Summary
Этот протокол описывает метод для изображения резидентов проникновения опухоли CD8 Т-клеток помечены дневно спаренных антител в легкое человека опухоли фрагменты. Этот метод позволяет в реальном времени анализ CD8 T клетки миграции с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
CD8 Т-клеток являются ключевыми игроками в борьбе против рака. Чтобы CD8 Т-клеток убить раковые клетки, они должны вступить в опухоль мигрируют в пределах микроокружения опухоли и адекватно реагировать на опухолевые антигены. Последние разработки усовершенствованных тепловизионных подходов, таких как 2-Фотон микроскопии и использование моделей мощных мыши опухоли пролили свет на некоторые из механизмов, которые регулируют деятельность противоопухолевый Т-клеток. Такие системы предоставляют ценную информацию, в то время как они не всегда прогнозирования реакции человека. В человека наши знания в области главным образом приходит от описания образцов фиксированной опухоль от человека пациентов, а также в vitro исследования. Однако в пробирке модели отсутствуют сложные трехмерные опухоли окружение и, таким образом, являются неполными аппроксимации в естественных условиях деятельность Т-клеток. Ломтики свежих, сделанные из ткани, описаны представляют сложные многоклеточные опухоли среды, которая может служить важным связующим звеном между совместно культивируемых исследований и животных моделей. Первоначально в мышиных лимфатических узлов1 и описано в статье JoVE2, этот подход теперь было перенесено в человека опухоли для изучения динамики покрытием3 , а также резидентов клетки T4.
Здесь описывается протокол для подготовки легкое человека опухоли фрагменты, иммуноокрашивания-резидентов CD8 T и опухолевых клеток и отслеживания CD8 Т-лимфоцитов в пределах микроокружения опухоли, с помощью конфокальной микроскопии. Эта система является уникальной размещены на экран для агентов Роман иммунотерапия пользу миграции Т-клеток в опухоли.
Introduction
CD8 T клетки играют ключевую роль в битве против рака. Однако многие подавляющих механизмы предотвращения Т-лимфоцитов от убийства злокачественных клеток. За последние годы разработаны и использованы в клинике5несколько перспективных стратегий, которые тормозов на Т-клетки. Эти два подхода, которые сохраняют значительное внимание являются иммунные контрольно-пропускной пункт ориентация антител, таких как анти PD-1 и приемных T клеточной терапии. Тем не менее несмотря на недавние успехи, только подмножество пациентов выгоду от этих терапии6. Одной из основных задач заключается в выявлении механизмов сопротивления Рак иммунотерапия с целью разработки более эффективных методов лечения. Еще одна задача заключается в разработке типовых систем в котором Роман терапии можно охарактеризовать и проверены на их эффективность и безопасность. До настоящего времени большинство этих анализов основаны на культуру в vitro клетки систем, которые плохо имитировать сложности опухолевой ткани.
Ex vivo кусочки ткани является перспективной техники, как он сохраняет оригинальные ткани микроокружения7. С годами мы создали этот подход для отслеживания динамики Т-лимфоцитов в различных тканях. Наши результаты показывают, что дневно обозначенных Т-клеток, добавил на вершине мышиных Лимфоузел ломтики мигрируют в ткани и реагировать на их соответствующие сигналы microenvironmental1,2. Аналогичным образом Т-лимфоциты, накладывается на легкое человека опухоли фрагменты быстро набираются в опухоли стромы3. Используя эту технику, мы определили внеклеточная матрица как важный элемент контроля распределения и миграции Т-клеток в опухоли человека3,4. Потому что поведение ex vivo очищенный и покрытием Т-клетки не обязательно отражает поведение резидентов внутриопухолевых Т-лимфоцитов, недавно мы уточнили этот подход4.
Здесь мы описываем протокол для отслеживания резидентов Т-лимфоцитов в пределах ломтиками, сделанные из свежих легкое человека опухоли. Различные этапы состоят из подготовки легкое человека опухоли фрагменты (включая агарозы встраивание и vibratome секционирование встроенных ткани), окрашивание эндогенного Т-клеток с флуоресцентных антител в ломтики свежих опухоли и контроля за Эти клетки с конфокального микроскопа.
Protocol
Человека опухоли были получены с согласия Французской этического Комитета и помощи Publique-больничный де Пари (AP-HP) в приложение со статьей L.1121-1 французского закона. Письменное информированное согласие было получено от пациентов до включения в исследование.
1. получение опухоли легких человека
- Получение образцов опухоли свежие легких у пациентов с стадии-III немелкоклеточного рака легкого, которые прошли полный хирургическая резекция опухоли легких4.
- Транспорт-Исправлена свежие опухоли в 15 мл конические тубы ледяной Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI 1640) среднего. Отложите на льду за 30 мин до шага 2.7.
Примечание: При получении опухоли в послеобеденное время, разместите их на 4 ° C на ночь и процесс следующий день. В этом случае дополнение RPMI 1640 СМИ с 5% плода бычьим сывороточным (ФБС).
2. агарозы встраивание и vibratome нарезка опухолей человека легких
Примечание: Выполните все шаги до 2,10 в стерильных условиях.
- Готовят раствор 5% агарозы для встраивания, растворяя 1 g легкоплавких точки агарозы в 20 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS) без кальция и магния. СВЧ это решение до тех пор, пока полностью не растворится агарозы. Разрешить агарозы для охлаждения при 37 ° C, поместив решение в инкубаторе при 37 ° C за 5 мин.
- В культуре ткани капюшоном Подготовьте полный носитель RPMI 1640 (без фенола красного), содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 4 мм L-глютамина и 1 x пенициллина и стрептомицина.
- Добавьте 1.1 мл полный RPMI 1640 среднего за хорошо плиты культуры клеток 6-Ну и место вставки культуры клеток 30 мм в каждой скважине. Отложите пластину в инкубаторе при 37 ° C за 30 мин до шага 2.12.
- Место стерилизованное плоские шайбы из нержавеющей стали (внутренний диаметр, наружным диаметром 10 мм и толщиной 1 мм, 5 мм) в 35-мм пластиковая блюдо, наполненный RPMI полного среднего. Шайба будет использоваться далее сосредоточиться антитела на vibratome вырезать фрагмент.
- Место биопсии опухоли в пластиковых блюдо 10 см и вырезать опухоль с острым лезвием на малый куб форму фрагменты примерно 5 x 5 мм длины.
- Возьмите агарозы из инкубатора и залейте раствор в 35-мм пластиковая блюдо.
- Используйте пару щипцов передать тщательно опухоли фрагменты тканей wipe удалить избыток среднего. Вставьте фрагменты в агарозы и расположите их в нижней части пластиковые тарелки. Оставьте агарозном геле на льду на 5 минут, чтобы затвердеть.
- Как только агарозы затвердевает, инвертировать пластиковые тарелки и лопаточкой освободить весь гель.
- Используйте острый нож обрезать излишки агарозы, окружающих опухоль фрагмент, оставляя 3-5 мм гель вокруг ткани.
- Подключите каждый блок агарозы на диск образец vibratome с каплей нетоксичные бутил Цианакрилатный клей ткани. Заполните vibratome буфер лоток с стерильных ледяной PBS и установить образец диск в лоток.
- Вырезать агарозы встроенный тканей толстыми ломтиками 350 мкм. Настройки vibratome со скоростью медленного диапазона (0,2-0,3 мм/сек) и частота вибрации в диапазоне средних (1,5 мм).
- С помощью тонкой щипцы, тщательно соберите кусочки опухоли, как они сокращаются и разместить их на культуры вставки ячейки 6-ну плиты (шаг 2.3). Передача 1 ломтик на каждой вставки. Используйте большую осторожность при обработке ломтиками, как они могут быть легко повреждены.
- Используйте тонкой щипцы для размещения шайб из нержавеющей стали на каждый отдельным дольке. Убедитесь, что шайбы хорошо позиционируется на агарозе, окружающие ткани опухоли.
- Сохранение культуры пластины при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные инкубатор для 10 min. приступить к иммуноокрашивания.
3. иммуноокрашивания-резидентов CD8 Т-клеток и клеток опухоли
- Разбавьте антитела (конечной концентрации 10 мкг/мл) и ядерных краситель (конечная концентрация 1 мкг/мл) в средствах массовой информации RPMI 1640 без фенола красного.
Примечание: Используйте дневно в сочетании анти CD8 (мышиных IgG, клонировать SK1) и анти EpCAM (эпителиальных клеток молекулы адгезии) (мышиных IgG АЭМ-125) антител к этикетке CD8 Т-лимфоцитов и опухоли эпителиальных клеток, соответственно. Использование антител дневно в сочетании анти CD90/Thy1 (мышиных IgG, клон 5E10) метка фибробластов и активированные эндотелиальных клеток. Использование 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для пометки ядро с нарушенной плазматической мембраны клеток для того чтобы оценить жизнеспособность тканей. - Снимите крышки культуры из инкубатора и использовать пипетку для аспирационная любой жидкости внутри шайб из нержавеющей стали. Не удаляйте 1.1 мл RPMI 1640 СМИ под вставки культуры клеток (шаг 2.3).
- Не касаясь срез и с помощью кончика пипетки, без 40 мкл раствора, содержащего антител на каждый кусочек опухоли.
- Инкубируйте пластины при 37 ° C на 15 минут, чтобы позволить Пятнать антитела.
- С тонкой щипцами снимите шайбы, вынимают фрагменты и провал их 10 s в RPMI 1640 СМИ без фенола красного. Обратно место ломтики на вставки культуры клеток и добавить каплю свободного фенола Красного RPMI 1640 средних на каждый отдельным дольке. Поддерживать пластины при 37 ° C на 10 мин приступить к визуализации.
4. обработки изображений и анализа резидентов T CD8 клетки миграции внутри опухоли фрагменты человеческих легких
Примечание: Конфокальный микроскоп, используемые в настоящем Протоколе является вертикально, спиннинг диск оснащен 25 x цель погружения воды (25 x / 0,95 н.а.).
- Подготовка установки микроскопа
- Установите температуру тепло-камеры микроскопа при 37 ° C за несколько часов до начала сессии изображений.
- Настройка системы постоянно perfuse опухоли фрагменты с кислородом (5% CO2, O 95%2) свободного фенола Красного RPMI среднего (рис. 1). Используйте Перистальтический насос поступать СМИ перфузии в тепловизионной камеры и аспирационная решение настой сбора отходов.
- Запустите Перистальтический насос, чтобы позволить кислородом решение пройти через трубы перфузии.
- Тонкой пинцетом вынимают фрагмент из 6-ну пластины и передачи его на 35-мм пластиковая блюдо заполнены с свободного фенола Красного RPMI среднего. Иммобилизации срез с 19,7 мм диаметр среза якорь с интервалом 2 мм-потоков. Место на Петри блюдо на стадии визуализации микроскопа. Соедините вход и выход советы перфузии системы. Включите систему перфузии и равным 0,8 мл/мин скорость потока средств массовой информации.
- Понизить целью погружения в воду на фрагмент. Фокус на вершине срез с яркими поле света.
Примечание: Здоровый ломтик содержит лишь меньшинство DAPI позитивных клеток в несколько микрон от поверхности среза.
- В зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала 3 флуорофоров задайте время экспозиции между 50 до 800 мс и интенсивности лазера от 20 до 40%.
- Выберите толщину стека z изображения в пределах кусочек опухоли.
Примечание: Здесь, 10-12 оптических плоскостях, охватывающих общую глубину 60-70 мкм в измерении z были захвачены в плен. - Выберите начальную позицию на приблизительно 10 мкм ниже первого надписью CD8 Т-клеток.
- Определить временной интервал между каждой z стек изображений между 10-30 s и общее время звучания от 10 до 30 мин.
- После импорта данных для отслеживания программного обеспечения, создайте места для каждой ячейки CD8 T в поле. Отрегулируйте диаметр клетки и порог обнаружения зависимости образа люминесцентные клеток.
- Проверьте треки и удалите любые не значения трек, удаляя их. Правильное треков, подключение и отключение различных треков и точек разное время же треков. Экспорт данных (трек скорость, длина пути перемещения) для программного обеспечения электронной таблицы.
Representative Results
Опухоли легких человека обычно сильно проникли в CD8 Т-клеток, которые преимущественно находятся в строме3,4. Следуя этой протокол следует ожидать для визуализации большое количество immunostained CD8 T в срезах опухоли легкое человека. Совместной маркировки с анти EpCAM и анти CD90 антитела должны позволяют разграничить опухоль островков и стромальных областях. Фибриллярного коллагена, обильные в опухоли стромы, могут быть визуализированы без экзогенного окрашивание с помощью второго поколения гармонических на двух Фотон Микроскоп3,4. Обратите внимание, что некоторые опухоли легких человека представляют нет четкого различия между островками опухоли и стромы. Такие опухоли должны быть отброшены, а также образец, представляя большие площади некроз клеток, выявленных неспецифической связывание антител и DAPI окрашивания. В соответствии с опубликованным результаты, полученные в человеческих легких и рака яичников, резидентов CD8 Т-клетки более сконцентрированы в стромы, по сравнению с опухоли островков4. Представитель пример распределения клеток CD8 T опухолевых клеток и CD90 показан на рисунке 2.
Срез assay позволяет для анализа подвижности-резидентов Т-клеток в опухоли в различных регионах. Полезные критерии для сравнения CD8 T клетки подвижности в различных регионах относятся средняя скорость (длина пути, деленную на продолжительность времени пробы) и длина перемещения (вектор в начале и конце трека). Хотя мало в опухоли островков, CD8 T клетки мигрируют более активно в этот отсек, по сравнению с стромы (рис. 3). В среднем средняя скорость отдельных CD8 Т-клетки должна быть близка к 4 мкм/мин в опухоли стромы с высокой внутри и между опухоли вариативности4. В опухоли стромы сократительной способности резидентов Т-клеток сильно зависит от плотности и ориентации внеклеточная матрица волокон3,4. Успешный эксперимент приведет к менее присутствует в районах плотной матрицы по сравнению с свободно матричные области, в соответствии с опубликованные результаты3,4Т-клеток.
Обратите внимание, что некоторые опухоли легких человека exhibit очень высокий уровень аутофлюоресценция, исключающие изображений-резидентов Т-клеток. Такая особенность быстро наблюдается в начале сессии изображений. Autofluorescent опухоли должны быть отброшены. Представитель пример резидентов CD8 Т-клеток в опухоли autofluorescent показан на рисунке 4.
Рисунок 1: фотографии системы перфузии. A) раствор фенола Красного бесплатно RPMI обогащается в 5% C02, 95% O2. B решение затем увлажненную перистальтического насоса. C) RPMI решение входит культуры блюдо через вход. На выходе решение придыханием насосом из камеры в контейнер для отходов. Обратите внимание, что кончик стремление устанавливается на уровне для определения высоты решение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: распределение резидентов CD8 T-клеток в опухоли легких человека. Представитель образ кусочек опухоли легких человека витражи для CD8 (зеленый), EpCAM (синий) и CD90 (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: моторику резидентов CD8 T-клеток в опухоли легких человека. Траекторий отдельных резидентов CD8 Т-клеток стромы (красный) и опухолевых клеток (синий) регионах ломтиком карцинома легких человека. Срез был окрашенных с указанных антител и образы для 20 мин с конфокального микроскопа. Фибриллово коллагена был обнаружен в конце с помощью гармонических второго поколения (SHG) на двух Фотон микроскопа. Треки цветом согласно CD8 T клетки перемещения длины. Этот образ был изменен с 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель изображение опухоли человека легких autofluorescent. Кусочек опухоли был окрашенных CD8 (зеленый) и EpCAM (синий). SHG сигнал — красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Описан простой, быстрый и надежный метод для генерации легкое человека опухоли фрагменты и оценки динамического поведения-резидентов CD8 Т-клеток в среде сохранились опухоли с помощью конфокального микроскопа. Этот протокол является уточнение предыдущей статьи JoVE, которая описывает мониторинг покрытием Т-клеток на мышиных Лимфоузел ломтики2.
Особенно с первого поколения краски флуоресцеин Изотиоцианаты и фикоэритрин должны рассматриваться отбеливания флуоресцентных красителей. Мы обнаружили, что произносится Фотообесцвечивание непосредственно сочетании антител произошло с микроскопом двух фотонов. И наоборот минимальный Фотообесцвечивание был замечен с конфокальные микроскопы, особенно с помощью ярких флуоресцентных красителей, разработали недавно.
Антитела являются относительно большие молекулы, и поэтому их проникновения в ткани может быть трудно. Этот шаг можно повысить, увеличив время инкубации. Кроме того использование меньшего пятнать реагентов как непосредственно-в сочетании Fab фрагментов антитела представляет хорошей альтернативой.
Все антитела, указанных в настоящем протоколе были ранее проверены и известно, производят яркие окраски4. Таким образом изотипа элементы управления не являются обязательными. Однако если изменения в этот метод, с помощью других антител, использование isotype антитела управления настоятельно рекомендуется.
Эта экспериментальная система представляет некоторые ограничения. Процедура резки будет повредить ткани, которая может повлиять на поведение CD8 Т-клеток, особенно вблизи поверхности среза. Кроме того количество растворимых факторов (например, chemokines) важную роль в регулировании миграции Т-клетки могут быть потеряны. Одним из способов обойти эти проблемы является мониторинг Т-клеток, расположенных в нескольких десятков мкм от поверхности в регионах предположительно здоровой ткани. Опубликованные эксперименты показывают, что Т-клетки, локализованные глубоко в ткани мигрируют более активно, чем локализовано вблизи вырезать поверхности4Т-клеток. Мы использовали конфокальные микроскопы для нашего исследования, но вполне вероятно, что два фотона Микроскопы увеличит пространственное разрешение в глубину.
Этот подход основывается на использовании дневно в сочетании антител, которые не являются нейтральными молекулами. Полноразмерная антитела подвержены повлиять на нормальное функционирование клеток T различными способами. Во-первых антитела анти CD8 может изменить миграции Т-клеток, вызывая внутриклеточной сигнализации Каскад, способных затронуть цитоскелета лимфоцитов. Во-вторых, анти CD8 антител может модулировать взаимодействие между CD8 и MHC I класса молекул, важным шагом в процессе распознавания антигена. В-третьих, нетронутыми антитела можно привязать к Fc рецепторов, выраженные многими миелоидных клеток, распределенных в опухоли и поэтому подвержены увеличить неспецифичный сигнал. У нас есть никаких признаков того, что такая проблема затрагивает наши данные, вероятно потому, что рецепторы Fc-резидент миелоидных клеток в отличие от клеток в культуре, насыщены иммуноглобулинов в обстановке опухоли. Действительно добавлением сыворотки в процедуре маркировки, процесс, известный блокировать бесплатно Fc рецепторов, не изменить, иммуно окрашивание. Тем не менее Fab фрагментов антител, лишенный ФК региона, а также антитела мутировали в их регионе ФК и животноводческие, полученных антител фрагменты8 представляют другие альтернативные стратегии для отслеживания резидентов клетки с трасеров флуоресцентной.
За последние десятилетия несколько типовых систем разработаны и используются для реального времени изображений Т-лимфоцитов. К ним относятся препараты в vitro T клетки предварительно очищенный и культивировали с антиген представляющих клеток. Такие препараты позволили значительный прогресс в определении механизмов антигены и отзывчивость. Однако им не хватает сложность среды ткани. Были созданы другие препараты, что более тесно имитировать структуру родной ткани. Для примеров трехмерные коллаген гель матрицы в которых очищенная Т-клетки были внедрены, и культуры ткани, реагрегироваться, фрагменты были использованы для мониторинга динамического поведения Т-лимфоцитов с флуоресцентных изображений технологий9 . Эти системы представляют преимущества архитектуры недалеко от родной ткани, но им не хватает других важных клеточных и растворимых факторов. В мышь два Фотон прижизненной микроскопии был нанят отслеживать Т-клеток в поистине физиологической среде нетронутыми орган10. Однако такой подход является технически трудно настроить. Кроме того мышь модели показывают заметные различия с человеческой физиологии.
Метод, описанный в настоящем Протоколе представляет сложных многоклеточных опухоли среды, которая имеет уникальную возможность служить важным связующим звеном между исследования совместно культуры и Животные модели.
Протокол, описанные здесь, также может использоваться для отслеживания подвижности других клеток, чем CD8 Т-лимфоцитов, для которых были созданы антител. Кроме того техника может быть адаптирована к другим человека и мышиных опухолей и тканей. Например мы смогли изображение в реальном времени динамику клеток B помечены с анти CD19 антитела в свежей человеческой миндалин.
Метод, описанный в настоящем Протоколе позволяет экран для терапевтических молекул контроль моторики Т-клеток в тканях. Доступность системы культуры позволяет применять некоторые фармакологические реагентов и проверить их последствий миграции Т-клеток. Он теперь признается, что в растущей опухоли, CD8 Т-клетки exhibit низкий миграции и сокращение контактов с опухолевых клеток11. Важно отметить, что скудные присутствие Т-клеток в опухоли ячейки регионов связан с плохой результат и считается одним из механизмов сопротивления на основе Т клеток рака иммунотерапия. Были выявлены несколько препятствий, ограничивающих Т-клетки мигрировать в опухоли включая плотной внеклеточного матрикса. В этой связи выявление молекулы способны восстановить подвижность Т-клеток и взаимодействие с злокачественных клеток представляет собой важный шаг в Рак иммунотерапия. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что их частичную деградацию коллагена с коллагеназы, остро применяется к фрагментам легкое человека, улучшает контакт Т-клеток с опухолевых клеток.
Наконец возможность держать человека опухоли фрагменты в культуре для до7,12,несколько дней13 предлагает ряд перспективных приложений в срок Т-клеток и иммунотерапии.Однако стабильность модель системы в долгосрочной перспективе культуры является важным параметром, который необходимо тщательно оценивать.
Получение свежей и здоровой ткани является решающим фактором для получения фрагментов качества с хорошим иммуноокрашивания CD8 клетки, клетки опухоли, и стромальных элементов. Сохраняя биопсия опухоли на 4 ° C до обработки имеет решающее значение.
Обработка срезов с тонкой щипцами представляет собой еще один важный шаг в рамках настоящего Протокола. Это следует выполнять с большой осторожностью, как агарозы могут быть легко повреждены. Вырезать в агарозном скомпрометирует печать, сделанное шайбы из нержавеющей стали, что приводит к утечке антитела, содержащие решения.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить Пьер Bourdoncle и Томас Гильбер Кочин Imaging фонда (Institut Кочин, Париж) для консультаций и помощи с микроскопы. Эта работа была поддержана в части субсидий от le национальной французской лиги против рака, CARPEM (рак исследований для персонализированной медицины), Фондасьон де Франс и программой Европейского союза Horizon 2020 исследований и инноваций Грант Соглашение No 667980 (карат).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
| Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
| Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
| BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
| FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
| BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |
References
- Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner. J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes. J Vis Exp. (53), e3054 (2011).
- Salmon, H., et al. Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors. J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).
- Bougherara, H., et al. Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration. Front Immunol. 6, 500 (2015).
- Mandal, R., Chan, T. A. Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy. Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).
- Wolchok, J. D., et al. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Rashidian, M., et al. Noninvasive imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Joyce, J. A., Fearon, D. T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science. 348 (6230), 74-80 (2015).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).
