Här beskriver vi leveransen av mikroRNA använda en rekombinant adeno-associerade virus serotyp 9 i en musmodell av en neuromuskulär sjukdom. En perifer administrering hos möss medförde varaktiga miRNA överuttryck i muskel och motoriska nervceller, vilket ger en möjlighet till studie miRNA funktion och terapeutiska potential i vivo.
RNA-interferens via endogena miRNA vägen reglerar genuttryck genom att kontrollera proteinsyntes genom post-transcriptional nedtystning. Under de senaste åren har miRNA-medierad genreglering visat potential för behandling av neurologiska sjukdomar som orsakas av en giftig vinst på funktion mekanism. Effektiv leverans till målvävnaderna har dock begränsat dess tillämpning. Använde här vi en transgen musmodell för spinal och bulbär muskelatrofi (SBMA), en neuromuskulär sjukdom orsakas av polyglutamine expansion i androgenreceptorn (AR), att testa nedtystning av en nyligen identifierade AR-targeting miRNA, miR-298. Vi i ökad utsträckning miR-298 använder en rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) serotyp 9 vektor för att underlätta transduktion av icke-dela celler. En enda svans-ven injektion i SBMA möss inducerad ihållande och utbredd överuttryck av miR-298 i skelettmuskulaturen och motoriska nervceller och resulterade i förbättring av den neuromuskulära fenotypen i möss.
MicroRNA icke-kodande RNAs, 21-23 nukleotider i längd, som spelar en viktig roll i reglering av genuttryck och kontroll av olika cellulära och metabola vägar. 1 genuttrycket regleras främst genom att inducera post-transcriptional gene silencing eller mRNA nedbrytning. 2 MicroRNA är vanligtvis kompletterande till 3′ oöversatta regionen (UTR) kodande gener, även om bindande till de 5′ UTR och kodning regioner i målet mRNA har också beskrivits. 3
Som den nuvarande förståelsen av miRNA i patogenesen av mänskliga sjukdomar roller expanderar, blir farmakologisk modulering av enskilda MicroRNA eller miRNA familjer alltmer ett terapeutiskt alternativ. MicroRNA jämfört med andra strategier för hämning av RNA, och har många fördelar: MicroRNA är mindre giftiga och mindre immunogent och enkelt kan levereras i celler på grund av sin ringa storlek. 4 , 5 , 6 MicroRNA har vanligtvis många mål inom mobilnät, därför potentiella off-target effekter och säkerhetsaspekter måste beaktas, tillsammans med effektiv leverans till målvävnaderna.
Neuromuskulära sjukdomar är förvärvade eller ärftliga förhållanden som påverkar muskler och motoriska nervceller. Inriktningen av droger till skelettmuskulaturen är ett framväxande område för forskning, där den största utmaningen är att uppnå omfattande utbredning inom det terapeutiska fönstret. 7 motoriska nervceller är svårare att rikta, främst eftersom drog tillgång hindras av blod-hjärnbarriären.
Kultur och mus cellmodeller av spinal och bulbär muskelatrofi (SBMA) användes i denna studie. SBMA är en neuromuskulär sjukdom som orsakas av en giftig vinst av funktionen mekanism, då både muskler och nervceller motor påverkas. 8 , 9 SBMA (Kennedys sjukdom; OMIM #313200) är en X-bunden sjukdom, som kännetecknas av muskelsvaghet och atrofi, följd av CAG upprepad expansion i AR-genen, som kodar en utökad polyglutamine tarmkanalen i AR proteinet. 10 ingen sjukdomsmodifierande behandling är för närvarande tillgänglig för denna sjukdom. Transgen musmodell används i denna studie recapitulates funktioner av sjukdomen, inklusive kön specificitet, motorneuron patologi och progressiv muskelatrofi. 11
I denna studie, våra ansträngningar inriktade på att identifiera ett miRNA som direkt downregulates uttryck för den muterade AR transgenens och på att utforma en säker och effektiv läge för leverans av miRNA till ryggmärgen och skelettmuskulaturen av vår sjukdom musmodell.
Här identifierat vi en relativt uncharacterized miRNA, miRNA-298 (anslutningen nummer MIMAT0004901),12 att direkt minska mutant AR uttryck i SBMA modeller. För att uppnå leverans av miR-298 till målvävnaderna, använde vi en viral strategi, med rekombinant adeno-associerade virus serotyp 9 (rAAV9). rAAV9 kan korsa blod-hjärnbarriären och medla långsiktiga genuttryck i icke-dela celler, inklusive nervceller. 13 en enda systemisk administrering av AAV9-miR-298 resulterade i ihållande uttryck för miRNA, effektiv transduktion av muskler och motoriska nervceller, down-förordning AR yttrandefrihet, och förbättringen av den sjukdom fenotypen i SBMA möss. 14 denna metod kan användas för att tillhandahålla miRNA eller antagomirs överuttryck i vivo.
Här visar vi en mycket effektiv och tillgänglig metod för att välja och leverera via svans injektion en miRNA med rAAV9 som en viral vektor för att rikta skelettmuskulaturen och motoriska nervceller hos möss. MicroRNA 14 jämfört med andra RNAi-strategier, och är mindre giftiga och mindre immunogena. 18 dessutom deras ringa storlek gör dem väl lämpade för begränsad förpackning kapacitet virala vektorer. 2 computational algoritmer och prognosverktyg tillåter identifiering av förmodad miRNA-mRNA mål. När identifierat, måste effekterna av miRNA på target genuttryck verifieras. En vanlig metod är att överuttrycka en given miRNA in vitro- och upptäcka målnivåer protein uttryck för att använda västra analys. 14 , 19
Olika studier har använt viral och icke-virala strategier för att leverera microRNA. 13 här använde vi adeno-associerade virus (AAV) som ett verktyg för leverans av genen. AAV jämfört med andra virala vektorer, och framkallar låg immunogenicitet, tillåter långsiktiga genöverföring, och har ett brett spektrum av tropism dela och icke-dela celler. 18 detta leveranssätt kan även kringgå behovet av kemisk modifiering som kan påverka funktionalitet och specificitet av RNA-molekylen. I området i närheten finns det flera serotyper av AAV, vilka bestäms huvudsakligen av sammansättning av kapsid proteiner. Dessa serotyper skiljer sig åt i deras tropism och transduce olika celltyper. Det är nödvändigt att välja rätt serotypen när man överväger målvävnaden. Vi valde rAAV9, på grund av dess höga transduktion effektivitet i centrala nervsystemet och skelettmuskel efter perifer administrering19,20. Denna strategi har visat större transduktion effekt hos neonatala djur jämfört med vuxna djur, troligen på grund av skillnader i extracellulär matrix sammansättning, baserat på neuron-till-glia och mognad av den blod-hjärna-barriären. 21 , 22
Ett viktigt steg i detta protokoll är design av uttrycket vektorn. Dubbla arrangören vektorn jämfört med bicistronic vektorer, som hämmas av lägre uttryck av andra genen jämfört med den första genen bredvid arrangören, och tillåter en back-to-back konfiguration som ger hög uttryck för både miRNA och andra, således så att lokalisering av miRNA i mus vävnad genom immunofluorescens.
Intravenös injektion av AAV9 resulterade i hög effektivitet och homogen transduktion i målvävnaderna, skelettmuskel och motoriska nervceller. Denna väg av injektion tillåter den administrerade dosen når den systemiska cirkulationen och passera blod-hjärnbarriären, vilket är viktigt för terapier riktar sig det centrala nervsystemet. Dessutom är det en icke-invasiv metod för leverans till CNS. MiR-298 uttryck ökade i ryggmärgen och muskel efter 2-4 veckor med en enda perifer injektion vid 5 veckors ålder. När använder enkelsträngade genomet AAV vektorer, de novo syntesen av de andra DNA-strängen kan redovisa den fördröjda transduktion. 23
Nivåerna av mänskliga miR-298 var omätbara i behandlade möss 20 veckor efter en engångsdos, vilket tyder på att för kroniska sjukdomar, flera injektioner kan krävas att nå en terapeutisk fördel. MiRNA nedbrytning över tiden kan dock vara begränsande när ett livslångt upprepad administrering krävs. Adaptiv immunitet mot AAV vektorer kan dessutom utgör ett annat hinder för en framgångsrik gen leverans. 24 således generation av AAV vektorer som är immunologiskt inerta är avgörande för upprepad administrering och att uppnå långsiktiga effekter med denna lovande leveranssystem. 25
En begränsning av användningen av miRNA som en terapeutisk strategi är risken för off-target effekter. MicroRNA kan interagera genom incomplementary bas ihopkoppling med andra gen avskrifter, som utgör en säkerhetsrisk med detta synsätt. Förbättrad utformning av RNAi sekvenser, inklusive användning av icke-kanoniska MicroRNA, såsom mirtrons, som kringgå mikro-processor komplex och omfattande långsiktiga säkerhet och tolerabilitet studier är kritiska innan att omsätta denna strategi i en säker och effektiv behandling. 26 , 27 , 28
Den metod som beskrivs här utvecklades ursprungligen för miRNA överuttryck, men det kan också användas för miRNA hämning terapi med antagomirs.
The authors have nothing to disclose.
Författarna förklarar någon intressekonflikt. Vi tackar SignaGen laboratorier (Rockvile, MD, USA) för AAV9 virus produktion. Denna forskning stöds av intramurala forskningsprogrammet av NINDS, NIH. Philip R. Lee stöddes av medel från den uppdelning av intramurala forskning av NICHD. Carlo Rinaldi stöddes av ett stipendium från Association Française contre les myopatier (AFM).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |