इस प्रोटोकॉल छवि निवासी ट्यूमर के लिए एक विधि का वर्णन-सीडी टी मानव फेफड़े के ट्यूमर स्लाइस के भीतर फ्लोरोसेंट युग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल कोशिकाओं घुसपैठ । इस तकनीक सीडी टी सेल प्रवास के वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति देता है फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग ।
सीडी टी सेल कैंसर के खिलाफ लड़ाई में प्रमुख खिलाड़ी हैं । सीडी टी कोशिकाओं के लिए आदेश में ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए वे ट्यूमर में प्रवेश करने की जरूरत है, ट्यूमर microenvironment के भीतर प्रवास और ट्यूमर एंटीजन के लिए पर्याप्त रूप से प्रतिक्रिया. इस तरह के 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में बेहतर इमेजिंग दृष्टिकोण, के हाल के विकास, और शक्तिशाली माउस ट्यूमर मॉडल के उपयोग के कुछ तंत्र है कि विरोधी ट्यूमर टी सेल गतिविधियों को विनियमित पर प्रकाश डाला है । जबकि ऐसी प्रणालियों मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है, वे हमेशा मानव प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी नहीं है । मानव में, क्षेत्र में हमारे ज्ञान मुख्य रूप से मानव रोगियों से फिक्स्ड ट्यूमर के नमूनों का वर्णन से आता है, साथ ही इन विट्रो अध्ययन में । हालांकि, इन विट्रो मॉडल जटिल तीन आयामी ट्यूमर वातावरण कमी है और इसलिए, vivo टी सेल गतिविधियों में के अपूर्ण सन्निकटन हैं । ताजा स्लाइस explanted ऊतक से बने एक जटिल बहु-सेलुलर ट्यूमर वातावरण है कि सह के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी के रूप में कार्य कर सकते हैं-संस्कृतिपूर्ण अध्ययन और पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं । मूलतः murine लिम्फ नोड्स में1 सेट और पहले एक जौव अनुच्छेद2में वर्णित है, इस दृष्टिकोण अब मानव ट्यूमर के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है दोनों की गतिशीलता की जांच के लिए3 के रूप में अच्छी तरह से निवासी टी कोशिकाओं4मढ़वाया ।
यहां, मानव फेफड़ों ट्यूमर स्लाइस की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल, निवासी सीडी टी और ट्यूमर कोशिकाओं के immunostaining, और सीडी टी लिम्फोसाइटों के ट्यूमर microenvironment के भीतर फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की ट्रैकिंग का वर्णन किया गया है । इस प्रणाली को विशिष्ट उपंयास immunotherapy ट्यूमर में टी सेल प्रवास एहसान एजेंटों के लिए स्क्रीन के लिए रखा है ।
सीडी टी कोशिकाओं को कैंसर के खिलाफ लड़ाई में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । हालांकि, कई दमन तंत्र घातक कोशिकाओं की हत्या से टी लिम्फोसाइटों को रोकने के । पिछले वर्षों में, कई होनहार रणनीति है कि टी कोशिकाओं पर ब्रेक जारी किया गया है और विकसित क्लिनिक में5। दो दृष्टिकोण है कि काफी ध्यान रखने प्रतिरक्षा चौकी-विरोधी पीडी-1 और दत्तक टी सेल चिकित्सा के रूप में एंटीबॉडी लक्ष्यीकरण, कर रहे हैं । फिर भी, हाल ही में सफलता के बावजूद, इन उपचारों से6रोगियों का केवल एक सबसेट लाभ । एक प्रमुख चुनौती कैंसर immunotherapy को प्रतिरोध के तंत्र की पहचान के क्रम में और अधिक कुशल उपचार विकसित करने के लिए है । एक और चुनौती के लिए मॉडल प्रणाली है जिसमें उपंयास चिकित्सा विशेषता और उनकी शक्ति और सुरक्षा के लिए परीक्षण किया जा सकता है विकसित करना है । अब तक, इन परख के अधिकांश इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों कि खराब ट्यूमर ऊतक की जटिलता नकल पर आधारित हैं ।
पूर्व vivo ऊतक स्लाइसें एक होनहार तकनीक है, के रूप में यह मूल ऊतक microenvironment7संरक्षित करता है । इन वर्षों में, हम विभिंन ऊतकों में टी लिम्फोसाइटों की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस दृष्टिकोण की स्थापना की है । हमारे परिणाम से संकेत मिलता है कि फ्लोरोसेंट लेबल टी कोशिकाओं murine लिम्फ नोड के ऊपर जोड़ा स्लाइस ऊतक में विस्थापित और उनके उचित microenvironmental cues1,2का जवाब । इसी तरह, टी लिम्फोसाइटों मानव फेफड़े ट्यूमर स्लाइस पर मढ़ा तेजी से ट्यूमर में भर्ती कर रहे है स्ट्रोमा3। इस तकनीक का प्रयोग, हम वितरण और मानव ट्यूमर के भीतर टी कोशिकाओं के प्रवासन3,4को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण तत्व के रूप में extracellular मैट्रिक्स की पहचान की है । क्योंकि पूर्व vivo का व्यवहार शुद्ध और मढ़वाया टी कोशिकाओं जरूरी निवासी intratumoral टी लिम्फोसाइटों के व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं करता है, हम हाल ही में इस दृष्टिकोण4परिष्कृत किया है ।
यहां हम ताजा मानव फेफड़ों के ट्यूमर से बने स्लाइस के भीतर निवासी टी लिम्फोसाइटों ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । अलग कदम मानव फेफड़े के ट्यूमर स्लाइस की तैयारी से मिलकर बनता है (agarose embedding और एंबेडेड ऊतक के vibratome अनुभाग सहित), ताजा ट्यूमर स्लाइस में फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ अंतर्जात टी कोशिकाओं के दाग, और की निगरानी एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इन कोशिकाओं ।
एक सीधा, त्वरित, और मजबूत तकनीक मानव फेफड़े के ट्यूमर के स्लाइस और निवासी सीडी टी कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार का आकलन एक संरक्षित ट्यूमर एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वातावरण में पैदा करने के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल murine लिम्फ नोड पर मढ़वाया टी कोशिकाओं की निगरानी का वर्णन करता है कि पिछले जौव लेख के एक शोधन है2स्लाइस ।
फ्लोरोसेंट रंजक के ब्लीचिंग विशेष रूप से fluorescein isothiocyanate और phycoerythrin जैसे पहली पीढ़ी के रंगों के साथ विचार किया जाना चाहिए । हमने पाया है कि सीधे-युग्मित एंटीबॉडी के एक स्पष्ट photobleaching एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ हुई । इसके विपरीत, न्यूनतम photobleaching फोकल माइक्रोस्कोप के साथ देखा गया था, विशेष रूप से हाल ही में विकसित चमकदार फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग.
एंटीबॉडी अपेक्षाकृत बड़े अणुओं रहे हैं और इसलिए ऊतक में उनकी पैठ मुश्किल हो सकता है । इस कदम से सुधार किया जा सकता है मशीन समय वृद्धि । इसके अलावा, इस तरह के सीधे-एंटीबॉडी के साथ मिलकर फैब टुकड़े एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में एक छोटे दाग रिएजेंट का उपयोग करें ।
सभी एंटीबॉडी इस प्रोटोकॉल में वर्णित पहले से मांय किया गया है और उज्ज्वल धुंधला4उत्पादन के लिए जाना जाता है । इसलिए, isotype नियंत्रणों की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, अगर इस अंय एंटीबॉडी का उपयोग कर विधि में संशोधन वांछित हैं, तो isotype नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है ।
यह प्रायोगिक प्रणाली कुछ सीमाएं प्रस्तुत करती है । काटने की प्रक्रिया ऊतक, जो विशेष रूप से कटौती की सतह के पास सीडी टी कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है नुकसान होगा । इसके अलावा, घुलनशील कारकों की एक संख्या (जैसे chemokines) टी कोशिकाओं के प्रवास को नियंत्रित करने में सहायक खो दिया जा सकता है । इन समस्याओं को बायपास करने के लिए एक तरह से ऊतक के संभवतः स्वस्थ क्षेत्रों में सतह से माइक्रोन के कई दसियों पर स्थित टी कोशिकाओं की निगरानी कर रहा है. प्रकाशित प्रयोगों से पता चलता है कि ऊतकों के भीतर गहरे स्थानीयकृत टी कोशिकाओं को और अधिक सक्रिय रूप से कट सतह के पास स्थानीयकृत टी कोशिकाओं की तुलना में माइग्रेट4. हम अपने अध्ययन के लिए फोकल सूक्ष्मदर्शी का इस्तेमाल किया है, लेकिन यह संभावना है कि दो फोटॉन माइक्रोस्कोप गहराई में स्थानिक संकल्प में वृद्धि होगी ।
यह दृष्टिकोण तटस्थ अणुओं नहीं कर रहे हैं कि फ्लोरोसेंट युग्मित एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करता है. पूर्ण आकार के एंटीबॉडी विभिंन तरीकों से टी कोशिकाओं के सामांय कामकाज को प्रभावित करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । सबसे पहले, विरोधी सीडी एंटीबॉडी एक intracellular संकेतन झरना लिम्फोसाइट के cytoskeleton को प्रभावित करने में सक्षम ट्रिगर द्वारा टी सेल प्रवास को बदल सकते हैं । दूसरा, विरोधी सीडी एंटीबॉडी सीडी और MHC वर्ग मैं अणुओं, प्रतिजन मांयता प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम के बीच बातचीत मिलाना कर सकते हैं । तीसरा, बरकरार एंटीबॉडी एफसी कई माइलॉयड ट्यूमर में वितरित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त रिसेप्टर्स को बांध और इसलिए गैर विशिष्ट संकेत बढ़ाने के लिए अतिसंवेदनशील कर सकते हैं । हम कोई संकेत नहीं है कि इस तरह के एक समस्या हमारे डेटा को प्रभावित किया है, शायद क्योंकि निवासी माइलॉयड कोशिकाओं के एफसी रिसेप्टर्स हैं, संस्कृति में कोशिकाओं के विपरीत, ट्यूमर वातावरण के भीतर मौजूद इम्युनोग्लोबुलिन के साथ संतृप्त । दरअसल, लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान सीरम के अलावा, एक मुक्त एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए जाना जाता प्रक्रिया, bliss-धुंधला नहीं बदल गया । फिर भी, एंटीबॉडी के फैब टुकड़े, एफसी क्षेत्र से रहित, साथ ही एंटीबॉडी उनके एफसी क्षेत्र और camelid में रूपांतरित-व्युत्पंन एंटीबॉडी टुकड़े8 अंय वैकल्पिक रणनीतियों फ्लोरोसेंट अनुरेखकों के साथ निवासी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए प्रतिनिधित्व करते हैं ।
पिछले दशकों में, कई मॉडल सिस्टम विकसित किया गया है और टी लिम्फोसाइटों के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया । इन इन विट्रो में शामिल टी कोशिकाओं को पहले से शुद्ध और प्रतिजन के साथ संस्कृति-पेश कोशिकाओं की तैयारी । इस तरह की तैयारी प्रतिजन मांयता और जवाबदेही के तंत्र को परिभाषित करने में उल्लेखनीय प्रगति की अनुमति दी है । हालांकि, वे ऊतक पर्यावरण की जटिलता की कमी है । अंय की तैयारी की है कि और अधिक बारीकी से एक देशी ऊतक की संरचना की नकल स्थापित किया गया है । उदाहरण के लिए, तीन आयामी कोलेजन जेल मैट्रिक्स जिसमें शुद्ध टी कोशिकाओं को एंबेड किया गया है, साथ ही साथ समेकित ऊतक टुकड़े की संस्कृति के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ टी लिम्फोसाइटों के गतिशील व्यवहार की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है9 . इन प्रणालियों के मूल ऊतक के करीब एक वास्तुकला का लाभ मौजूद है, लेकिन वे अंय महत्वपूर्ण सेलुलर और घुलनशील कारकों की कमी है । माउस में, दो फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी एक बरकरार अंग के सही मायने में शारीरिक वातावरण में टी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए कार्यरत किया गया है10. हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण को स्थापित करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल है । इसके अलावा, माउस मॉडल मानव शरीर क्रिया विज्ञान के साथ उल्लेखनीय अंतर दिखाते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक एक जटिल बहु सेलुलर ट्यूमर वातावरण है कि विशिष्ट को सह संस्कृति अध्ययन और पशु मॉडल के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी के रूप में कार्य तैनात है का प्रतिनिधित्व करता है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी सीडी टी लिम्फोसाइटों के लिए जो एंटीबॉडी उत्पंन किया गया है की तुलना में अंय कोशिकाओं के गतिशीलता ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, तकनीक अंय मानव और murine ट्यूमर और ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम वास्तविक समय में छवि के लिए सक्षम किया गया है बी कोशिकाओं की गतिशीलता ताजा मानव tonsils में एक विरोधी CD19 एंटीबॉडी के साथ लेबल ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक चिकित्सकीय ऊतकों में टी सेल गतिशीलता को नियंत्रित करने के अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है । संस्कृति प्रणाली की पहुंच कुछ औषधीय रिएजेंटों को लागू करने के लिए परमिट और टी सेल माइग्रेशन पर उनके परिणामों का परीक्षण । अब यह स्वीकार किया जाता है कि बढ़ ट्यूमर में, सीडी टी कोशिकाओं एक कम प्रवास प्रदर्शन और ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कम संपर्क11. महत्वपूर्ण बात, ट्यूमर कोशिका क्षेत्रों में टी कोशिकाओं की दुर्लभ उपस्थिति एक बुरा परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है और टी सेल के लिए प्रतिरोध तंत्र में से एक माना जाता है कैंसर immunotherapy आधारित है । एकाधिक ट्यूमर में पलायन से टी कोशिकाओं को सीमित बाधाओं एक घने extracellular मैट्रिक्स सहित पहचान की गई है । इस संबंध में, टी सेल गतिशीलता और घातक कोशिकाओं के साथ बातचीत को बहाल करने में सक्षम अणुओं की पहचान कैंसर immunotherapy में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है । पिछले एक अध्ययन में, हमने पाया है कि collagenase के साथ कोलेजन का एक आंशिक गिरावट, तीव्रता से मानव फेफड़ों के स्लाइस करने के लिए लागू, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ टी कोशिकाओं के संपर्क में सुधार.
अंत में, कई दिनों तक के लिए संस्कृति में मानव ट्यूमर स्लाइस रखने के लिए संभावना7,12,13 टी कोशिकाओं और immunotherapy के कार्यकाल में होनहार आवेदनों की एक संख्या प्रदान करता है ।हालांकि, दीर्घकालिक संस्कृति के दौरान मॉडल प्रणाली की स्थिरता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जिसे पूरी तरह से मूल्यांकन करने की आवश्यकता है ।
ताजा और स्वस्थ ऊतक प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है सीडी कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं के अच्छे immunostaining के साथ गुणवत्ता के स्लाइस का उत्पादन, और stromal तत्वों । प्रसंस्करण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूमर बायोप्सी रखते हुए महत्वपूर्ण है ।
ठीक संदंश के साथ स्लाइस की हैंडलिंग इस प्रोटोकॉल के भीतर एक और महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है । यह बड़ी सावधानी के साथ किया जाना चाहिए के रूप में agarose आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है । agarose में एक कट स्टेनलेस स्टील एंटीबॉडी समाधान युक्त के रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप वॉशर द्वारा बनाई गई सील समझौता होगा ।
The authors have nothing to disclose.
हम सलाह और माइक्रोस्कोप के साथ सहायता के लिए कोचीन इमेजिंग सुविधा (Institut कोचीन, पेरिस) के पियरे Bourdoncle और थॉमस Guilbert शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । इस काम के हिस्से में फ्रेंच Ligue नेशनल contre le कैंसर से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, CARPEM (निजीकृत चिकित्सा के लिए कैंसर अनुसंधान) द्वारा, शौकीनों डी फ्रांस द्वारा और अनुदान के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा ô नो ६६७९८० (कैरेट) ।
Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |