En lovende teknikk for å generere vev lager uten hjelp av matrise er kultur celler i en simulert mikrogravitasjon tilstand. Bruker en roterende kultur, undersøkte vi ovarian follikkelen vekst og oocyte modning i hårsekken overlevelse, morfologi, vekst og oocyte funksjonen under forutsetning av simulert mikrogravitasjon.
14 dager gamle musen ovarian vev og preantral follikler isolert fra samme-alderen mus var ruges i et simulert mikrogravitasjon kultur-systemet. Vi kvantitativt vurdert hårsekken overlevelse, målt hårsekken og oocyte diameter og undersøkt ultrastructure av oocytes produsert fra systemet. Vi observert redusert hårsekken overlevelse, downregulation av uttrykk for voksende celle kjernefysiske antigen og differensiering vekstfaktor 9, som indikatorer for utviklingen av granulosa celler og oocytes, henholdsvis, og oocyte ultrastructural abnormiteter under forutsetning av simulert mikrogravitasjon. Simulert mikrogravitasjon eksperimentelle oppsett må være optimalisert for å gi en modell for undersøkelse av mekanismer involvert i oocyte/hårsekken i vitro utviklingen.
In vitro ovarian follikkelen utvikling og oocyte modning er oppnådd bruke tradisjonelle metoder for 2-dimensjonal kultur, som på overflaten av petri retter, og tre-dimensjonale (3D) matrix, som alginate og hydrogel1 ,2,3. En 3D kultur-systemet effektivt opprettholdes follikler i en vev-lignende struktur holdt lignende genet uttrykket profiler i vivo4 hårsekker og produsert meiotically kompetent oocytes5,6. 3D kultur systemer kan også opprettes i en matrix-fri tilstand, for eksempel hengende slippe suspensjon og rullende fartøy. Det roterende veggen fartøyet (RWV) utviklet av National Aeronautics and Space Administration (NASA) genererer en simulert mikrogravitasjon (s-µg) for cellene kultivert innsiden av fartøyet7. Denne simulerte mikrogravitasjon tilstand gir en unik kultur-systemet for celle spredning og differensiering på grunn av sedimentering for konveksjon. Det har vist at simulert mikrogravitasjon forfremmet endothelial fartøyet formasjon endotelceller8,9, skjoldbrusk vev montering fra thyroid cellene10og chondrogenesis fra liggende under adipose-avledet Mesenchymal stamceller i RWV enheter11. Men har andre studier vist at simulert mikrogravitasjon indusert apoptose i mage celler og B lymphoblasts12,13,14, tyder effekten av simulert mikrogravitasjon på cellular skade kan være celle Typeavhengige. Simulert mikrogravitasjon kan også forårsake endringer på ultrastructural nivå, som rapportert i forstyrret spindel organisasjonen og indusert cytoplasmatiske blebbing i oocytes15. Optimalisert simulert mikrogravitasjon betingelsene og mekanismer som induserer tissue engineering eller cellular skader under system krever videre etterforskning. In vitro eksperimenter av voksende ovarian follikler/oocytes med RWV enheter kan gi verdifull informasjon om oocyte genet uttrykk og ultrastructures av oocyte organeller. I denne studien ovarian vev som inneholder preantral follicles og isolerte preantral follikler ble brukt til å undersøke virkningene av simulert mikrogravitasjonpå hårsekken utvikling og oocyte modning.
I denne studien ovarian vev som inneholder preantral follicles og isolerte preantral follikler ble brukt til å undersøke virkningene av simulert mikrogravitasjon på hårsekken utvikling og oocyte modning. I vår studie, RWV, gir en simulert mikrogravitasjon enhet, spinner rundt en vannrett akse innenfor en 5% CO2 incubator, en simulert mikrogravitasjon tilstand med effektiv oksygenering og svært lav skjæring stress. Vi analyserte genet uttrykk for voksende celle kjernefysiske antigen (PCNA) og differensiering vekstfaktor 9 (GDF-9) som indikatorer for utviklingen av granulosa celler og oocytes, henholdsvis. Vi viste at PCNA og GDF-9 ble undertrykket i granulosa celler og oocytes, henholdsvis når kultivert RWV enheten, og vi viste tilbaketrekning av oocyte microvilli fra zona pellucida i hårsekkene kultivert under s-µ g tilstand, som var lik som i GDF-9-mangelfull musen follikler16.
Kritisk fremgangsmåten for vellykket dyrking av preantral follikler er: 1) velge riktig preantral follikler ifølge utvalgskriteriene som ble beskrevet i protokollen tekst 2.1); 2) preforming alle prosedyrer i en skeptisk tilstand og opprettholde en steril kultur; og 3) riktig å sette opp RWV kultur-systemet.
Ivaretakelse av konsistensen av eksperimentelle observasjoner i Repliker eksperimenter er å bruke lignende eller identiske materialer. Kriteriene for valg av mus preantral follikler viste at hårsekkene hadde 1) sunn oocytes på germinal vesicle nedbryting (GVBD) scenen omgitt av en tynn zona pellucida; 2) 2-3 lag av granulosa celler omsluttet av en basal membran; og 3) noen thecal celler knyttet til basale membranen. Dermed follikler valgt hadde ikke bare alle tre funksjonelle rom med en ovarian follikkelen for å støtte oocyte vekst, men også en lignende morfologiske identifikasjon med en diameter på 90-100 µm.
Dette er første forsøk på å vokse musen preantral follikler på måten av 3D dyrking under den simulerte mikrogravitasjon. Flere kultur systemer har blitt utviklet for mus preantral follikler. Oocytes fra hårsekken kultivert på flate petri retter, den såkalte 2D kulturen, kan befruktes og produsert live avkom. Videre opprettholde 3D kulturer, som kulturer av hårsekkene i alginate perler, en vevet struktur lik hva kroppen produserer i høy andel meiotically kompetent oocytes. Men er utviklingsprosessen til eggstokkene follikler/oocytes i et null-gravitasjon ukjent. RWV, en enhet som tiltrekker betydelig oppmerksomhet i vev engineering, kan generere en simulert mikrogravitasjon miljø og gi et ideelt miljø for å undersøke effekten av simulert mikrogravitasjon på ovarian follikkelen/oocytes vekst i vitro.
Det er viktig å konfigurere RWV apparater for cellekultur. Luftbobler i fartøyet må fjernes. Metoden å fjerne luftbobler, hvis generert i fartøyet, er som følger: plassere to sprøyter med 0,5 mL olje i hver av de to sprøyte portene. Åpne ventiler kontrollere sprøyte portene. Manøvrere luftbobler under sprøytepumpe porten. Dra bobler i sprøyten mens injisering omtrent samme volum av media gjennom andre sprøytepumpe porten. Etter alle bobler er fjernet, lukker ventilene, fjerne sprøyter og erstatte sprøytepumpe porten caps. Det er også viktig å finne ut riktig rotasjonshastigheten, som hindrer cellene seg via en konstant rotasjon. Optimalisering av rotasjonshastigheten bestemmes av egenvekt av cellene, flytende tetthet og viskositeten.
Uttrykket profiler av PCNA og GDF-9, som var lik de i GDF-9-mangelfull musen follikler16, avslørte at simulert mikrogravitasjon hadde skadevirkninger på utviklingen av granulosa celler og oocytes. Fartøyet av RWV enheten spunnet rundt en vannrett akse innenfor en 5% CO2 inkubator, slik at gjennomtrengning av oksygen og karbondioksid over en membran i ryggen, gir effektiv oksygenering og svært lav skjæring stress, som var sannsynligvis ikke det årsaken til hårsekken/oocyte skade. Optimalisering av eksperimentelle oppsett og videre analyser for å undersøke mekanismen av de skadelige virkningene.
Videre studier er nødvendig for å undersøke den utviklingsmessige potensialet av i vitro oocytes avledet fra RWV kultur-systemet. In vitro modning av oocytes MII scenen er for tiden blir utført. Siste valideringen av denne kultur-systemet vil bli undersøkt av befruktning kapasitet Hentet oocytes.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Yilong Wang og Yanlin Zhao for deres hjelp i å opprettholde dyrene, Chan Zhang for henne hjelp forberede histologiske prøvene og Dr. Songtao He for kritisk lesing dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation av Zhejiang-provinsen (gi nummer: LY13C120002).
ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
Alginate | Sigma | W201502 | |
alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |