在这里, 我们描述了 microRNA 使用重组腺相关病毒9型在小鼠神经肌肉疾病模型中的交付。小鼠的单个外围管理导致肌肉和运动神经元的持续 miRNA 过度表达, 为研究 miRNA 功能和体内的治疗潜力提供了机会。
RNA 干扰通过内源 miRNA 通路调控基因表达通过控制蛋白质合成通过转录后基因沉默。近年来, miRNA 介导的基因调控已经显示了治疗神经疾病的潜能, 这是由功能机制的毒性增益引起的。然而, 有效地向目标组织传递却限制了它的应用。在这里, 我们使用了转基因小鼠模型脊髓和球肌萎缩 (SBMA), 一种神经肌肉疾病由 polyglutamine 扩张的雄激素受体 (AR), 以测试基因沉默的新确定的 AR 靶向 miRNA, miR-298。我们抗原 miR-298 使用重组腺相关病毒 (rAAV) 型9向量, 以促进非分裂细胞的转导。单尾静脉注射 SBMA 小鼠导致骨骼肌和运动神经元中 miR-298 的持续和广泛表达, 从而改善了小鼠神经肌肉表型。
MiRNAs 是非编码 rna, 21-23 核苷酸长度, 在调控基因表达和控制不同的细胞和代谢通路方面起着重要作用。1基因表达主要通过诱导转录后基因沉默或 mRNA 降解来调节。2 MiRNAs 通常是互补的 3 ‘ 未翻译的区域 (UTR) 编码基因, 虽然绑定到 5 ‘ UTR 和编码区域的目标 mRNA 也被描述。3
由于目前对 miRNA 在人类疾病发病机制中的作用的理解不断扩大, 个体 miRNAs 或 miRNA 家庭的药理调控越来越成为一种可行的治疗方案。与其他 RNA 抑制策略相比, miRNAs 有许多优点: miRNAs 毒性较小, 免疫少, 而且由于体积小, 容易被送进细胞。4,5,6 MiRNAs 通常在蜂窝网络中有许多目标, 因此需要考虑潜在的非目标效应和安全问题, 同时有效地向目标组织提供。
神经肌肉疾病是获得或继承的条件, 影响肌肉和运动神经元。将药物定向到骨骼肌是一个新兴的研究领域, 主要的挑战是在治疗窗口内实现广泛的分布。7运动神经元的靶点比较困难, 主要是因为血液中的脑屏障排除了药物的进入。
本研究采用细胞培养和小鼠脊髓和球肌萎缩 (SBMA) 模型。SBMA 是一种神经肌肉疾病, 由功能机制的毒性增益引起, 其中肌肉和运动神经元都受到影响。8,9 SBMA (肯尼迪病;OMIM #313200) 是一种 X 关联的疾病, 其特点是肌肉虚弱和萎缩, 由 CAG 基因重复扩张引起的, 这对ar蛋白中的扩展 polyglutamine 道进行编码。10目前尚无治疗此病的疾病改良疗法。本研究使用的转基因小鼠模型概括了该病的特点, 包括性别特异性、运动神经元病理学和渐进性肌肉萎缩。11
在这项研究中, 我们的努力集中在确定一个 miRNA 直接 downregulates 的基因突变 AR 基因的表达和设计一个安全和有效的方式交付 miRNA 脊髓和骨骼肌肉的疾病小鼠模型。
在这里, 我们确定了一个相对 uncharacterized miRNA, miRNA-298 (加入编号 MIMAT0004901),12直接减少突变 AR 表达在 SBMA 模型。为了实现对靶组织的 miR-298, 我们采用了病毒策略, 重组腺相关病毒9型 (rAAV9)。rAAV9 能够跨越血脑屏障, 在非分裂细胞 (包括神经元) 中进行长期基因表达。13 AAV9-miR-298 的单一系统管理导致了 miRNA 的持续表达, 肌肉和运动神经元的有效传导, AR 表达的下降调节, 以及改善 SBMA 小鼠的疾病表型。14本方法可用于在体内提供 miRNA 或 antagomirs 过度表达。
在这里, 我们展示了一个高效和可访问的方法来选择和提供通过尾部注射 miRNA 使用 rAAV9 作为一个病毒载体的目标骨骼肌和运动神经元的小鼠。14与其他 rna 干扰策略相比, miRNAs 毒性较小, 免疫少。18此外, 它们的小尺寸使它们很适合病毒载体的有限包装能力。2计算算法和预测工具允许识别假定的 miRNA mRNA 目标。一旦确定, miRNA 对靶基因表达的影响必须得到验证。一种常见的方法是在体外过度表达 tshr 一个给定的 miRNA, 并利用西方的分析来检测目标蛋白的表达水平。14,19
各种研究已经使用病毒和非病毒的策略来提供 miRNAs。13在这里, 我们用腺相关病毒 (AAV) 作为基因传递工具。与其他病毒载体相比, AAV 诱导低免疫原性, 允许长期基因转移, 在分裂和非分裂细胞中具有广泛的取向。18这种传递方法还可以规避对化学修饰的需要, 这可能会影响 RNA 分子的功能和特异性。AAV 有几种血清型, 主要由衣壳蛋白组成。这些血清型不同于它们的取向和传感器不同的细胞类型。在考虑靶组织时, 有必要选择正确的血清型。我们选择 rAAV9, 由于其在中枢神经系统和骨骼肌的高转导效率19,20。这种方法显示, 与成年动物相比, 新生动物的转导效果更大, 可能是由于细胞外基质成分的差异、神经元与神经胶质的比值以及血脑屏障的成熟。21,22
该协议的一个重要步骤是表达式向量的设计。与 bicistronic 载体相比, 由于第二基因的表达低于启动子旁边的第一个基因而受到阻碍, 因此双启动子向量允许在 miRNA 和 EGFP 之间产生高表达的背对回配置, 从而允许免疫荧光 miRNA 在小鼠组织中的定位。
静脉注射 AAV9 导致靶组织、骨骼肌和运动神经元的高效和均匀传导。这一注射途径允许被管理的剂量达到系统循环和跨脑血屏障, 这对于针对中枢神经系统的治疗非常重要。此外, 它是一种非侵入性的方法交付中枢神经系统。MiR-298 表达在脊髓和肌肉中增加2-4 周后, 单个外周注射在5周的年龄。在使用单链基因组 AAV 载体时, 第二 DNA 链的从头合成可以解释延迟转导。23
在治疗小鼠20周后, 一个单一的管理, 人类 miR-298 的水平是无法检测的, 这表明对于慢性病, 可能需要多次注射才能达到治疗效果。然而, 随着时间的推移, miRNA 的退化可能会限制在需要终生重复管理的情况下。此外, 对 AAV 载体的自适应免疫可以成为成功基因传递的另一个障碍。24因而免疫惰性的世代 AAV 媒介是关键的对重复的管理和达到长期作用以这个有希望的运载系统。25
对使用 miRNA 作为治疗策略的限制是非靶向效应的风险。MiRNAs 可以通过 incomplementary 基础配对与其他基因转录, 这构成了安全风险的方法。改进的干扰序列的设计, 包括使用非规范的 miRNAs, 如 mirtrons, 绕过微处理器复杂和广泛的长期安全和耐受性研究是至关重要的, 然后将此策略转换为安全和有效的治疗方法。26,27,28
本文所描述的方法最初是为 miRNA 过度表达而开发的, 但也可用于 miRNA 抑制治疗, 使用 antagomirs。
The authors have nothing to disclose.
作者声明没有利益冲突。我们感谢 SignaGen 实验室 (Rockvile, 美国 MD) 为 AAV9 病毒生产。这项研究得到了 NINDS 的校内研究计划的支持。菲利普 r. 李得到了发育研究院校内研究司的资金支持。卡洛雷那蒂得到了来自协会法国反肌病 (AFM) 的奖学金的支持。
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |