En mycket lovande teknik för att generera vävnad konstruktioner utan använder matrix är att odla celler i en simulerad mikrogravitation skick. Använder ett roterande kultur granskat vi äggblåsa tillväxt och oocytmognaden i form av follikeln överlevnad, morfologi, tillväxt och äggcell funktion under simulerade mikrogravitation förutsättning.
14 dagar gamla mus äggstocksvävnad och preantral folliklar isolerade från samma ålder möss inkuberades i en simulerad mikrogravitation kultur system. Vi kvantitativt bedömde follikeln överlevnad, uppmätta follikeln och äggcell diametrar och undersökte ultrastruktur av oocyterna produceras från systemet. Vi observerat minskad follikeln överlevnad, nedreglering av uttryck av frodas cell nukleär antigen och differentiering tillväxtfaktor 9, som indikatorer för utvecklingen av granulosa celler och oocyter, respektive, och äggcell ultrastrukturella avvikelser under simulerade mikrogravitation förutsättning. Den simulerade mikrogravitation experimentella setup måste optimeras för att ge en modell för utredning av mekanismerna som är involverade i äggcellen/follikeln in vitro- utvecklingen.
In vitro äggblåsa utveckling och oocytmognaden har uppnåtts med traditionella metoder för 2-dimensionella kultur, som på ytan av petriskålar och tre dimensionell (3D) matris, såsom alginat och hydrogel1 ,2,3. Ett 3D kultur system effektivt underhålls folliklar i en vävnad-liknande struktur och höll de liknande gen uttryck profilerna som i vivo4 folliklar, och producerade meiotically behöriga oocyter5,6. 3D kultur system kan också fastställas i en matrix-fri skick, exempelvis hängande släpp fjädring och rullande fartyg. Roterande vägg fartyget (virtuell) utvecklats av National Aeronautics and Space Administration (NASA) genererar en simulerad mikrogravitation (s-µg) för de celler som odlade inuti fartyget7. Detta simulerade mikrogravitation tillstånd ger en unik kultur system för cellproliferation och differentiering avsaknaden av sedimentering för konvektion. Det har visats att simulerade mikrogravitation främjas bildandet av endothelial blodkärl från endotelceller8,9, sköldkörtelvävnad montering från sköldkörtel cellerna10och kondrogenes från adipose-derived mesenkymala stamceller i virtuell enheter11. Andra studier har dock visat att simulerade mikrogravitation inducerad apoptos i magsäckens celler och B lymfoblaster12,13,14, vilket tyder på effekter av simulerade tyngdlöshet på cellulär skada kan vara cell typberoende. Simulerade tyngdlöshet kan också orsaka förändringar på ultrastrukturella nivå, som rapporterats i störda spindeln organisationen och inducerad cytoplasmiska blebbing i oocyter15. Optimerad simulerade mikrogravitation villkor och mekanismer som inducerar tissue engineering eller cellulära skador enligt systemet kräver ytterligare utredning. In vitro experiment av växande cystor folliklar/oocyter använder virtuell enheter kan ge värdefull information om äggcell genuttryck och ultrastructures av äggcell organeller. I denna studie användes äggstocksvävnad innehållande preantral folliklar och isolerade preantral folliklar att undersöka effekterna av simulerade mikrogravitationpå follikeln utveckling och oocyt mognad.
I denna studie användes äggstocksvävnad innehållande preantral folliklar och isolerade preantral folliklar att undersöka effekterna av simulerade tyngdlöshet på follikeln utveckling och oocyt mognad. I vår studie, en virtuell, tillhandahåller en simulerad mikrogravitation enhet, snurrar runt en horisontell axel inuti en 5% CO2 inkubator, en simulerad mikrogravitation skick med effektiv syresättning och mycket låg skjuvspänning. Vi analyserade genuttryck av prolifererande cell nukleära antigen (PCNA) och differentiering tillväxtfaktor 9 (GDF-9) som indikatorer för utvecklingen av granulosa celler och oocyter, respektive. Vi visat att PCNA och GDF-9 uttryck dämpades i granulosa celler och oocyter, respektive när odlade i virtuell enhet, och vi visade ett tillbakadragande av äggcell Mikrovilli från zona pellucida i hårsäckarna odlade under de s-µ g villkorar, som liknade i GDF-9-brist mus folliklar16.
De kritiska steg för lyckad odling av preantral folliklar är: 1) att korrekt välja preantral hårsäckarna enligt urvalskriterier som beskrevs i protokollet Text 2.1); (2) Förformning alla procedurer i en skeptisk skick och underhålla en steril kultur; och 3) korrekt ställa in virtuell kultur systemet.
Skyddet av konsekvens av experimentella observationer i replikera experiment är att använda liknande eller identiska material. Kriterierna för urval av mus preantral folliklar visade att hårsäckarna hade 1) friska oocyter i skede germinal vesikler uppdelning (GVBD) omges av en tunn zona pellucida; (2) 2-3 lager av granulosa celler omges av en basal membran; och 3) vissa thecal celler bifogas med basala membranet. Således, hårsäckarna valt hade inte bara alla tre funktionella fack i en äggblåsa för att stödja äggcellen tillväxt, men också en liknande morfologisk identifiering med en diameter på 90-100 µm.
Detta är det första försöket att växa mus preantral folliklar på samma sätt som 3D odling under den simulerade mikrogravitation. Flera kultur-system har utvecklats för mus preantral folliklar. Oocyter som erhållits från follikeln odlade på en plan yta av petriskålar, den så kallade 2D kulturen, kunde befruktas och producerat levande avkomma. Dessutom upprätthålla 3D kulturer, till exempel kulturer av folliklar i alginat pärlor, en vävnad struktur liknar vad kroppen producerar i hög andel meiotically behöriga oocyter. Utvecklingsprocessen av äggstockscancer folliklar/oocyter i ett nollgravitation fält är dock okänd. Virtuell, en anordning som väcker stor uppmärksamhet i vävnadsteknik, kan generera en simulerad mikrogravitation miljö och erbjuder en idealisk miljö för att undersöka effekterna av simulerade tyngdlöshet på ovarian follicle/oocyter tillväxten in vitro.
Det är viktigt att ställa in virtuell apparaten ordentligt för cellodling. Luftbubblor i kärlet måste tas bort. Metoden för att avlägsna luftbubblor, om genereras i fartyget, är följande: Placera två sprutor med 0,5 mL olja i varje av de två spruta hamnarna. Öppna de ventiler som styr spruta hamnarna. Manövrera luftbubblor under sprutporten. Dra bubblor i sprutan och injicera ungefär samma volym av media via andra sprutporten. Efter alla bubblor tas bort, stänga ventilerna, ta bort sprutor och ersätta sprutan port mössor. Det är också avgörande för att ta reda på rätt rotationshastighet, som hindrar celler från att lösa via en ständig rotation. Optimering av rotationshastighet bestäms av den specifika vikten av cellerna, fluid densitet och viskositet.
Uttrycket profiler av PCNA och GDF-9, som var liknande dem i GDF-9-brist mus folliklar16, avslöjade det simulerade mikrogravitation hade negativa effekter på utvecklingen av granulosa celler och oocyter. Fartyget av virtuell enheten snurrade runt en horisontell axel inuti en 5% CO2 inkubator, möjliggör genomträngning av syre och koldioxid över ett membran i ryggen, som ger effektiv syresättning och mycket låg skjuvspänning, som var osannolikt att de orsak till follikeln/äggcellen skada. Optimering av experiment och ytterligare analyser behövs för att undersöka mekanismen av de skadliga effekterna.
Ytterligare studier behövs för att undersöka utvecklingspotentialen av in vitro- oocyterna härrör från virtuell kultur systemet. In vitro mognad av oocyter till MII skede genomförs för närvarande. Slutliga valideringen av detta kultur-system kommer att granskas av Hämtad oocyterna befruktning kapacitet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Yilong Wang och Yanlin Zhao för deras hjälp att upprätthålla djuren, Chan Zhang för hennes hjälp med att förbereda de histologiska proverna och Dr Songtao He för att kritiskt läsa detta manuskript. Detta arbete stöds av naturvetenskap Foundation av Zhejiangprovinsen (bevilja nummer: LY13C120002).
ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
Alginate | Sigma | W201502 | |
alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |