यहां हम एक neuromuscular रोग के एक माउस मॉडल में एक रिकॉमबिनेंट adeno-जुड़े वायरस सीरोटाइप 9 का उपयोग कर microRNA के वितरण का वर्णन । चूहों में एक एकल परिधीय प्रशासन मांसपेशियों और मोटर न्यूरॉन्स में निरंतर miRNA के परिणामस्वरूप, miRNA समारोह और vivo मेंचिकित्सीय क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक अवसर प्रदान.
अंतर्जात miRNA मार्ग के माध्यम से आरएनए हस्तक्षेप पोस्ट-transcriptional जीन मुंह बंद करने के माध्यम से प्रोटीन संश्लेषण को नियंत्रित करके जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है । हाल के वर्षों में, miRNA-मध्यस्थता जीन विनियमन तंत्रिका विज्ञान समारोह तंत्र का एक विषाक्त लाभ की वजह से विकारों के उपचार के लिए क्षमता दिखाया गया है । हालांकि, लक्ष्य ऊतकों को कुशल वितरण अपने आवेदन सीमित है । यहाँ हम रीढ़ की हड्डी और bulbar पेशी शोष (SBMA), एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) में polyglutamine विस्तार की वजह से एक neuromuscular बीमारी के लिए एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का इस्तेमाल किया, एक नए पहचान ए. ए.-लक्ष्यीकरण मुंह बंद करने द्वारा जीन miRNA परीक्षण करने के लिए, मीर-२९८. हम मीर-२९८ एक रिकॉमबिनेंट adeno-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) सीरोटाइप 9 वेक्टर का उपयोग करने के लिए गैर-विभाजित कोशिकाओं के transduction की सुविधा का प्रयोग । SBMA चूहों में एक एकल पूंछ नस इंजेक्शन कंकाल मांसपेशी और मोटर न्यूरॉन्स में मीर के निरंतर और बड़े पैमाने पर अधिक व्यक्त-२९८ और चूहों में neuromuscular phenotype की उंनति के परिणामस्वरूप प्रेरित ।
MiRNAs गैर कोडिंग RNAs, लंबाई में 21-23 न्यूक्लियोटाइड, कि जीन अभिव्यक्ति और विविध सेलुलर और चयापचय रास्ते के नियंत्रण के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । 1 जीन अभिव्यक्ति मुख्य रूप से उत्प्रेरण पोस्ट-transcriptional जीन मुंह बंद करने या mRNA क्षरण द्वारा विनियमित है । 2 MiRNAs आमतौर पर कोडन जीन के 3 ‘ untranslated क्षेत्र (UTR) के पूरक हैं, हालांकि 5 ‘ UTR और कोडिंग लक्ष्य mRNA के क्षेत्रों के लिए बाध्यकारी भी वर्णित किया गया है । 3
मानव रोगों के रोगजनन में miRNA की भूमिकाओं की वर्तमान समझ के रूप में फैलता है, व्यक्तिगत miRNAs या miRNA परिवारों के औषधीय मॉडुलन तेजी से एक व्यवहार्य चिकित्सीय विकल्प बनता जा रहा है । अन्य आरएनए निषेध रणनीतियों की तुलना में, miRNAs कई फायदे हैं: miRNAs कम विषाक्त और कम immunogenic हैं और आसानी से उनके छोटे आकार की वजह से कोशिकाओं में दिया जा सकता है । 4 , 5 , 6 MiRNAs आम तौर पर सेलुलर नेटवर्क के भीतर कई लक्ष्य है, इसलिए संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव और सुरक्षा चिंताओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए, साथ में कुशल वितरण के ऊतकों को लक्षित करने के लिए ।
Neuromuscular रोगों प्राप्त कर रहे है या विरासत में मिली है कि मांसपेशियों और मोटर ंयूरॉंस प्रभावित । कंकाल की मांसपेशी के लिए दवाओं के लक्ष्यीकरण अनुसंधान के एक उभरते क्षेत्र है, जहां मुख्य चुनौती चिकित्सीय खिड़की के भीतर व्यापक वितरण प्राप्त करने के लिए है । 7 मोटर न्यूरॉन्स अधिक लक्षित करने के लिए मुश्किल हैं, मुख्य रूप से क्योंकि दवा का उपयोग रक्त मस्तिष्क बाधा से precluded है.
सेल कल्चर और स्पाइनल और bulbar दमदार शोष (SBMA) के माउस मॉडलों का इस्तेमाल इस अध्ययन में किया गया. SBMA एक neuromuscular समारोह तंत्र का एक विषाक्त लाभ की वजह से बीमारी है, जिसमें दोनों मांसपेशियों और मोटर न्यूरॉन्स प्रभावित होते हैं । 8 , 9 SBMA (कैनेडी की बीमारी; OMIM #313200) एक एक्स-लिंक्ड रोग, मांसपेशी कमजोरी और शोष की विशेषता, ar जीन में सीएजी दोहराने के विस्तार के कारण होता है, जो एआर प्रोटीन में एक विस्तारित polyglutamine पथ को एनकोड करते हैं । 10 कोई रोग-संशोधित उपचार इस विकार के लिए वर्तमान में उपलब्ध है । इस अध्ययन में प्रयुक्त ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में लिंग विशिष्टता, मोटर-न्यूरॉन पैथोलॉजी, और प्रगतिशील मांसपेशी शोष सहित रोग की विशेषताएं recapitulates हैं । 11
इस अध्ययन में, हमारे एक miRNA है कि सीधे उत्परिवर्ती एआर transgene के downregulates अभिव्यक्ति और रीढ़ की हड्डी और हमारे रोग माउस मॉडल के कंकाल की मांसपेशी को miRNA के वितरण के एक सुरक्षित और कुशल मोड डिजाइनिंग पर की पहचान पर ध्यान केंद्रित प्रयास ।
यहां हम एक अपेक्षाकृत uncharactered miRNA, miRNA-२९८ (प्रवेश संख्या MIMAT0004901),12 की पहचान के लिए सीधे SBMA मॉडल में उत्परिवर्ती एआर अभिव्यक्ति को कम । आदेश में मीर की डिलीवरी प्राप्त करने के लिए-२९८ ऊतकों को लक्षित करने के लिए, हम एक वायरल रणनीति का इस्तेमाल किया, रिकॉमबिनेंट adeno के साथ-एसोसिएटेड वायरस सीरोटाइप 9 (rAAV9) । rAAV9 रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने में सक्षम है और गैर में लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति मध्यस्थता, न्यूरॉन्स सहित कोशिकाओं,. 13 AAV9 के एक एकल प्रणालीगत प्रशासन-मीर-२९८ miRNA की निरंतर अभिव्यक्ति में हुई, मांसपेशी और मोटर न्यूरॉन्स के कुशल transduction, नीचे एआर अभिव्यक्ति के विनियमन, और SBMA चूहों में phenotype रोग की उंनति. 14 इस पद्धति का उपयोग vivo मेंmiRNA या antagomirs का एक् सप्रेस देने के लिए किया जा सकता है ।
यहां हम एक अत्यंत कुशल और सुलभ पद्धति का चयन करें और पूंछ इंजेक्शन एक वायरल वेक्टर के रूप में rAAV9 का उपयोग कर miRNA के माध्यम से वितरित करने के लिए चूहों में कंकाल की मांसपेशी और मोटर ंयूरॉंस लक्ष्य का प्रदर्शन । 14 अंय RNAi रणनीतियों के मुकाबले, miRNAs कम विषाक्त और कम immunogenic हैं । 18 इसके अलावा, उनके छोटे आकार उंहें अच्छी तरह से वायरल वैक्टर की सीमित पैकेजिंग क्षमता के लिए अनुकूल बनाते हैं । 2 अभिकलनी एल्गोरिदम और पूर्वानुमान उपकरण ख्यात miRNA-mRNA लक्ष्यों की पहचान की अनुमति देते हैं । एक बार पहचान की, लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति पर miRNA के प्रभाव सत्यापित किया जाना चाहिए । एक आम दृष्टिकोण के लिए इन विट्रो में एक दिया miRNA व्यक्त और लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी विश्लेषण का उपयोग कर स्तर का पता लगाने है । 14 , 19
विभिंन अध्ययनों miRNAs वितरित करने के लिए वायरल और गैर वायरल रणनीतियों का इस्तेमाल किया है । 13 यहां हमने एक जीन डिलिवरी टूल के रूप में adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) का इस्तेमाल किया । अन्य वायरल वैक्टर की तुलना में, AAV कम immunogenicity बटोरता है, दीर्घकालिक जीन हस्तांतरण की अनुमति देता है, और विभाजन और गैर-विभाजित कोशिकाओं में tropism की एक व्यापक स्पेक्ट्रम है । 18 इस प्रसव विधि भी रासायनिक संशोधन है कि कार्यक्षमता और आरएनए अणु की विशिष्टता को प्रभावित कर सकते है की जरूरत को दरकिनार कर सकते हैं । AAV के कई serotypes हैं, जो अधिकांशतः कैप्सिड प्रोटीन की संरचना से निर्धारित होते हैं. ये serotypes उनके tropism और transduce विभिन्न प्रकार के सेल में अलग होते हैं । यह सही सीरोटाइप जब लक्ष्य ऊतक पर विचार का चयन करने के लिए आवश्यक है । हम rAAV9 चयनित, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और परिधीय प्रशासन के बाद कंकाल की मांसपेशी में अपनी उच्च transduction दक्षता के कारण19,20. यह दृष्टिकोण वयस्क जानवरों की तुलना में नवजात जानवरों में अधिक से अधिक transduction प्रभावकारिता दिखाया गया है, extracellular मैट्रिक्स संरचना में अंतर के कारण होने की संभावना, न्यूरॉन-टू-glia अनुपात, और रक्त मस्तिष्क बाधा की परिपक्वता. 21 , 22
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम अभिव्यक्ति वेक्टर के डिजाइन है । bicistronic वैक्टर के साथ तुलना में, जो दूसरे जीन की कम अभिव्यक्ति से बाधा है पहले प्रवर्तक के बगल में जीन के साथ तुलना में, दोहरी प्रमोटर वेक्टर एक वापस करने वाली वापस विंयास दोनों miRNA और EGFP की उच्च अभिव्यक्ति उपज की अनुमति देता है, इस प्रकार इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा माउस ऊतक में miRNA के स्थानीयकरण की अनुमति.
AAV9 के नसों में इंजेक्शन उच्च दक्षता और लक्ष्य ऊतकों, कंकाल की मांसपेशी, और मोटर न्यूरॉन्स में समरूप transduction में हुई । इंजेक्शन का यह मार्ग प्रशासित खुराक प्रणालीगत संचलन तक पहुंचने और मस्तिष्क रक्त बाधा है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को लक्षित उपचारों के लिए महत्वपूर्ण है पार करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, यह सीएनएस को प्रसव के लिए एक गैर इनवेसिव विधि है । मीर-२९८ अभिव्यक्ति रीढ़ की हड्डी में वृद्धि हुई और मांसपेशियों में 2-4 सप्ताह के बाद एक एकल परिधीय इंजेक्शन के साथ उंर के 5 सप्ताह में । जब एकल असहाय जीनोम AAV वैक्टर का उपयोग कर, दूसरा डीएनए किनारा के de नोवो संश्लेषण देरी transduction के लिए खाते में हो सकता है । 23
मानव मीर के स्तर-२९८ इलाज चूहों में undetect थे 20 सप्ताह एक प्रशासन के बाद, सुझाव है कि पुराने रोगों के लिए, कई इंजेक्शन एक चिकित्सीय लाभ तक पहुंचने के लिए आवश्यक हो सकता है । हालांकि, समय के साथ miRNA गिरावट सीमित किया जा सकता है जब एक आजीवन दोहराया प्रशासन की आवश्यकता है । इसके अलावा, AAV वैक्टर करने के लिए अनुकूली उन्मुक्ति एक सफल जीन वितरण के लिए एक और बाधा फार्म कर सकते हैं । 24 AAV वैक्टर कि immunologically निष्क्रिय कर रहे है के इस प्रकार पीढ़ी दोहराया प्रशासन के लिए महत्वपूर्ण है और इस होनहार वितरण प्रणाली के साथ दीर्घकालिक प्रभाव को प्राप्त करने । 25
एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में miRNA के उपयोग पर एक सीमा ऑफ लक्ष्य प्रभाव का खतरा है । MiRNAs अंय जीन टेप है, जो इस दृष्टिकोण के साथ एक सुरक्षा जोखिम बन गया है के साथ जोड़कर पूरक आधार के माध्यम से बातचीत कर सकते हैं । RNAi दृश्यों की डिजाइनिंग में सुधार, गैर विहित miRNAs के उपयोग सहित, mirtrons, जो माइक्रो-प्रोसेसर जटिल और व्यापक दीर्घकालिक सुरक्षा और सहनशीलता अध्ययन बाईपास एक सुरक्षित में इस रणनीति का अनुवाद करने से पहले महत्वपूर्ण हैं और प्रभावी चिकित्सा । 26 , 27 , 28
विधि यहां वर्णित मूल miRNA के लिए विकसित किया गया था, लेकिन यह भी antagomirs का उपयोग कर miRNA अवरोध चिकित्सा के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की । हम AAV9 वायरस के उत्पादन के लिए SignaGen प्रयोगशालाओं (Rockvile, प्रबंध निदेशक, संयुक्त राज्य अमेरिका) धंयवाद । इस शोध को NINDS, NIH के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया । फिलिप आर ली ने niched के अंदर अनुसंधान के विभाजन से धन का समर्थन किया था । कार्लो रिनाल्डी एसोसिएशन फ़्रांसेज़ contre लेस Myopathies (AFM) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था ।
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |