एक उच्च आशाजनक तकनीक ऊतक का उपयोग कर के बिना निर्माण मैट्रिक्स एक नकली microgravity हालत में संस्कृति कोशिकाओं के लिए है । एक रोटरी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करना, हम कूप अस्तित्व, आकृति विज्ञान, विकास, और नकली microgravity हालत के तहत oocyte समारोह के संदर्भ में डिंबग्रंथि कूप विकास और oocyte परिपक्वता की जांच की ।
14 दिन पुराने माउस डिम्बग्रंथि ऊतक और preantral एक ही आयु वर्ग के चूहों से अलग रोम एक नकली microgravity संस्कृति प्रणाली में मशीन थे । हम मात्रात्मक कूप अस्तित्व का मूल्यांकन, कूप और oocyte व्यास मापा, और प्रणाली से उत्पादित अंडाणुओं के ultrastructure की जांच की । हमने देखा कम कूप अस्तित्व, proliferating सेल परमाणु प्रतिजन और विकास भेदभाव कारक 9 के भाव के downregulation, granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं के विकास के लिए संकेतक के रूप में क्रमशः, और oocyte ultrastructural नकली microgravity हालत के तहत विषमता । नकली microgravity प्रयोगात्मक सेटअप को oocyte में शामिल तंत्र की जांच के लिए एक मॉडल प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए/ इन विट्रो विकास में ।
इन विट्रो डिम्बग्रंथि कूप विकास और oocyte परिपक्वता के लिए पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया गया है 2-आयामी संस्कृति, जैसे पेट्री व्यंजन की सतह पर, और तीन आयामी (3d) मैट्रिक्स, जैसे alginate और hydrogel1 ,2,3. एक 3 डी संस्कृति प्रणाली को प्रभावी ढंग से एक ऊतक की तरह संरचना में रोम बनाए रखा और vivo4 रोम मेंके रूप में इसी तरह के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल रखे, और उत्पादित meiotically सक्षम अंडाणुओं5,6। 3 डी संस्कृति प्रणालियों भी एक मैट्रिक्स मुक्त हालत में स्थापित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फांसी ड्रॉप निलंबन और रोलिंग जहाजों । घूर्णन दीवार पोत (RWV) नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन (नासा) द्वारा विकसित की कोशिकाओं के लिए एक नकली microgravity (एस µजी) उत्पंन एक पोत7अंदर संस्कृति । इस नकली microgravity हालत संवहन के लिए अवसादन की कमी की वजह से सेल प्रसार और भेदभाव के लिए एक अद्वितीय संस्कृति प्रणाली प्रदान करता है । यह दिखाया गया है कि नकली microgravity endothelial कोशिकाओं से endothelial पोत गठन पदोंनत8,9, थायराइड कोशिकाओं से कोडांतरण ऊतक10, और वसा से chondrogenesis-व्युत्पंन mesenchymal RWV उपकरणों में स्टेम सेल11। हालांकि, अंय अध्ययनों से पता चला है कि नकली microgravity प्रेरित apoptosis गैस्ट्रिक कोशिकाओं में और बी lymphoblasts12,13,14, सेलुलर चोट पर नकली microgravity के प्रभाव का सुझाव कक्ष प्रकार-निर्भर हो सकता है । नकली microgravity भी ultrastructural स्तर पर परिवर्तन का कारण बन सकता है, के रूप में परेशान धुरी संगठन में रिपोर्ट और अंडाणुओं में प्रेरित cytoplasmic blebbing15। अनुकूलित नकली microgravity स्थितियों और तंत्र है कि ऊतक इंजीनियरिंग या सेलुलर चोटों के लिए प्रेरित प्रणाली के तहत आगे की जांच की आवश्यकता है । इन विट्रो में RWV उपकरणों का उपयोग कर डिम्बग्रंथि कूप बढ़ते अंडाणुओं के प्रयोगों oocyte जीन भाव और oocyte organelles के ultrastructures पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं । इस अध्ययन में, preantral कूप और पृथक preantral कूप युक्त डिम्बग्रंथि ऊतककूप विकास और oocyte परिपक्वता पर नकली microgravity के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
इस अध्ययन में, preantral कूप और पृथक preantral कूप युक्त डिम्बग्रंथि ऊतक कूप विकास और oocyte परिपक्वता पर नकली microgravity के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया । हमारे अध्ययन में, RWV, एक नकली microgravity डिवाइस, एक 5% CO2 मशीन के अंदर एक क्षैतिज अक्ष के आसपास spins, कुशल ऑक्सीजन और बहुत कम कतरनी तनाव के साथ एक नकली microgravity हालत प्रदान करते हैं । हम क्रमशः granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं के विकास के लिए संकेतक के रूप में proliferating सेल नाभिकीय प्रतिजन (PCNA) और वृद्धि विभेद कारक 9 (GDF-9) के जीन अभिव्यक्तियों का विश्लेषण किया । हमने यह प्रदर्शित किया कि PCNA और GDF-9 के भाव granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं में क्रमशः दबा दिए गए, जब RWV डिवाइस में कल्चर्ड हो गया, और हमने oocyte microvilli के रोम-zona के नीचे के प्रसंस्कृतों में से एक से pellucida µ की वापसी दिखाई जी हालत, जो कि GDF-9 की कमी माउस के रोम16में समान था ।
preantral रोम के सफल संवर्धन के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सही ढंग से चयन मापदंड है कि प्रोटोकॉल पाठ २.१ में वर्णित के अनुसार preantral कूप का चयन); 2) एक शक्की हालत में सभी प्रक्रियाओं के अनुरूप है और एक बाँझ संस्कृति को बनाए रखने; और 3) सही ढंग से RWV संस्कृति प्रणाली की स्थापना ।
दोहराने के प्रयोगों में प्रयोगात्मक टिप्पणियों की निरंतरता की सुरक्षा के समान या समान सामग्री का उपयोग करने के लिए है. माउस preantral कूप के चयन के लिए मानदंड से पता चला है कि रोम 1 था) कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD) एक पतली zona pellucida से घिरा मंच पर स्वस्थ अंडाणुओं; 2) granulosa कोशिकाओं की 2-3 परतों एक बेसल झिल्ली से घिरा; और 3) कुछ thecal कोशिकाओं बेसल झिल्ली से जुड़ी । इस प्रकार, कूप का चयन न केवल oocyte विकास का समर्थन करने के लिए एक डिम्बग्रंथि कूप के सभी तीन कार्यात्मक डिब्बों था, लेकिन यह भी ९०-१०० µm के व्यास के साथ एक समान रूपात्मक पहचान ।
यह अनुकरणीय microgravity के तहत 3 डी संवर्धन के तरीके से माउस preantral कूप बढ़ने का पहला प्रयास है । कई संस्कृति प्रणालियों माउस preantral रोम के लिए विकसित किया गया है । अंडाणुओं पेट्री व्यंजन, तथाकथित 2 डी संस्कृति के एक फ्लैट की सतह पर प्रसंस्कृत कूप से प्राप्त की और निषेचित हो सकता है जी वंश का उत्पादन किया । इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों, alginate मोतियों में रोम की संस्कृतियों के रूप में, एक ऊतक संरचना क्या शरीर उच्च प्रतिशत meiotically सक्षम अंडाणुओं में उत्पादन के समान बनाए रखने के । हालांकि, एक शूंय-गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र में डिम्बग्रंथि कूप/अंडाणुओं के विकास की प्रक्रिया अज्ञात है । RWV, एक उपकरण है जो ऊतक इंजीनियरिंग में पर्याप्त ध्यान आकर्षित कर रहा है, एक नकली microgravity वातावरण उत्पन्न और डिम्बग्रंथि कूप पर नकली microgravity के प्रभाव की जांच के लिए एक आदर्श वातावरण प्रदान कर सकते हैं/अंडाणुओं वृद्धि इन विट्रो में।
यह सेल संस्कृति के लिए ठीक से RWV तंत्र स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । पोत में हवा के बुलबुले को दूर करना होगा । विधि हवा बुलबुले को हटाने के लिए, यदि पोत में उत्पंन, इस प्रकार है: दो सिरिंज बंदरगाहों में से प्रत्येक में तेल की ०.५ मिलीलीटर के साथ दो सीरिंज प्लेस । सिरिंज बंदरगाहों को नियंत्रित करने के वाल्व खोलो । सिरिंज बंदरगाह के नीचे हवाई बुलबुले पैंतरेबाज़ी । सिरिंज में बुलबुले खींचो जबकि अन्य सिरिंज बंदरगाह के माध्यम से मीडिया के लगभग एक ही मात्रा इंजेक्शन. के बाद सभी बुलबुले हटा रहे हैं, बंद वाल्व, सिरिंजों को हटाने, और सिरिंज बंदरगाह टोपियां की जगह. यह भी बाहर सही रोटेशन की गति है, जो एक निरंतर रोटेशन के माध्यम से बसने से कोशिकाओं को रोकता है खोजने के लिए महत्वपूर्ण है । रोटेशन की गति का अनुकूलन कोशिकाओं के विशिष्ट वजन, द्रव घनत्व, और चिपचिपापन द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
PCNA और GDF की अभिव्यक्ति प्रोफाइल-9, जो GDF में उन लोगों के समान थे-9 की कमी माउस के रोम16, पता चला है कि नकली microgravity granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं के विकास पर हानिकारक प्रभाव था । RWV डिवाइस के पोत एक 5% CO2 मशीन के अंदर एक क्षैतिज अक्ष के आसपास घूमती है, पीठ में एक झिल्ली भर में ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के permeation के लिए अनुमति, कुशल ऑक्सीजन और बहुत कम कतरनी तनाव है, जो होने की संभावना नहीं थी प्रदान कूप/oocyte चोट के कारण । प्रायोगिक सेटअप के अनुकूलन और आगे विश्लेषण के लिए हानिकारक प्रभाव के तंत्र की जांच की जरूरत है ।
आगे के अध्ययनों की जरूरत है की विकासात्मक क्षमता की जांच के लिए इन विट्रो अंडाणुओं से व्युत्पंन RWV संस्कृति प्रणाली है । इन विट्रो में अंडाणुओं की मिि चरण के लिए परिपक्वता वर्तमान में किया जा रहा है । इस संस्कृति प्रणाली की अंतिम मान्यता प्राप्त अंडाणुओं की निषेचन क्षमता की जांच की जाएगी.
The authors have nothing to disclose.
लेखक Yilong वांग और Yanlin Zhao पशुओं को बनाए रखने में उनकी सहायता के लिए, चान झांग ऊतकीय नमूने तैयार करने में उसकी सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और डॉ Songtao वह गंभीर रूप से इस पांडुलिपि पढ़ने के लिए । इस काम को झेजियांग प्रांत के नेचुरल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर: LY13C120002) ने सपोर्ट किया था ।
ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
Alginate | Sigma | W201502 | |
alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |