Denne protokollen beskriver en metode for å bilde bosatt svulst-infiltrere CD8 T celler merket med fluorescently kombinert antistoffer i menneskelig lunge svulst skiver. Denne teknikken tillater sanntid analyser av CD8 T celle overføring ved hjelp av AC confocal mikroskopi.
CD8 T celle er sentrale aktører i kampen mot kreft. For at CD8 T celler å drepe kreftceller de må inngå svulsten, overføre i svulst microenvironment og svare tilstrekkelig på svulst antigener. Den siste utviklingen av forbedret tenkelig tilnærminger, som 2-fotonet mikroskopi, og bruk av kraftige musen svulst modeller har kaste lys over noen av mekanismene som regulerer anti-tumor T celle aktiviteter. Mens slike systemer har gitt verdifull innsikt, de ikke alltid forutsi menneskelige svar. I menneskelige kommer vår kunnskap innen hovedsakelig fra en beskrivelse av fast svulst prøver fra menneskelige pasienter, samt i vitro studier. Men i vitro modeller mangler komplekse tredimensjonale svulst miljøet, og derfor er ufullstendig omtrentlige in vivo T celle aktiviteter. Ferske skiver fra explanted vev representerer en kompleks, multi-mobilnettet svulst miljø som kan fungere som et viktig bindeledd mellom co kulturperler studier og dyremodeller. Opprinnelig definert i murine lymfeknuter1 og tidligere beskrevet i en JoVE artikkel2, har dette nå blitt transponert til menneskelig svulster undersøke dynamikken i både belagt3 samt bosatt T celler4.
Her, er en protokoll for utarbeidelse av menneskelig lunge svulst skiver, immunostai-bosatt CD8 T og tumor celler og sporing av CD8 T-lymfocytter i svulst microenvironment bruke AC confocal mikroskopi beskrevet. Dette systemet er unikt plassert til skjermen for romanen immunterapi agenter favoriserer T celle migrasjon i svulster.
CD8 T celler spille en nøkkelrolle i kampen mot kreft. Men hindre mange undertrykkende mekanismer T-lymfocytter drepe ondartede celler. De siste årene, er flere lovende strategier som slipper bremsene på T-celler utviklet og brukt i klinikken5. De to tilnærmingene som beholder betydelig oppmerksomhet er immun checkpoint målretting antistoffer, som anti-PD-1 og adopsjon T cellen terapi. Likevel, til tross for nylige suksesser, bare et delsett av pasienter nytte disse behandlingsformer6. En stor utfordring er å identifisere mekanismer for resistens mot kreft immunterapi for å utvikle mer effektive behandlinger. En annen utfordring er å utvikle modellsystemer som romanen terapi kan være preget og testet for deres styrke og sikkerhet. Så langt, er de fleste av disse analyser basert på i vitro celle kultur systemer som dårlig etterligner kompleksiteten av tumor vev.
Ex vivo vev stykker er en lovende teknikk, som det bevarer den opprinnelige vev microenvironment7. Gjennom årene har vi satt opp denne tilnærmingen å spore dynamikken av T-lymfocytter i ulike vev. Våre resultater viser at fluorescently merket T-celler lagt oppå murine lymfeknute skiver migrere til vev og svare på deres aktuelle microenvironmental signaler1,2. T-lymfocytter kledde på menneskelig lunge svulst skiver rekrutteres tilsvarende raskt i svulst stroma3. Bruker denne teknikken, har vi identifisert den ekstracellulære matrisen som et viktig element i å kontrollere distribusjon og migrering av T-celler i menneskelig svulster3,4. Fordi virkemåten til ex vivo renset og belagt T celler gjenspeiler ikke nødvendigvis virkemåten til bosatt intratumoral T-lymfocytter, har vi nylig fornyet dette tilnærming4.
Her beskriver vi en protokoll for å spore bosatt T-lymfocytter i skiver av friske menneskelige lunge svulst. De ulike trinnene består av utarbeidelse av menneskelig lunge svulst skiver (inkludert innebygging av agarose og vibratome snitting av innebygde vev), den flekker av endogene T-celler med fluorescerende antistoffer i frisk svulst skiver og overvåking av disse cellene med AC confocal mikroskop.
En enkel, rask og robust teknikk for å generere menneskelige lunge svulst skiver og vurdering av den dynamiske oppførselen av bosatt CD8 T-celler i en bevarte svulst miljøbruk AC confocal mikroskop er beskrevet. Denne protokollen er en avgrensning av en tidligere JoVE artikkel som beskriver overvåking av belagt T-celler på murine lymfeknute skiver2.
Bleking av fluorescerende fargestoffer må vurderes spesielt med første generasjon fargestoffer som fluorescein isothiocyanate og phycoerythrin. Vi fant at en uttalt photobleaching av direkte-kombinert antistoffer oppstod med to-fotonet mikroskop. Derimot ble minimale photobleaching oppdaget med AC confocal mikroskoper, særlig ved hjelp av lyse fluorescerende fargestoffer nylig utviklet.
Antistoffer er relativt store molekyler og derfor deres gjennomtrengning i vevet kan være vanskelig. Dette trinnet kan forbedres ved å øke inkubasjon tiden. Dessuten, flekker bruk en mindre reagenser som direkte koblede Fab fragmenter av antistoffer representerer et godt alternativ.
Alle antistoffer beskrevet i denne protokollen er tidligere godkjent og kjent for å produsere lyse flekker4. Derfor er isotype kontroller ikke nødvendig. Men hvis endringer denne metoden bruker andre antistoffer er ønskelig, anbefales så bruk av isotype kontroll antistoffer.
Eksperimentell systemet presenterer noen begrensninger. Kutte prosedyren vil skade vev, som kan påvirke CD8 T-celler, spesielt nær kuttet overflaten. I tillegg kan en rekke løselig faktorer (f.eks chemokines) i kontrollere overføringen av T-celler gå tapt. En måte å omgå disse problemene er ved å overvåke T-celler på flere titalls mikrometer fra overflaten i antagelig sunnere områder av vev. Publisert eksperimenter avslører at T-celler lokalisert dyp i vevet migrere mer aktivt enn T-celler lokalisert nær kutte overflate4. Vi har brukt AC confocal mikroskop for våre studier, men det er sannsynlig at to-fotonet mikroskop vil øke romlig oppløsning i dybden.
Denne tilnærmingen er avhengig av bruken av fluorescently-kombinert antistoffer som ikke nøytral molekyler. Full størrelse antistoffer er mottakelige for påvirker normal funksjon av T-celler på forskjellige måter. Først kan anti-CD8 antistoffer endre T celle migrasjon ved å utløse en intracellulær signalnettverk cascade kan påvirke cytoskeleton av lymfocytter spiller. Andre anti-CD8 antistoffer kan modulerer samspillet mellom CD8 og MHC klasse I molekyler, et viktig skritt i antigen anerkjennelse prosessen. Tredje, intakt antistoffer kan binde til Fc reseptorer uttrykt av mange myeloide celler i svulsten og derfor utsatt å øke uspesifisert signalet. Vi har ingen indikasjon på at et problem påvirket våre data, sannsynligvis fordi Fc reseptorer bosatt myeloide celler er ulikt i kultur, mettet med immunglobuliner stede i svulst miljøet. Faktisk, tillegg av serum under merking prosedyren, gjødsler blokkere gratis Fc reseptorer, ikke endre den immuno-flekker. Likevel Fab fragmenter av antistoffer, blottet for Fc regionen, samt antistoffer mutated i Fc region og Kamelid-avledet antistoff fragmenter8 representerer andre alternative strategier spore bosatt celler med fluorescerende tracers.
De siste tiårene, er flere modellsystemer utviklet og brukt for sanntids avbilding av T-lymfocytter. Disse inkluderer i vitro preparater av T celler tidligere renset og kultivert med antigen presentere celler. Slike forberedelser har tillatt bemerkelsesverdig fremgang i å definere mekanismer av antigen anerkjennelse og reaksjonsevne. Men mangler de kompleksiteten i vev miljøet. Andre preparater er etablert at mer tett etterligne strukturen i en innfødt vev. For eksempler, tredimensjonale kollagen gel matriser i hvilke renset T-celler har vært innebygd, og kultur av reaggregated vev fragmenter har blitt brukt til å overvåke den dynamiske oppførselen av T-lymfocytter med fluorescerende imaging teknologi9 . Disse systemene dag fordelen av en arkitektur nær innfødt vev, men de mangler andre viktige mobilnettet og løselig faktorer. I mus, har to-fotonet intravital mikroskopi vært ansatt spore T celler i virkelig fysiologiske miljøet i et intakt organ10. Men er slik tilnærming teknisk vanskelig å definere. I tillegg viser musen modeller bemerkelsesverdig forskjellene med menneskelige fysiologi.
Teknikken er beskrevet i denne protokollen representerer en kompleks, multi-mobilnettet svulst miljø som er unikt posisjonert til å fungere som et viktig bindeledd mellom co kulturstudier og dyremodeller.
Protokollen beskrevet her kan også brukes til å spore motilitet i andre celler enn CD8 T-lymfocytter som antistoffer er generert. Videre er kan teknikken tilpasses andre menneskelige og murine svulster og vev. For eksempel, har vi kunnet bilde i sanntid dynamikken i B-celler merket med en anti-CD19 antistoff friske menneskelige mandlene.
Teknikken er beskrevet i denne protokollen gir skjermen terapeutiske molekyler kontrollere T celle motilitet i vev. Tilgjengelighet av kultur-systemet tillater å bruke noen farmakologiske reagenser og teste deres konsekvenser på T celle migrasjon. Det er nå akseptert at i voksende svulster, CD8 T celler ha en lav overføring og redusert kontakter med tumor celler11. Viktigst, knappe tilstedeværelsen av T-celler i svulst celle regioner er forbundet med et dårlig resultat og anses å være en av resistens til T celle-baserte kreft immunterapi. Flere hindringer begrense T celler fra migrering i tumorer har blitt identifisert inkludert en tett ekstracellulær matrix. I denne forbindelse representerer identifikasjon av molekyler kan gjenopprette T celle motilitet og samhandling med ondartede celler et viktig skritt i kreft immunterapi. I en tidligere studie fant vi at en delvis degradering av kollagen med collagenase, akutt på menneskelig lunge skiver, forbedrer kontakt av T-celler med kreftceller.
Til slutt, muligheten til å holde menneskelige svulst skiver i kultur for opp til flere dager7,12,13 tilbyr en rekke lovende programmer T celler og immunterapi.Men er stabiliteten av modellen under langsiktige kultur en viktig parameter som må vurderes grundig.
Skaffe frisk og sunn vev er en kritisk faktor å produsere kvalitet skiver med god immunostai-CD8 celler, kreftceller og stromal elementer. Holde svulst biopsi på 4 ° C før behandling er avgjørende.
Håndtering av skiver med fine tang representerer et viktig skritt i denne protokollen. Dette bør utføres med stor forsiktighet i agarose kan være lett skadet. Et kutt i agarose vil invadere segl laget av rustfritt stål vaskemaskinen resulterer i en lekkasje av antistoffer som inneholder løsninger.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Pierre Bourdoncle og Thomas Guilbert av Cochin Imaging (Institut Cochin, Paris) om råd og hjelp med mikroskop. Dette arbeidet var støttes delvis av tilskudd fra den franske Ligue Nationale contre le kreft, av CARPEM (forskning for personlig medisin), av Fondation de France og EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under grant avtale uten 667980 (KARAT).
Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |