Aqui descrevemos a entrega de microRNA utilizando um vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 em um modelo do rato de uma doença neuromuscular. Uma única administração periférica em camundongos resultou em superexpressão de miRNA sustentada no músculo e neurônios motores, oferecendo uma oportunidade de estudo miRNA função e potencial terapêutico em vivo.
Interferência do RNA através da via endógena miRNA regula a expressão gênica controlando a síntese de proteínas através de silenciamento pós-transcricional. Nos últimos anos, regulação gênica mediada por miRNA demonstrou potencial para tratamento de doenças neurológicas causadas por um ganho tóxico do mecanismo da função. No entanto, entrega eficiente para os tecidos-alvo tem limitado a sua aplicação. Aqui usamos um modelo do rato transgénico para atrofia muscular espinhal e bulbar (SBMA), uma doença neuromuscular causado pela expansão do polyglutamine no receptor de andrógeno (AR), para testar o silenciamento de genes por um recém identificados AR-direcionamento miRNA, miR-298. Nós overexpressed miR-298, usando um vetor de sorotipo 9 vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para facilitar a transdução de células não-divisão. Uma única injeção de cauda-veia em camundongos SBMA induzido superexpressão sustentado e generalizado da miR-298 no músculo esquelético e neurônios motores e resultou em melhora do fenótipo neuromuscular nos ratos.
Os MiRNAs são não-codificantes RNAs, 21 a 23 nucleotídeos de comprimento, que desempenham um papel importante na regulação da expressão do gene e o controle de diversas vias metabólicas e celulares. 1 expressão de Gene é regulada principalmente através da indução de degradação de silenciar ou mRNA gene pós-transcricional. 2 os MiRNAs são geralmente complementares 3′ untranslated região (UTR) da codificação de genes, embora vinculativos para os 5′ UTR e codificação de regiões de destino que mRNA também tem sido descrita. 3
Como a compreensão atual dos papéis de miRNA na patogênese de doenças humanas se expande, modulação farmacológica de miRNAs individuais ou famílias de miRNA é cada vez mais uma opção terapêutica viável. Em comparação com outras estratégias de inibição de RNA, os miRNAs têm muitas vantagens: miRNAs são menos tóxicas e menos imunogênica e pode ser facilmente entregue nas células por causa de seu tamanho pequeno. 4 , 5 , 6 MiRNAs normalmente têm muitos alvos dentro de redes celulares, portanto, potenciais efeitos fora do alvo e preocupações de segurança precisam ser tomadas em conta, juntamente com entrega eficiente para os tecidos-alvo.
Doenças neuromusculares são adquiridas ou herdados de condições que afetam o músculo e neurônios motores. O direcionamento das drogas para o músculo esquelético é uma área emergente de investigação, onde o principal desafio é conseguir a distribuição generalizada dentro da janela terapêutica. 7 os neurônios motores são mais difíceis para o alvo, principalmente porque o acesso de drogas é impedido pela barreira hemato-encefálica.
Modelos de mouse e cultura celular de atrofia muscular espinhal e bulbar (SBMA) foram utilizados neste estudo. SBMA é uma doença neuromuscular, causada por um ganho tóxico do mecanismo da função, em que ambos os músculos e neurônios motores são afetados. 8 , 9 SBMA (doença de Kennedy; OMIM #313200) é uma doença ligada ao X, caracterizada por fraqueza muscular e atrofia, causada pela expansão de repetição CAG no gene da AR, que codifica um trato polyglutamine prolongada da proteína de AR . 10 nenhum tratamento doença-modificando está atualmente disponível para esta doença. O modelo de rato transgénico utilizado neste estudo recapitula as características da doença, incluindo a especificidade de gênero, patologia do neurônio motor e atrofia muscular progressiva. 11
Neste estudo, nossos esforços focados na identificação de um miRNA que diretamente downregulates expressão do transgene mutante do AR e no design de um modo seguro e eficiente de entrega do miRNA da medula espinhal e músculo esquelético de nosso modelo de mouse de doença.
Aqui, nós identificamos uma miRNA relativamente descaracterizada, miRNA-298 (número de adesão MIMAT0004901),12 para reduzir diretamente a expressão mutante de AR nos modelos SBMA. Para realizar a entrega de miR-298 para tecidos-alvo, usamos uma estratégia viral, com vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 (rAAV9). rAAV9 é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica e mediando a longo prazo expressão gênica em células não-divisão, incluindo os neurônios. 13 uma única administração sistémica de AAV9-miR-298 resultou na expressão sustentado da miRNA, transdução eficiente de músculo e neurônios motores, para baixo-regulamento da expressão do AR e melhoria do fenótipo da doença em camundongos SBMA. 14 esta metodologia pode ser usada para fornecer miRNA ou antagomirs superexpressão na vivo.
Aqui vamos demonstrar uma metodologia altamente eficiente e acessível para selecionar e entregar através da injeção de cauda uma miRNA usando rAAV9 como um vetor viral para atingir o músculo esquelético e neurônios motores em camundongos. 14 em comparação com outras estratégias de RNAi, miRNAs são menos tóxicas e menos imunogênica. 18 além disso, seu pequeno tamanho torná-los bem adaptado à capacidade limitada de embalagens de vetores virais. 2 algoritmos computacionais e ferramentas de previsão permitem a identificação de alvos putativos miRNA-mRNA. Uma vez identificados, os efeitos de miRNA na expressão do gene alvo devem ser verificados. Uma abordagem comum é overexpress um determinado miRNA em vitro e detectar níveis de expressão da proteína alvo usando análise ocidental. 14 , 19
Diversos estudos utilizaram estratégias virais e não virais para a entrega de miRNAs. 13 aqui usamos vírus adeno-associado (AAV) como uma ferramenta de entrega do gene. Em comparação com outros vetores virais, AAV provoca baixa imunogenicidade, permite a transferência de genes a longo prazo, e tem um amplo espectro de tropismo em dividir e não dividir células. 18 este método de entrega também pode contornar a necessidade de modificação química que possa afetar a funcionalidade e a especificidade da molécula de RNA. Existem vários sorotipos de vírus adeno-associados, que são determinados principalmente pela composição das proteínas do capsídeo. Estes sorotipos diferem no seu tropismo e transduce diferentes tipos de células. É necessário selecionar o sorotipo correto quando se considera o tecido-alvo. Nós selecionamos rAAV9, devido a sua eficiência de transdução alta no sistema nervoso central e músculo esquelético após administração periférica19,20. Esta abordagem tem demonstrado maior eficácia de transdução em animais neonatais em comparação com animais adultos, provavelmente devido a diferenças na composição da matriz extracelular, relação do neurônio-para-glia e maturidade da barreira hemato-encefálica. 21 , 22
Um passo importante para este protocolo é o design do vetor de expressão. Comparado com bicistronic vetores, que são dificultados pela menor expressão do gene do segundo, em comparação com o primeiro gene ao lado o promotor, o vetor de promotor dual permite uma configuração consecutiva produzindo alta expressão da miRNA e EGFP, assim permitindo a localização da miRNA no tecido do mouse por imunofluorescência.
Injeção intravenosa de AAV9 resultou em alta eficiência e transdução homogénea no tecidos-alvo, músculo esquelético e os neurônios motores. Esta rota de injeção permite que a dose administrada alcançar a circulação sistêmica e atravessar a barreira de sangue do cérebro, que é importante para terapias alvo do sistema nervoso central. Além disso, é um método não-invasivo para entrega ao SNC. MiR-298 expressão aumentada na medula espinhal e muscular após 2-4 semanas, com uma única injeção periférica em 5 semanas de idade. Quando usando vetores AAV single-stranded do genoma, a síntese de novo da segunda cadeia de DNA pode contabilizar a transdução retardada. 23
Níveis de miR-298 humana foram indetectáveis em camundongos tratados 20 semanas após uma única administração, sugerindo que para doenças crônicas, múltiplas injeções podem ser necessárias para alcançar um benefício terapêutico. No entanto, miRNA degradação ao longo do tempo pode ser um fator limitante quando uma administração repetida ao longo da vida é necessária. Além disso, a imunidade adaptativa aos vetores AAV pode formar outra barreira para uma entrega bem sucedida gene. 24 assim geração de vetores AAV que são imunologicamente inerte é crucial para a administração repetida e alcançar efeitos a longo prazo com este sistema de entrega a promissora. 25
Uma limitação do uso de miRNA como uma estratégia terapêutica é o risco de efeitos fora do alvo. Os MiRNAs podem interagir através de emparelhamento base incomplementary com outras transcrições de gene, que representa um risco de segurança com esta abordagem. Melhorada a criação de sequências de RNAi, incluindo o uso de miRNAs não-canônicos, tais como mirtrons, que ignorar o complexo de microprocessador e extensos estudos de segurança e tolerabilidade a longo prazo são essenciais antes de traduzir esta estratégia em um cofre e terapia eficaz. 26 , 27 , 28
O método descrito aqui foi originalmente desenvolvido para superexpressão de miRNA, mas também pode ser utilizada para a terapia de inibição de miRNA usando antagomirs.
The authors have nothing to disclose.
Os autores declaram não haverá conflito de interesses. Agradecemos SignaGen laboratórios (Rockvile, MD, EUA) para a produção de vírus AAV9. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural do NINDS, NIH. Philip R. Lee foi apoiada por fundos da divisão de pesquisa Intramural de FORMULADORES. Carlo Rinaldi foi apoiado por uma bolsa da Association Française contre les miopatias (AFM).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |