Her beskriver vi levering af mikroRNA ved hjælp af en rekombinant adeno-associeret virus serotype 9 i en musemodel af neuromuskulære sygdomme. En enkelt perifere administration i mus resulteret i vedvarende miRNA overekspression i muskel og motoriske neuroner, giver mulighed for undersøgelse miRNA funktion og terapeutiske potentielle in vivo.
RNA-interferens via den endogene miRNA pathway regulerer genekspression ved at kontrollere proteinsyntesen gennem post-transcriptional genhæmning. I de seneste år, har miRNA-medieret genregulering vist potentiale til behandling af neurologiske lidelser forårsaget af en giftig gevinst funktion mekanisme. Effektiv levering til målvæv har imidlertid begrænset dens anvendelse. Vi brugte her en transgene musemodel for spinal og bulbar muskelatrofi (SBMA), en neuromuskulær sygdom forårsaget af polyglutamin ekspansion i androgen receptor (AR), til at teste genhæmning af en nyligt identificerede AR-targeting miRNA, miR-298. Vi overexpressed miR-298 ved hjælp af en rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) serotype 9 vektor for at lette transduktion af ikke-dividere celler. En enkelt hale-vene injektion i SBMA mus induceret vedholdende og udbredte overekspression af miR-298 i skeletmuskulatur og motoriske neuroner og resulterede i en forbedring af den neuromuskulære fænotype i mus.
MiRNAs ikke-kodende RNA’er, 21-23 nukleotider i længde, der spiller en vigtig rolle i reguleringen af genekspression og kontrol af forskellige cellulære og metaboliske veje. 1 genekspression er primært reguleret ved at inducere post-transcriptional gene silencing eller mRNA nedbrydning. 2 MiRNAs er normalt supplerer den 3′ utranslaterede region (UTR) kodning gener, selv om bindende til 5′ UTR og kodende regioner af målet mRNA er også blevet beskrevet. 3
Da den nuværende forståelse af rollerne som miRNA i patogenesen af menneskelige sygdomme udvider, bliver farmakologiske graduering af individuelle miRNAs eller miRNA familier stadig en levedygtig mulighed for terapeutisk. Sammenlignet med andre RNA hæmning strategier, miRNAs har mange fordele: miRNAs er mindre giftige og mindre immunogen og nemt kan leveres i celler på grund af deres lille størrelse. 4 , 5 , 6 MiRNAs har typisk mange mål inden for mobilnetværk, derfor potentielle off target effekter og sikkerhed bekymringer skal tages i betragtning, sammen med effektiv levering til målvæv.
Neuromuskulære sygdomme er erhvervet eller nedarvet forhold, der påvirker muskel og motoriske neuroner. Målretning af narkotika til skeletmuskulatur er et spirende område for forskning, hvor den største udfordring er at opnå omfattende udbredelse inden for det terapeutiske vindue. 7 motoriske neuroner er vanskeligere at målrette, hovedsagelig fordi narkotika adgang er udelukket af blod-hjerne barrieren.
Celle kultur og mus modeller af spinal og bulbar muskelatrofi (SBMA) blev anvendt i denne undersøgelse. SBMA er en neuromuskulær sygdom forårsaget af en giftig gevinst funktion mekanisme, hvor både muskel og motoriske neuroner er berørt. 8 , 9 SBMA (Kennedys sygdom; OMIM #313200) er en X-linked sygdom, karakteriseret ved muskelsvaghed og atrofi, forårsaget af CAG gentages ekspansion i AR genet, som koder en længere polyglutamin tarmkanalen i AR protein. 10 ingen sygdomsmodificerende behandling er i øjeblikket tilgængelig for denne lidelse. Den transgene musemodel, der anvendes i denne undersøgelse indeholder funktionerne i sygdom, herunder køn specificitet, motor-neuron patologi og progressiv muskelatrofi. 11
I denne undersøgelse, bestræbelserne fokuseret på at identificere en miRNA som direkte downregulates udtryk af mutant AR transgenet og på at designe en sikker og effektiv tilstand af levering af miRNA til rygmarven og skeletmuskulatur af vores sygdom musemodel.
Her identificeret vi en forholdsvis uncharacterized miRNA, miRNA-298 (stammesamlingsnummer MIMAT0004901),12 til direkte reducere mutant AR udtryk i SBMA modeller. For at opnå levering af miR-298 til målvæv, brugte vi en viral strategi, med rekombinant adeno-associeret virus serotype 9 (rAAV9). rAAV9 er i stand til at krydse blod-hjerne barrieren og mægle langsigtede genekspression i ikke-dividere celler, herunder neuroner. 13 en enkelt systemisk administration af AAV9-miR-298 resulteret i vedvarende udtryk for miRNA, effektiv transduktion af muskel og motoriske neuroner, ned-regulering af AR udtryk og en forbedring af sygdom fænotype i SBMA mus. 14 denne metode kan bruges til at give miRNA eller antagomirs overekspression i vivo.
Her viser vi en meget effektiv og tilgængelig metode til at vælge og levere via hale indsprøjtning en miRNA bruger rAAV9 som en viral vektor til at målrette skeletmuskulatur og motoriske neuroner i mus. 14 i forhold til andre RNAi strategier, er miRNAs mindre giftige og mindre immunogen. 18 derudover deres beskedne størrelse gør dem velegnet til begrænset emballage kapacitet af virale vektorer. 2 beregningsmæssige algoritmer og forudsigelse værktøjer giver mulighed for identifikation af formodede miRNA-mRNA mål. Når identificeret, skal miRNA virkninger på målet genekspression verificeres. En fælles tilgang er at overexpress en given miRNA in vitro- og opdage mål protein udtryk niveauer ved hjælp af vestlige analyse. 14 , 19
Forskellige undersøgelser har brugt viral og ikke-virale strategier til at levere miRNAs. 13 her vi brugte adeno-associeret virus (AAV) som en gene levering værktøj. Sammenlignet med andre virale vektorer, AAV fremkalder lave immunogenicitet, tillader langsigtede genoverførsel, og har et bredt spektrum af tropisme i dividere og ikke-dividere celler. 18 denne leveringsmetode kan også omgå behovet for kemisk ændring, der kan påvirke funktionaliteten og specificitet af RNA-molekyle. Der er flere serotyper af AAV, som for det meste bestemmes af sammensætningen af kapsid proteiner. Disse serotyper adskiller sig i deres tropisme og transduce forskellige celletyper. Det er nødvendigt at vælge den korrekte serotype, når de overvejer målvæv. Vi valgte rAAV9, på grund af sin høje transduktion effektivitet i centralnervesystemet og skeletmuskulatur efter perifer administration19,20. Denne tilgang har vist større transduktion effekt på neonatale dyr sammenlignet med voksne dyr, sandsynligvis på grund af forskelle i ekstracellulær matrix sammensætning, neuron til glia forhold og modenhed af blod-hjerne-barrieren. 21 , 22
Et vigtigt skridt i denne protokol er designet af udtryk vektor. Sammenlignet med bicistronic vektorer, som er hæmmet af lavere udtryk for det andet gen sammenlignet med den første gen ud for arrangøren, dobbelt promotor vektor giver mulighed for en back-to-back-konfiguration giver høj udtryk for både miRNA og EGFP, således at tillade lokalisering af miRNA i mus væv ved immunfluorescens.
Intravenøs injektion af AAV9 resulterede i høj effektivitet og homogen transduktion i målvæv, skeletmuskulatur og motoriske neuroner. Denne rute injektion giver mulighed for den administrerede dosis til at nå systemisk cirkulationen og krydse hjernen blod barriere, hvilket er vigtigt for behandlingsformer rettet mod det centrale nervesystem. Derudover er det en ikke-invasiv metode til levering til CNS. MiR-298 udtryk steg i rygmarv og muskler efter 2-4 uger med en enkelt perifere injektion på 5 uger gammel. Hvornår bruger enkeltstrenget genom AAV vektorer, de novo -syntesen af andet DNA streng kan udgøre for de forsinkede transduktion. 23
Niveauer af menneskelig miR-298 blev målbart i behandlede mus 20 uger efter en enkelt indgift, tyder på at flere injektioner for kroniske sygdomme, kan være forpligtet til at opnå en terapeutisk effekt. MiRNA nedbrydning over tid kan være begrænsende når en livslang gentagen administration er påkrævet. Derudover kan adaptiv immunitet til AAV vektorer danne en anden barriere for en vellykket gen levering. 24 således generation af AAV vektorer, der er immunologisk inert er afgørende for gentagen administration og opnå langsigtede virkninger med denne lovende levering system. 25
En begrænsning af brugen af miRNA som en terapeutisk strategi er risikoen for off-target effekter. MiRNAs kan interagere gennem incomplementary base parring med andre gen afskrifter, der udgør en fare for sikkerheden med denne tilgang. Forbedret design af RNAi-sekvenser, herunder brug af ikke-kanoniske miRNAs, såsom mirtrons, som omgå mikro-processor kompleks og omfattende sikkerheden og tolerabiliteten langtidsstudier er kritiske før omsætte denne strategi i en sikker og effektiv terapi. 26 , 27 , 28
Metoden beskrevet her blev oprindeligt udviklet til miRNA overekspression, men det kan også udnyttes til miRNA hæmning terapi ved hjælp af antagomirs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt. Vi takker SignaGen laboratorier (Rockvile, MD, USA) for AAV9 virus produktion. Denne forskning blev støttet af murene forskningsprogrammet af NINDS, NIH. Philip R. Lee blev støttet af midler fra Division af murene forskning af NICHD. Carlo Rinaldi blev støttet af et stipendium fra Association Française contre les myopatier (AFM).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |