Burada, RNA örneklerinde genomik DNA (gDNA) kirlilik izleme için bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntem astar özel ribozomal DNA (rDNA) gen iç kopya etmek spacer bölge (ITS) için kullanır. Yöntem güvenilir ve hassas algılama DNA kirlenme çoğu Ökaryotlar ve prokaryotlar için uygundur.
Yoğun gen ifade değişiklikleri ve transkript miktar miktar için kullanılan bir ters-transkripsiyon nicel gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) yöntemidir. Doğru hassas, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Çeşitli faktörler duyarlılık ve özgüllük RT-qPCR etkileyebilir. RNA örnekleri kirletici kalan genomik DNA (gDNA) onlardan biri. Gen ifade analizi, non-spesifik amplifikasyon gDNA kirlilik nedeniyle transkript düzeyleri bolluk abartma ve RT-qPCR sonuçları etkileyebilir. Genel olarak, gDNA qRT-PCR tarafından algılanır astar kullanarak çiftleri intergenic bölgeler veya bir intron faiz gen tavlama. Ne yazık ki, intron/exon ek açıklamalar tüm genler için omurgalılar, bakteri, protista, mantar, bitki ve omurgasız metazoan türler bilinen henüz değil.
Burada algılama RNA içinde gDNA kirlenme ribozomal DNA (rDNA) kullanarak örnekleri için bir iletişim kuralı mevcut-astar dayalı. Bu yöntem rDNA benzersiz özellikleri üzerinde dayanır: onların multigene doğa, son derece korunmuş dizileri ve yüksek frekans genom içinde. Ayrıca bir vaka çalışması olarak astar benzersiz bir kümesi tasarlanmıştır tabanlı ribozomal DNA (rDNA) buğdaygiller ailesindeki korunmuş bölge. Bu astar çiftleri evrenselliğini eritebilir eğrisi analizi ve özel Jel Elektroforez tarafından test edildi. Her ne kadar bizim yöntem açıklar nasıl rDNA dayalı astar buğdaygiller aile içinde gDNA kirlenme tahlil için uygulanabilir, bu kolayca diğer prokaryotlar ve ökaryot türler için kullanılabilir
Gen kümeleri ilginç veya ağları sinyal transkripsiyon yönetmelik keşfetmek karmaşık moleküler mekanizmaları biyolojik olaylar1‘ de yer alan anlamak önemlidir. Şu anda, qPCR en yaygın yaklaşım analizi, methylome ve transcriptome sırasıyla izni (Genom) DNA veya RNA (transcriptome) hedefleyen gen ifade çalışmaları için kullanılan. analizidir. Ters transkripsiyon (RT) qPCR tarafından takip çeşitli alanlarda Biyolojik araştırma2gen ifade düzeyleri ölçmek transcriptome analiz için yaygın olarak kullanılır. Karşılaştırıldığında diğer gibi geleneksel Kuzey hibridizasyon yöntemleri, doku özel algılama içinde in situ hibridizasyon, ribonükleaz koruma deneyleri (RPA) ve yarı-RT-PCR, doğruluğu, kolaylık, hız ve geniş dinamik alan değerleri üzerinden qPCR tabanlı deneyleri son derece dikkat çekici3,4vardır. Mesajcı RNA (mRNA), kalite ve malzeme başlayan RNA miktarı dahil olmak üzere güvenilir bir miktar için dikkate alınması gereken çeşitli faktörler önemli. Ayrıca, non-spesifik amplifikasyon, RT-qPCR verimliliğini ve PCR verimlilik5,6düşünülmesi gerek.
GDNA içsel bir sorun RNA ayıklama sırasında nedeniyle, kısmen, benzer fiziksel ve kimyasal özellikler DNA ve RNA7için varlığıdır. GDNA ve Tamamlayıcı DNA (cDNA) mRNA örneklerinden elde edilen sıra kimlik nedeniyle, non-spesifik amplifikasyon, hangi RT-qPCR sonuçları doğruluğunu etkiler oluşabilir. Kalan gDNA ve bereket tahmindi için yol açacaktır mRNA gen ifade analiz8‘ hedef.
Temel olarak, non-spesifik amplicon çoğunlukla astar-dimer oluşumu veya belirsiz arka plan amplifikasyon gDNA, ikisi de uygun kontrol örnekleri kullanarak tespit edilebilir nedeniyle ortaya çıkar. Böyle örnekleri herhangi bir şablon kontrolü (NTC) ve ters transkriptaz kontrol (NRT), sırasıyla vardır. Beri okudu örnekte gDNA kirlenme düzeyleri farklı ve gDNA karşı duyarlılığı, büyük ölçüde analiz genler arasında farklıdır, NRT denetimleri her örnek/tahlil çifti için gereklidir. Bu önemli ölçüde maliyet ve RT-qPCR profil oluşturma çalışmaları sancısı artırır, ancak bu gerekli7,9denetimleridir.
Alternatif yöntemler gDNA kirlenme ile ilgili intergenic bölgeler veya faiz10gen ve büyük bir intron kanattan veya bir exon exon junction, Yani span astar kullanımı bir intron tavlama astar çiftleri kullanımını içerir tavlama siteleri yok olgun mRNA sıra1,4. Ancak, birçok omurgalılar, bakteri, protista, mantar, bitki ve omurgasız metazoan türler tüm genler için intron/exon ek açıklamalar henüz denir. Buna ek olarak, birçok ökaryotik organizmaların psödogenler çoğaltma olaylardan elde var. Ayrıca, astar tasarım intron genelinde sigara-amplifikasyon gDNA garanti etmez. Kromatin olarak erişilebilirliğini Dnaz genomik bölgelere göre değişir, farklı astar çiftleri farklı kromozomlar10hedefleme tasarlamak için önerilir.
Ökaryotik organizmaların genleri ribozomal alt ribozomlara oluşumu için gerekli kodlama rDNA genler kopyalarını bin kadar kapsayacak. Bu rDNA genler kez tek veya tandem tekrar dizi11‘ düzenlenir. Büyük alt birim (LSU) ve küçük alt birim (SSU) dahil olmak üzere Polycistronic rRNA’lar (şekil 1) RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ben (RNA pol ben). Elde edilen ön rRNA’lar iki iç kopya etmek spacer bölgeleri ITS1 ve ITS2 ortadan kaldırarak daha fazla işlenir. Son ürünler üç olgun rRNA’lar, 17-18 rRNA (SSU), 5.8S ve 25-28S rRNA (LSU) vardır oluşturulan12. rDNA genler tipik son derece korunmuş serileri ile multigene bir aile temsilcileri bulunmaktadır. Onlar genom bir yüksek frekans ile oluşur ve birden fazla kromozom konumu13, potansiyel olarak mevcut. RRNA işlenmesi ve kopya etmek boşluk ekleyiciler bozulması çekirdekçik hızlı bir süreçtir. Repetitiveness yüksek derecede nedeniyle, genomik kopya numarası ve algılanabilir işlenmemiş RNA premolecules oranı olduğunu daha düşük düşük-kopya intron dizileri ve unspliced öncüleri ile karşılaştırıldığında. Bu özellikler rDNA genler de gDNA kirlenme çoğu prokaryot ve Ökaryotlar3güvenilir ve son derece hassas tespiti için uygun olun.
Burada RNA örnekleri içinde gDNA kirlenme tespit için yeni bir yordam açıklanır. Evrensel astar korunmuş rDNA sıralamasına dayanan bir dizi gDNA deneyleri birkaç buğdaygiller türler için sunulur. Özgüllük ve önerilen astar evrenselliğini DNA şablon olarak kullanıp eritebilir eğrisi analizi tarafından test edildi. Bizim iletişim kuralı yalnızca buğdaygiller için geçerli değildir, ama diğer prokaryotik ve ökaryotik türler için de kolayca adapte.
Kantitatif PCR ile gen ifade analiz son yıllarda yaygın olarak uygulanmıştır. Bu hızlı, uygun maliyetli ve otomatik yöntemi ana parası onun hassas ve doğru bir sonucudur. Ancak, en iyi yarar–dan bu avantajlar kazanıyor qPCR deneme için kullanılan parametrelerinin net bir anlayış gerektirir. QPCR gen ifade analizde güvenilir bir sonuç almak için astar-dimer veya gDNA kirlenme RNA örnek3,15dakika sonra doğar nonspesifik amplifikasyon önlemek gereklidir. Bu RNA transkript düzeyleri gDNA kirlenme8altında fazla hesaplamış bekleniyor. Burada, bir rDNA geni ve benzersiz özellikleri olarak kabul RNA örnekte gDNA kirlenme tahlil için.
Bu protokol için kullanılan rDNA temel özellikleri: Ribozomal genler oluşur iki Itss, yani ITS1 ve ITS2 ve üç rRNA kodlama genler, 17-18, 5.8S ve 25-28S alt birim12. İki Its bölgeleri ribozomal alt birimleri kodlama dizisi parçası değildir. Bunlar rRNA olgun habercisi işlemek için en az üç enzimatik faaliyetleri tarafından kaldırılır: bir endonükleaz, helikaz ve eksonükleaz aktivitesi. Ribozomal RNA polycistronic transkript sentezlenir Itss içeren bir birincil ürün kesinlikle mevcut olduğu. İşleme çok hızlıdır ve çekirdekçik yer alır ve qPCR yöntemi algılama sınırın altına Its içeren tespit habercisi moleküller miktarıdır. Genişletilmiş ITS1 ya da ITS2 zaman Its tarafından astar kanat, gDNA kirlenme belirtilmedikçe bu nedenle, hiçbir amplifikasyon RNA örnekleri tespit edilebilir. Ökaryotlarda genom rDNA genler sayısını tek veya tandem dizileri kromozomlar11tarihinde düzenlenen kadar bir bin kopya eklemek için tahmin edilmiştir. Bu protokol için biz her tepki/tahlil kullanılır gDNA kirlenme tespit etmek için alternatif bir yol, NRT, yerine öneriyoruz.
Faydaları ve sınırlamaları ile ilgili mevcut yöntemler: NRT genellikle temiz veya kontamine gDNA tarafından hazırlanan RNA örnek olup olmadığını sınamak için kullanılır. Beri gDNA kirlenme farklı RNA örnekleri arasında eşit şekilde dağıtılır değil ve gDNA karşı tepki hassasiyetini önemli ölçüde analiz genler tarafından etkilenir, NRT denetimleri her örnek/tahlil çift7,15için gereklidir. Bu önemli ölçüde maliyet ekler ve birçok işlerken emek aynı anda3,9örnekleri. Literatürde belgelenen diğer alternatif yöntemler intron belirli astar gDNA tespiti için veya bir intron kanattan veya bir exon exon junction span tasarımı astar kullanımını içerir. Bu yöntemler sınırlamaları intron sırası bilgi, intron/exon yapısı tamamlanmamış ek açıklama ve intron genlerdeki yokluğu veya faiz1,4,10 psödogenler kullanılamamasıdır kök . Evrim nedeniyle, multigene ve son derece korunmuş gen aileler rDNA genler mevcut. Bunlar son derece genom bol miktarda ve farklı kromozom13üzerinde present. Diğer kodlama veya nonconding genler için karşılaştırıldığında, rDNA genler gDNA kirlilik tespiti için en uygun göster. Karşılaştırmalı transcriptomic analizleri cDNA farklılıkları gibi bazı sorunlar için qPCR veri rRNA Kalibratör tarafından normalleştirme tavsiye edilmez hazırlık (polyA astar rasgele hexamer astar vs), bereket rRNA ve mRNA arasında büyük farklılıklar , ve yanıltıcı oluşturabilir farklı Biyogenez sonuçları10,16. Ancak, biz sadece belirttiğim sorunlar gDNA kirlenme tahlil için bir avantaj var. Örneğin, daha yüksek hedefleme sitesi bereket ile ilgili genom ve farklı kromozomlar üstünde localization, rDNA dayalı astar gDNA mevcut yöntemleri ile karşılaştırıldığında algılama hassasiyeti önemli ölçüde artırır.
Versality rDNA tabanlı diğer organizma için: rDNA genler çoğu canlılar arasında tanımlanan bir iyi okudu gen aile vardır. Önerilen yöntem rDNA dayalı diğer prokaryotik ve ökaryotik organizmalar için (protokol 2 – 5) kolayca adapte olabilir gDNA kirlenme deneyleri için basit, son derece hassas ve ekonomik sistemini temsil eder. Bir vaka çalışması olarak, burada bazı Poceae türler (şekil 4 ve şekil 5) Bu yöntemde yarar göstermiştir. Kullanılan astar Aktarılabilirliği rDNA alt türler arasında son derece korunmuş yapısı nedeniyle diğer Poceae türler için yüksek bir oranı gösteriyor. Yeterli genomik sırası bilgi için astar tasarım kullanılabilir olmadığında bu sorunu daha da önemli hale gelir. Böylece, bir tür için tasarlanmış Its kanat astar akraba türler içinde kullanılabilir. Ayrıca, 5.8S-F/R astar aldı çoğu çiçekli bitkiler14‘ te yüksek benzerliği gösterir korunmuş bir motif dayalı. Her ne kadar yüksek işlem hacmi sıralama teknikleri kalıcı olarak bilinen genleri sayısını artırmak, exon-intron ek açıklama çoğu organizmalar tamamlanmamıştır ve çok kez astar bir exon exon sınır yayılan tasarım olanağı yoktur. Bizim yöntem açıklar nasıl rDNA dayalı astar pahalı NRT denetimleri her tahlil/astar birlikte ortadan kaldırmak amacı ile prokaryot ve Ökaryotlar qPCR analizde gDNA kirlenme tahlil için uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma genetik ve tarımsal biyoteknoloji Enstitüsü of Tabarestan (GABIT), Sari Tarım Bilimleri ve doğal kaynakların Üniversitesi (SANRU) tarafından desteklenmiştir. Junior araştırma grubu abiyotik stres genomik IZN (kırpma bitki araştırmaları, Halle (Saale), Almanya için disiplinler arası merkezi. tarafından finanse edildi Biz Rhonda Meyer el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |