Måling af tætheder af vandige briller ved kryogene temperaturer
Summary
En protokol til bestemmelse af glasagtige fasedensiteter af mikro- til pico-liters størrelse dråber vandige blandinger ved kryogene temperaturer er beskrevet.
Abstract
Vi demonstrerer en fremgangsmåde til bestemmelse af de glasagtige fase-kryogeniske temperaturdensiteter af vandige blandinger og andre prøver, som kræver hurtig afkøling, for at fremstille den ønskede kryogentemperaturfase. Microliter til picoliterstørrelsesdråber afkøles ved fremspring i en flydende nitrogen-argon (N2-Ar) -blanding. Dråbens kryogene temperaturfase evalueres ved anvendelse af et visuelt assay, der korrelerer med røntgendiffraktionsmålinger. Tætheden af den flydende N2-Ar-blanding justeres ved tilsætning af N2 eller Ar, indtil dråben bliver neutralt flydende. Tætheden af denne blanding og dermed af dråben bestemmes ved anvendelse af en testmasse og Archimedes-princip. Med passende omhu i dråbeforberedelse, styring af gas over den flydende kryogenblanding for at minimere isning og regelmæssig blanding af den kryogene blanding for at forhindre densitetstratifikation og faseseparation, tætheder, der er nøjagtige til <0,5% dråber så små som 50 pL kanLet bestemmes. Målinger på vandige kryobeskyttelsesblandinger giver indsigt i kryobeskyttende virkning og tilvejebringer kvantitative data for at lette termisk sammentrykningsmatchning i biologisk kryopreservering.
Introduction
De fysiske egenskaber af vand og vandige blandinger i deres forskellige faser er af grundlæggende interesse og er vigtige for in vivo og in vitro forståelse af biologiske systemer. I nutidig kryobiologi og biologisk kryopreservering er de glasagtige eller amorfe faser af vandige kryobeskyttelsesblandinger af særlig interesse 1 , 2 . Kernering og vækst af iskrystaller kan forstyrre celler og væv og fremme protein denaturering og aggregering, så kryopreserveringsprotokoller, der fortynder opløsningsmidlet, er blevet mere og mere populære. Ved biomolekylær krystallografi forstyrrer krystalliseringen af opløsningsmiddel i kanalerne mellem biomolekyler krystalgitter og nedbryder diffraktionsegenskaber. Vitrifikation opnås ved en kombination af hurtig afkøling, dehydrering og tilsætning af kryobeskyttende opløste stoffer såsom glycerol, ethylenglycol, polyethylenglycoler (PEG'er),Alkoholer og salte.
Vitrifikation begrænser iskrystallisation og vækst, men eliminerer ikke al kølemæssig prøveskade. For eksempel øges krystalmosaiciteten (et mål for fordelingen af krystalplanretninger) rutinemæssigt med en faktor fra 10 til 100, når proteinkrystaller afkøles til en forglasset tilstand 3 , og efter-optødeligheden af forglassede spermaceller og oocytter varierer meget .
En skadesmekanisme er differentiel sammentrækning af opløsningsmiddel og omgivende materiale under afkøling 3 , 4 , 5 . Ligevægtsopløsningsmidlet og opløst koncentration i en krystal, celle eller væv er temperaturafhængige, og opløsningsmidlet plus opløste og omgivende materiale kan indgå i forskellige mængder. Hurtig afkøling kan forhindre opløsning af opløsningsmiddel og opløsning inden forglasning og differentialkontrakt På kan føre til store, inhomogene, ikke-ligevægtspændinger, som forårsager prøveskade.
Rationelle fremgangsmåder til reduktion af køleinduceret skade kunne således drage fordel af kendskabet til temperaturafhængige tætheder af flydende og forglassede vandige blandinger. Ved opløst koncentrationer over 50 vægtprocent opløst stof til vægten af opløsning (vægt / vægt) kan de mest vandige kryobeskyttelsesblandinger forglasses med beskedne afkølingshastigheder på 10 K / s eller mindre, hvilket tillader produktion af og densitetsmålinger ved anvendelse af store glasagtige prøver 6 . Densiteten kan derefter bestemmes ved anvendelse af Archimedes 'princip ved at måle den tilsyneladende vægt af prøven, når den suspenderes i et flydende kryogen som nitrogen. Da opløsningsmiddelkoncentrationen falder, øges kølingshastighederne for vitrifikation hurtigt: Køleværdier for vandige glycerolblandinger stiger fra <10 K / s ved 50 vægtprocent opløsning i g til volumen opløsning i mL (vægt / volumen) til> 1000 K / s ved 25% vægt / volumenAss = "xref"> 7. Varmeoverførsel begrænses grænselag, således at opnå større kølehastigheder kræver mindre og mindre prøver 8 .
Målinger af tætheden af rent glasagtigt vand og is er opnået ved at deponere dråber med mikrometer-diameter (femtoliter volumen) i et vakuum på en kryogenisk afkølet overflade for at opbygge en makroskopisk (grammasse) prøve. Tætheden af denne prøve blev bestemt ved cryoflotation i en flydende nitrogen-argonblanding, i hvilken densiteten af den kryogene væske blev justeret, indtil prøven blev neutralt flydende 9 . Imidlertid genererer store prøver fra et stort antal små dråber på en måde, der minimerer tomrumsvolumen – en vigtig fejlkilde i tidligere målinger af glasfasetæthed – ikke-trivielt. For vandige blandinger kan differentiel fordampning af opløsningskomponenter under aerosolisering og afsætning i vakuum føre tilVæsentlige usikkerheder i deponerede koncentrationer.
Vi har udviklet en metode baseret på cryoflotation, der tillader præcis densitet bestemmelse af vandige blandinger under anvendelse af individuelle dråber så små som 50 pL10. Disse dråber kan hurtigt afkøles, mens deres oprindelige koncentrationer bibeholdes, og deres kryogene temperaturtilstand (forglasset eller krystallinsk) kan vurderes ved anvendelse af en simpel visuel analyse, der korrelerer med røntgendiffraktionsmålinger. Denne metode er bredt anvendelig til vandige og ikke-vandige blandinger og kan udvides til en række biologiske prøver, herunder celler ( fx stamme og æg), vævsprøver og proteinkrystaller med lavtemperaturdensiteter mellem 0,8 og 1,4 g / ml.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det foreliggende apparat og fremgangsmåder, der primært udvikles af undergraduates med begrænset adgang til instrumenteringsværktøjer og maskiner, leverer alligevel meget præcise densitetsmålinger for individuelle væskedråber så små som 50 pL. I koncentrationsområdet nær og over 50% vægt / vægt, hvor små kølehastigheder er tilstrækkelige til opnåelse af forglasede prøver, stemmer tæthederne med dem, der er opnået i tidligere målinger på bulkprøver. Ekstrapoleringer af nutidens tætheder til 0% k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NSF under prisen MCB-1330685. DWM erkender delvis støtte fra Cornell University's Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
