 또는 관심1,4,10의 pseudogenes의 불가능에서 줄기 . 때문에 진화, rDNA 유전자 multigene 고 고도로 보존 유전자 가족으로 존재 한다. 그들은 매우 게놈에서 풍부 하 고 다른 염색체13에입니다. 다른 코딩 또는 nonconding 유전자에 비해, rDNA 유전자 표시 gDNA 오염 탐지에 대 한 최적. 비교 transcriptomic 분석, rRNA 캘 리브레이 터에 의해 정량 데이터의 정규화 추천 되지 않는다 cDNA 차이 같은 몇 가지 문제에 대 한 준비 (무작위 hexamer 못쓰게 대 polyA 못쓰게), rRNA mRNA 사이에서 큰 차이 그리고 오해의 소지가 발생할 수 있습니다 다른 속 결과10,16. 그러나, 우리가 방금 언급 한 문제는 gDNA 오염 분석 결과 대 한 장점. 예를 들어 높은 대상 사이트 풍부한 게놈, 및 다른 염색체에 지역화에 관하여 rDNA 기반 뇌관 기존의 방법에 비해 gDNA의 검출 감도 크게 향상 됩니다.
의 rDNA-다른 유기 체를 기반 versality: rDNA 유전자는 대부분의 유기 체에서 확인 된 잘 공부 유전자 가족. 제안된 된 rDNA 기반 방법 다른 진 핵 prokaryotic 유기 체 (프로토콜 2-5)에 쉽게 적용할 수 있습니다 gDNA 오염 분석을 위한 간단 하 고 매우 민감한 경제 시스템을 나타냅니다. 사례 연구로 우리 시연 여기 일부 Poceae 종 (그림 4 및 그림 5)에이 방법의 유틸리티. 사용 된 뇌관 다른 Poceae 종 종 가운데 rDNA subunits의 높은 보존된 구조 때문에 양도의 높은 속도 표시합니다. 충분 한 게놈 시퀀스 정보 뇌관 디자인을 위해 사용할 수 없는 경우이 문제가 더욱 중요 해 집니다. 따라서, 한 종족에 대 한 설계는 측면 뇌관 관련된 종에 사용할 수 있습니다. 또한, 5.8S-F/R 뇌관 대부분 꽃 식물14높은 유사성을 보여 주는 보존된 모티브에 따라 선택 되었다. 높은 처리량 시퀀싱 기법 영구적으로 알려진된 유전자의 수를 증가, 하지만 대부분의 유기 체의 exon intron 주석 완료 되지 않으면, 그리고 그래서 그것은 종종 불가능 엑손-엑손 경계에 걸쳐 뇌관 디자인. 우리의 방법에 설명 합니다 어떻게 rDNA 기반 뇌관 gDNA 오염 분석 결과 각 분석 결과/뇌관 조합에 비싼 NRT 컨트롤 제거의 목표를 가진 원핵생물과 진핵생물의 정량 분석에 적용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 유전 및 농업 생명 공학 연구소의 Tabarestan (GABIT), 사리 농업 과학과 자연 자원 대학 (SANRU)에 의해 지원 되었다. 주니어 리서치 그룹 Abiotic 스트레스 유전체학 IZN (작물 식물 연구, 할레 (Saale), 독일 학 제 센터에 의해 투자 되었다. 우리는 중요 한 독서의 원고에 대 한 론다 메이어를 감사합니다.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |