조직을 생성 하는 매우 유망한 기술 없이 문화 셀 시뮬레이션된 microgravity 조건에는 매트릭스를 사용 하 여 구성 합니다. 로타리 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 난소 여 포 성장과 oocyte 성숙 여 포 생존, 형태학, 성장, 및 시뮬레이션된 microgravity 조건 oocyte 기능을 검사 합니다.
14 일 된 마우스 난소 조직과 같은 세 쥐에서 분리 된 preantral 낭 시뮬레이션된 microgravity 문화 시스템에 인 큐베이 팅 했다. 우리는 양적 뿌리 생존, 측정 된 여 포와 oocyte 지름으로 평가 하 고 시스템에서 생산 oocytes의 열 대권 외 시험. 우리 줄된 뿌리 생존을 관찰, 확산의 표현의 downregulation 세포 핵 항 원 및 성장 감 별 법 요인 9, granulosa 셀의 oocytes, 개발에 대 한 지표로 각각, 그리고 oocyte ultrastructural 시뮬레이션된 microgravity 조건 이상입니다. 시뮬레이션된 microgravity 실험 설치 개발 시험관에 oocyte/뿌리에에서 관련 된 메커니즘의 조사에 대 한 모델을 제공 하기 위해 최적화 해야 합니다.
생체 외에서 난소 여 포 개발과 oocyte 성숙 달성 하 고 접시, 그리고 3 차원 (3D) 매트릭스, alginate와 하이드로 겔1 등의 표면에와 같은 2 차원 문화에 대 한 전통적인 방법을 사용 하 여 2,3. 3D 문화 시스템 효과적으로 낭 조직 같은 구조에서 유지4 낭 vivo에서로 비슷한 유전자 표현 프로 파일을 유지 하 고 생산 meiotically 유능한 oocytes5,6. 3D 문화 시스템 또한 매트릭스 없는 상태에서 설치 될 수 있다, 매달려 펜션과 롤링 용기를 드롭 하는 예를 들어. 국가 항 공학 및 공간 행정 (NASA)에 의해 개발 된 회전 벽 선박 (RWV) 선박7안으로 경작 하는 셀에 대 한 시뮬레이션된 microgravity (s-μg)을 생성 합니다. 이 시뮬레이션된 microgravity 상태 대류에 대 한 침의 부족 때문에 세포 증식 및 분화에 대 한 독특한 문화 시스템을 제공 합니다. 그것은 보였다 그 시뮬레이션된 microgravity 승진 내 피 혈관 내 피 세포8,9, 갑 상선 세포10, 그리고 지방이 많은 파생 된에서 chondrogenesis에서 조립 하는 갑 상선 조직에서 형성 RWV 장치11에서 중간 엽 줄기 세포. 그러나, 다른 연구 시뮬레이션된 microgravity 위 암 세포에 있는 apoptosis를 유도 하 고 B lymphoblasts12,,1314의 효과 제안 세포질 상해에 microgravity 시뮬레이션 셀 형식에 따라 다릅니다 수 있습니다. 시뮬레이션된 microgravity 방해 스핀 들 조직에 보고 된 또한 ultrastructural 수준에서 변화를 일으킬 수와 유도 세포질 blebbing oocytes15에. 최적화 된 시뮬레이션된 microgravity 조건 및 시스템 아래 조직 공학 또는 세포 손상 유발 하는 메커니즘 추가 조사가 필요 합니다. 난소 낭/oocytes RWV 장치를 사용 하 여 성장의 생체 외에서 실험 oocyte 유전자 표현과 oocyte 세포의 ultrastructures에 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 연구에서는 난소 조직 preantral 낭과 격리 된 preantral 모 낭을 포함 하는 시뮬레이션된 microgravity의 효과 조사 하 사용 되었다여 포 개발 및 oocyte 성숙에.
이 연구에서 난소 조직 preantral 낭과 격리 된 preantral 모 낭을 포함 하 여 포 개발 및 oocyte 성숙에 시뮬레이션된 microgravity의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 우리의 연구는 RWV 시뮬레이션된 microgravity 장치, 5% CO2 배양 기 안에 가로 축 중심 회전 효율적인 산소와 매우 낮은 전단 응력 시뮬레이션된 microgravity 상태를 제공합니다. 우리 각각 granulosa 셀의 oocytes, 개발에 대 한 지표로 (GDF-9)에 증식 세포 핵 항 원 (PCNA) 및 성장 감 별 법 요인 9 유전자의 식을 분석. 우리가 시연 PCNA와 GDF-9 식이 억제 되었다 granulosa 셀에 oocytes, 각각, RWV 장치에서 경작 하는 경우 그리고 우리 μ s에서 경작 하는 낭에 oocyte microvilli zona pellucida에서의 철수를 보였다 g 상태, GDF-9-결핍 마우스 낭16에서 비슷 했다.
Preantral 낭의 성공적인 경작을 위한 중요 한 단계는: 1) 제대로 설명 했다 선택 기준에 따라 preantral 낭 프로토콜 텍스트 2.1에서 선택); 2) preforming 회의적인 상태에서 모든 절차 및 유지 메 마른 문화; 그리고 3) 올바르게 RWV 문화 시스템 설정.
유사 하거나 동일한 재료를 사용 하는 복제 실험에서 실험 관찰의 일관성의 보호입니다. 마우스 preantral 낭의 선택에 대 한 기준을 공개는 낭 1 했다) 얇은 zona pellucida; 둘러싸여 germinal 기 고장 (GVBD) 단계에서 건강 한 oocytes 기저 막에 의해 둘러싸인 granulosa 셀의 2) 2-3 층 그리고 3) 일부 thecal 세포 기저 막에 연결 된. 따라서, 낭 선정 했다 뿐만 아니라 모든 oocyte 성장 뿐만 아니라 90-100 µ m의 직경을 가진 유사한 형태학 식별을 지원 하기 위한 난소 여 포의 3 기능 구획.
이것은 3D 시뮬레이션된 microgravity에서 경작 방식에서 마우스 preantral 모 낭 성장에 첫 번째 시도 이다. 여러 문화 시스템 마우스 preantral 낭에 대 한 개발 되었습니다. 배양 접시, 소위 2D 문화의 평평한 표면에 뿌리에서 얻은 oocytes 수정 된 수 하 고 라이브 자손을 생산. 또한, alginate 구슬, 여 포의 문화 같은 3D 문화 유지 조직 구조 시체 높은 비율 meiotically 유능한 oocytes에서 생산 비슷합니다. 그러나, 난소 낭/oocytes 제로 중력 분야에서의 개발 과정 불명 하다. RWV, 조직 공학에 상당한 관심을 모으고 있는 장치 시뮬레이션된 microgravity 환경을 생성할 수 있고 난소 여 포/oocytes 성장에 microgravity 시뮬레이션된의 효과 조사를 위한 이상적인 환경을 제공합니다 생체 외에서.
그것은 세포 배양 RWV 장치를 제대로 설정 해야 합니다. 혈관에 공기 방울을 제거 되어야 합니다. 공기 방울을 제거 하는 방법은 선박, 생성 하는 경우는 다음과 같습니다: 두 개의 주사기 포트의 각 오일의 0.5 mL와 함께 두 개의 주사기를 배치. 주사기 포트를 제어 하는 밸브를 엽니다. 공기 방울이 주사기 포트 아래 책략. 다른 주사기 포트를 통해 미디어의 대략 동일한 볼륨을 주입 하는 동안 주사기로 거품을 당겨. 모든 거품은 제거 후 밸브를 닫고, 주사기, 제거 하 고 주사기 포트 뚜껑 교체. 그것은 또한 중요 한 세포는 일정 한 회전을 통해 정착 하지 못하도록 정확한 회전 속도를. 회전 속도의 최적화는 셀, 액체 밀도 및 점성의 특정 무게에 의해 결정 됩니다.
GDF-9-결핍 마우스 낭16에서 그들과 유사 했다, PCNA와 GDF-9의 식을 프로필 공개 그 시뮬레이션된 microgravity granulosa 셀과 oocytes의 개발에 대 한 해로운 효과 했다. 효율적인 산소와가 될 가능성이 매우 낮은 전단 스트레스를 제공 하는 뒤에 막에 걸쳐 산소와 이산화탄소의 투과 대 한 허용 5% CO2 인큐베이터 안에 수평 축 주위를 돌 다 RWV 장치의 배는 여 포/oocyte 부상의 원인입니다. 최적화 실험 설치 및 추가 분석의 해로운 효과의 메커니즘을 조사 하기 위해 필요 합니다.
더 연구는 생체 외에서 oocytes RWV 문화 시스템에서 파생 된의 발달 잠재력을 조사 필요 합니다. 체 외에서 성숙 MII 단계로 oocytes의 현재 되 고 수행 됩니다. 이 문화 시스템의 최종 유효성 검사 검색된 oocytes의 수정 용량에 의해 시험 될 것 이다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Yilong 왕 및 동물 유지에 있는 그들의 도움에 대 한 Yanlin Zhao, 조직학 샘플을 준비 하 고 있는 그녀의 원조에 대 한 찬 장 및 박사 Songtao 그가 비판적으로이 원고를 읽고에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 자연 과학 재단의 강성에 의해 지원 되었다 (허가 번호: LY13C120002).
ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
Alginate | Sigma | W201502 | |
alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |