Et meget lovende teknik til at generere væv konstruktioner uden brug af matrix er kultur celler i en simuleret vægtløshed tilstand. Ved hjælp af en roterende kultur system, undersøgte vi ovariefollikel vækst og oocyt modning follikel overlevelse, morfologi, vækst og oocyt funktion under simulerede vægtløshed tilstand.
14 dage gamle mus æggestokkene væv og preantral follikler isoleret fra samme-alderen mus blev inkuberet i en simuleret vægtløshed kultur system. Vi kvantitativt vurderet follikel overlevelse, målte hårsækken og oocyt diametre, og undersøgt ultrastruktur af oocytter produceret fra systemet. Vi observeret nedsat follikel overlevelse, downregulation af udtryk for prolifererende celle nukleare antigen og differentiering vækstfaktor 9, som indikatorer for udviklingen af granulosa-celler og oocyter, henholdsvis, og oocyt ultrastrukturelle abnormaliteter på betingelse af simulerede vægtløshed. Simuleret vægtløshed eksperimentelle installationsprogrammet skal være optimeret til at give en model for undersøgelse af de mekanismer, der er involveret i oocyt/follikel in vitro- udvikling.
In vitro ovariefollikel udvikling og oocyt modning har opnået ved hjælp af traditionelle metoder for 2-dimensionelle kultur, som på overfladen af petriskåle, og tre-dimensionelle (3D) matrix, f.eks. natriumalginat og hydrogel1 ,2,3. En 3D kultur system effektivt vedligeholdes follikler i et væv-lignende struktur og holdt de lignende gen expression profiler som i vivo4 follikler, og produceret meiotically kompetente oocyter5,6. 3D kultur systemer kan også fastsættes i en matrix-fri tilstand, eksempelvis hængende drop suspension og rullende fartøjer. Den roterende væg fartøj (RWV) udviklet af National Aeronautics and Space Administration (NASA) genererer en simuleret vægtløshed (s-µg) for cellerne kulturperler inde fartøj7. Dette simulerede vægtløshed tilstand giver en unik kultur system til celleproliferation og differentiering på grund af manglen på bundfældning for konvektion. Det har vist sig at simuleret vægtløshed forfremmet endotel fartoej formation i endothelial celler8,9, thyreoideavæv montage fra skjoldbruskkirtlen celler10, og chondrogenesis fra fedt-afledt mesenkymale stamceller i RWV enheder11. Andre undersøgelser har dog vist, at simuleret vægtløshed induceret apoptose i mavens celler og B Lymfoblaster12,13,14, hvilket tyder på effekter af simuleret vægtløshed på cellular personskader kan være celle type-afhængig. Simuleret vægtløshed kan også forårsage ændringer på ultrastrukturelle niveau, som rapporteret i den forstyrrede spindel organisation og induceret cytoplasmatisk blebbing i oocyter15. Optimeret simulerede vægtløshed forhold og mekanismer, der inducerer tissue engineering eller cellulære skader under systemet kræver yderligere undersøgelse. In vitro- eksperimenter med voksende æggestokkene follikler/oocyter ved hjælp af RWV enheder kan give værdifulde oplysninger om oocyt gen udtryk og ultrastructures af oocyt organeller. I denne undersøgelse, æggestokkene væv indeholdende preantral follikler og isolerede preantral follikler blev brugt til at undersøge virkningerne af simulerede vægtløshedpå follikel udvikling og oocyt modning.
I denne undersøgelse, æggestokkene væv indeholdende preantral follikler og isolerede preantral follikler blev brugt til at undersøge virkningerne af simulerede vægtløshed på follikel udvikling og oocyt modning. I vores undersøgelse, RWV, giver en simuleret vægtløshed enhed, spin omkring en vandret akse inde i en 5% CO2 inkubator, en simuleret vægtløshed tilstand med effektiv iltning og meget lav shear stress. Vi analyseret gen udtryk for prolifererende celle nukleare antigen (PCNA) og differentiering vækstfaktor 9 (GDF-9) som indikatorer for udviklingen af granulosa-celler og oocyter, henholdsvis. Vi viste, at PCNA og GDF-9 udtryk blev undertrykt i granulosa celler og oocyter, henholdsvis, når kulturperler i RWV enheden, og vi viste tilbagetrækning af oocyt microvilli fra zona pellucida i follikler kulturperler under s-µ g betingelse, som var lig den i GDF-9-mangelfuld mus follikler16.
Kritiske trin til vellykket dyrkning af preantral follikler er: 1) korrekt at vælge de preantral follikler ifølge de udvælgelseskriterier, der blev beskrevet i protokollens tekst 2.1); 2) du udfører alle procedurer i et skeptisk tilstand og opretholde et sterilt kultur; og 3) korrekt opsætning af RWV kultur-systemet.
Sikring af konsekvens af eksperimentelle observationer i Repliker eksperimenter er at bruge lignende eller identiske materialer. Kriterier for udvælgelse af mus preantral follikler afslørede, at follikler havde 1) sund oocyter på stadiet germinale vesikel opdeling (GVBD) omgivet af en tynd zona pellucida; 2) 2-3 lag af granulosa-celler omsluttet af en basal membran; og 3) nogle thecal celler knyttet til den basale membran. Follikler valgt havde således ikke kun alle tre funktionelle rum af en ovariefollikel til støtte for oocyt vækst, men også en lignende morfologiske identifikation med en diameter på 90-100 µm.
Dette er det første forsøg at vokse mus preantral follikler på samme måde som 3D dyrkning under den simulerede vægtløshed. Flere kultur systemer er udviklet til mus preantral follikler. Oocytter fra hårsækken kulturperler på en flad overflade på petriskåle, den såkaldte 2D kultur, kunne blive befrugtet og produceret levende afkom. Derudover opretholde 3D kulturer, såsom kulturer af follikler i calciumalginat perler, en væv struktur ligner hvad kroppen producerer i høj procentdel meiotically kompetente oocyter. Udviklingsprocessen af æggestokkene follikler/oocyter i en nul-tyngdekraft felt er dog ukendt. RWV, en enhed, som tiltrækker stor opmærksomhed i vævsmanipulering, kan generere en simuleret vægtløshed miljø og skabe et ideelt miljø for at undersøge virkningerne af simulerede vægtløshed på ovarie follicle/oocyter vækst i vitro.
Det er vigtigt at indstille RWV apparatet korrekt for cellekultur. Luftbobler i fartøjet skal fjernes. Metode til at fjerne luftbobler, hvis genereret i fartøjet, er som følger: Placer to sprøjter med 0,5 mL af olie i hver af de to sprøjte porte. Åbne ventiler kontrollere sprøjte havne. Manøvrere luftbobler under sprøjte port. Træk boblerne ind i sprøjten mens indsprøjte ca den samme mængde af medier via andre sprøjte porten. Efter alle bobler er fjernet, lukker ventilerne, fjerne sprøjter og erstatte sprøjten port caps. Det er også afgørende at finde ud af den korrekte rotationshastighed, som forhindrer celler i afregning via en konstant rotation. Optimering af hastigheden bestemmes af egenvægten af cellerne, den væske tæthed og viskositet.
Udtrykket profiler af PCNA og GDF-9, der svarer til dem i GDF-9-mangelfuld mus follikler16, afslørede, at simuleret vægtløshed havde skadelige virkninger på udviklingen af granulosa-celler og oocyter. Fartøj af enhedens RWV spundet omkring en vandret akse inde i en 5% CO2 inkubator, giver mulighed for gennemtrængning af ilt og kuldioxid på tværs af en membran i ryggen, giver effektiv iltning og meget lav shear stress, som var usandsynligt, at være den årsag til skade, follikel/oocyt. Optimering af eksperimentel opsætning og yderligere undersøgelser er nødvendige for at efterforske mekanismen af de skadelige virkninger.
Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge den udviklingsmæssige potentiale af in vitro- oocyter udvundet fra RWV kultur system. I øjeblikket er gennemføres in vitro modning af oocytter til MII fase. Den endelige validering af denne kultur system vil blive undersøgt af befrugtning kapacitet af de hentede oocyter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Yilong Wang og Yanlin Zhao for deres assistance opretholde dyrene, Chan Zhang for hendes hjælp i de histologiske prøver og Dr. Songtao He til kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation i Zhejiang provinsen (giver nummer: LY13C120002).
ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
Alginate | Sigma | W201502 | |
alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |