Det här protokollet beskriver en metod för att bilden bosatt tumör-infiltrera CD8 T-celler märkta med fluorescently kopplat antikroppar inom human lung tumör skivor. Denna teknik tillåter realtid analyser av CD8 T cellmigration med konfokalmikroskopi.
CD8 T-cell är nyckelaktörer i kampen mot cancer. För CD8 T-celler att döda tumörceller behöver de in i tumören, migrera inom den tumör närmiljön och svara adekvat på tumör antigener. Den senaste utvecklingen av förbättrade bildgivande metoder, såsom 2-foton mikroskopi, och användningen av kraftfull mus tumör modeller har belyst några av de mekanismer som reglerar anti-tumor T cell aktiviteter. Sådana system har lämnat värdefulla insikter, de inte alltid förutse människors reaktioner. I mänskliga kommer vår kunskap inom främst från en beskrivning av fasta tumörprover från mänskliga patienter som in vitro- studier. Dock in vitro- modeller saknar den komplexa tredimensionella tumör miljön och, därför, är ofullständiga approximationer av in vivo T cell aktiviteter. Färska skivor tillverkade av explanterad vävnad representerar en komplexa flercelliga tumör-miljö som kan fungera som en viktig länk mellan Co odlade studier och djurmodeller. Ursprungligen inrättades i murina lymfkörtlar1 och tidigare beskrevs en JoVE artikel2, har detta tillvägagångssätt nu införlivats till mänskliga tumörer att undersöka dynamiken i guldpläterad3 såväl som bosatt T celler4.
Här, beskrivs ett protokoll för beredning av mänskliga lung tumör skivor, immunfärgning av bosatta CD8 T och tumör celler och spårning av CD8 T-lymfocyter inom den tumör närmiljön med konfokalmikroskopi. Detta system är unikt lämpade att skärmen för romanen immunterapi agenter gynnar T cellmigration i tumörer.
CD8 T-celler spelar en nyckelroll i kampen mot cancer. Dock hindra många immunhämmande mekanismer T-lymfocyter från döda maligna celler. De senaste åren har har flera lovande strategier som lossa bromsarna på T-celler utvecklats och används i kliniken5. De två tillvägagångssätt att behålla stor uppmärksamhet är immun checkpoint-targeting antikroppar, såsom anti-PD-1 och adoptiv T cellterapi. Ändå, trots senaste framgångar, endast en delmängd av patienter nytta av dessa behandlingar6. En stor utmaning är att identifiera mekanismer för resistens mot cancer immunterapi för att utveckla effektivare behandlingar. En annan utmaning är att utveckla modellsystem som roman terapier kan kännetecknas och testade för deras styrka och säkerhet. Hittills har baseras de flesta av dessa analyser på in vitro- kultur cellsystem som dåligt efterliknar komplexiteten i tumörvävnad.
Ex vivo vävnad skivor är en lovande teknik, eftersom det bevarar den ursprungliga vävnad mikromiljö7. Genom åren har vi satt upp denna strategi att följa dynamiken i T-lymfocyter i olika vävnader. Våra resultat tyder på att fluorescently märkt T-celler som lagt till ovanpå murina lymfkörtel skivor migrera in i vävnaden och svara på deras lämpliga microenvironmental cues1,2. T-lymfocyter som överlagras på människans lung tumör skivor rekryteras på samma sätt snabbt in den tumör stroma3. Med denna teknik, har vi identifierat den extracellular matrisen som en viktig del i kontrollen av distribution och migrering av T-celler inom mänskliga tumörer3,4. Eftersom beteendet hos ex vivo renas och guldpläterade T-celler inte nödvändigtvis återspeglar beteendet hos bosatta intratumoral T-lymfocyter, har vi nyligen förfinat denna metod4.
Här beskriver vi ett protokoll för att spåra bosatt T-lymfocyter inom skivor tillverkade av färska mänskliga lungtumörer. De olika stegen består av utarbetandet av mänskliga lung tumör skivor (inklusive agaros inbäddning och vibratome snittning av inbäddade vävnad), färgningen av endogena T-celler med fluorescerande antikroppar i färsk tumör segment och övervakning av dessa celler med en confocal Mikroskop.
En enkel, snabb och robust teknik för att generera mänskliga lung tumör skivor och bedömning av dynamiska beteende av bosatta CD8 T-celler i en bevarad tumör miljö med confocal Mikroskop beskrivs. Detta protokoll är en förfining av en tidigare JoVE artikel som beskriver övervakning av pläterad T-celler på murina lymfkörtel skivor2.
Blekning av fluorescerande färgämnen måste beaktas särskilt med första generationen färgämnen som fluorescein isotiocyanat och fykoerytrin. Vi hittade att en uttalad fotoblekning direkt kopplade antikroppar inträffat med en två-foton Mikroskop. Däremot var minimal fotoblekning märkt med confocal Mikroskop, särskilt med ljusa fluorescerande färger helt nyligen.
Antikroppar är relativt stora molekyler och deras penetration in i vävnaden kan därför vara svårt. Detta steg kan förbättras genom att öka inkubationstiden. Dessutom färgning att använda en mindre reagenser såsom direkt kopplade Fab fragment av antikroppar utgör ett bra alternativ.
Alla antikroppar som beskrivs i detta protokoll har tidigare validerats och kända för att producera ljus färgning4. Därför krävs inte isotypen kontroller. Dock om ändringar till den här metoden använder andra antikroppar önskas, rekommenderas då användningen av isotypen kontroll antikroppar.
Detta experimentella system utgör några begränsningar. Förfarandet för styckning kommer att skada vävnaden, vilket kan påverka beteendet hos CD8 T-celler, speciellt nära den skurna ytan. Dessutom kan ett antal lösliga faktorer (t.ex. chemokiner) instrumental i att kontrollera migreringen av T-celler förloras. Ett sätt att kringgå dessa problem är genom att övervaka T-celler som ligger på flera tiotals mikrometer från ytan i förmodligen friskare regioner i vävnaden. Publicerade experiment visar att T-celler lokaliserad djupt in i vävnaden migrerar mer aktivt än T-celler som lokaliserade nära den skurna ytan4. Vi har använt confocal Mikroskop för våra studier men det är troligt att två-foton Mikroskop kommer att öka den rumsliga upplösningen i djup.
Denna strategi bygger på användning av fluorescently-kopplade antikroppar som inte är neutrala molekyler. Full storlek antikroppar är mottagliga för påverka den normala funktionen av T-celler på olika sätt. Första kan anti-CD8 antikroppar förändra T cellmigration genom att utlösa en Intracellulär signalering kaskad kan påverka cytoskelettet av lymfocyt. Andra anti-CD8 antikroppar kan modulera samspelet mellan CD8 och MHC klass I molekyler, ett viktigt steg i processen antigen erkännande. Tredje, intakt antikroppar kan binda till Fc receptorer uttrycks av många myeloida celler distribuerade i tumören och därför mottagliga att öka den icke-specifik signalen. Vi har inget som tyder på att sådant problem påverkas vår data, förmodligen eftersom Fc receptorer av bosatta myeloida celler är, till skillnad från celler i kultur, mättad med immunglobuliner närvarande inom den tumör miljön. Tillägg av serum under förfarandet för märkning, en process som kallas att blockera gratis Fc-receptorer, förändrades faktiskt inte immuno-färgningen. Trots Fab fragment av antikroppar, saknar Fc-regionen, samt antikroppar muterad i deras Fc-regionen och kameldjur-derived antikropp fragment8 representerar andra alternativa strategier för att spåra bosatt celler med fluorescerande spårämnen.
Under de senaste årtiondena, har flera modellsystem utvecklats och används för realtid bildtagning av T-lymfocyter. Dessa inkluderar in vitro- beredningar av T celler tidigare renat och odlade med antigen-presenterande celler. Sådana preparat har gjort anmärkningsvärda framsteg i att definiera mekanismer antigen erkännande och lyhördhet. De saknar dock komplexiteten i vävnad miljön. Andra preparat har fastställts att mer noggrant efterlikna strukturen av en infödd vävnad. För exempel, tredimensionella kollagen gel matriser där renat T-celler har inbäddade, liksom kultur av reaggregated vävnad fragment har använts för att övervaka dynamiska beteende av T-lymfocyter med fluorescerande avbildningstekniker9 . Dessa system presentera fördelen av en arkitektur nära infödda vävnaden, men de saknar andra viktiga cellulära och lösliga faktorer. I mus, har två-photon intravital mikroskopi varit anställd att spåra T-celler i verkligt fysiologiska miljön av en intakt orgel10. Sådant tillvägagångssätt är dock tekniskt svårt att ställa upp. Dessutom visar musmodeller anmärkningsvärda skillnader med människans fysiologi.
Tekniken som beskrivs i detta protokoll representerar en komplexa flercelliga tumör-miljö som är unikt positionerat för att fungera som en viktig länk mellan Co kulturstudier och djurmodeller.
Protokollet beskrivs häri kan också användas för att spåra motiliteten i andra celler än CD8 T-lymfocyter som antikroppar har genererats. Dessutom kan tekniken anpassas till andra mänskliga och murina tumörer och vävnader. Vi har exempelvis kunnat bild i realtid dynamiken i B-celler märkta med en anti-CD19 antikropp i färska mänskliga tonsiller.
Tekniken som beskrivs i detta protokoll kan skärmen för terapeutiska molekyler kontrollera T cell motilitet i vävnader. Tillgängligheten till kultur systemet tillstånd att tillämpa vissa farmakologiska reagenser och testa deras konsekvenser på T-cellmigration. Det är nu accepterat att i växande tumörer, CD8 T-celler uppvisar en låg migration och reducerade kontakter med tumör celler11. Ännu viktigare, knappa förekomsten av T-celler i tumören cell regioner är associerade med ett dåligt resultat och anses vara en av resistensmekanismer till T cell-baserad cancer immunoterapi. Flera hinder begränsar T-celler från att migrera i tumörer har identifierats inklusive en tät extracellulärmatrix. I detta avseende utgör identifiering av molekyler kan återställa T cell motilitet och interaktion med maligna celler ett viktigt steg i cancer immunoterapi. I en tidigare studie fann vi att en partiell nedbrytning av kollagen med kollagenas, akut tillämpas på mänskliga lung skivor, förbättrar kontakten av T-celler med tumörceller.
Slutligen, möjligheten att hålla mänskliga tumör skivor i kulturen för upp till flera dagar7,12,13 erbjuder ett antal lovande tillämpningar i termen av T-celler och immunterapi.Stabiliteten i modell systemet under lång sikt kultur är dock en viktig parameter som måste bedömas noggrant.
Att få fräsch och frisk vävnad är en kritisk faktor att producera kvalitet skivor med bra immunfärgning av CD8 celler, tumörceller och stromal element. Att hålla tumören biopsi vid 4 ° C före behandling är avgörande.
Hantering av skivor med fin pincett representerar ett annat viktigt steg i detta protokoll. Detta bör utföras med omsorg eftersom Agarens lätt kan skadas. En sänkning av Agarens kommer att äventyra sigill gjort av rostfritt stål bricka vilket resulterar i läckage av antikropp innehållande lösningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Pierre Bourdoncle och Thomas Guilbert i Cochin Imaging anläggningen (Institut Cochin, Paris) för råd och hjälp med Mikroskop. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från det franska Ligue Nationale contre le Cancer, av CARPEM (Cancer Research för personlig medicin), genom den Fondation de France och Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation under lån avtal nr 667980 (CARAT).
Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |