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Neuroscience

在成年小鼠中的亚型腺相关病毒9(AAV9)载体递送

doi: 10.3791/55770 Published: July 13, 2017

Summary

本研究的目的是通过在成年小鼠中使用新的唾液基因传递技术来开发和验证脊髓腺相关病毒9(AAV9)介导的基因递送的效力和安全性。

Abstract

已经报道了在成年大鼠和猪中成功开发涎腺腺相关病毒9(AAV9)载体递送技术。已经证明使用低位放置的聚乙烯导管(PE-10或PE-5)用于AAV9递送,通过脊髓实质(白色和灰色物质)在低水平注射的脊髓节段中的有效转基因表达。由于神经变性疾病的转基因小鼠模型的广泛范围,强烈希望在成年小鼠中发展有效的中枢神经系统(CNS) - 靶向载体递送技术。因此,本研究描述了在成年C57BL / 6J小鼠中开发脊髓辅助载体递送装置和技术以允许安全和有效的脊髓AAV9递送。在脊髓固定和麻醉的小鼠中,使用XYZ操纵器用尖锐的34G针切开皮肤(颈部1和腰部1-2脊柱节段水平)。第二个XYZ马然后使用咬合器将平坦的36G针推进到腰部和/或颈部的腋下空间中。然后,首先注射编码绿色荧光蛋白(GFP)的AAV9载体(3-5μL; 1.2×10 13个基因组拷贝(gc))。注射后,定期评估神经功能(运动和感觉),动物在用4%多聚甲醛递送AAV9后14天灌注固定。水平或横向脊髓切片的分析显示在整个脊髓中的转基因表达,包括灰色和白色物质。此外,在运动皮层,细胞核和网状细胞的下降的运动轴突和神经元中观察到强烈的逆行介导的GFP表达。任何动物均未观察到神经功能障碍。这些数据表明,唾液腺向量传递技术可以成功地用于成年小鼠,而不会引起与程序相关的脊髓损伤,并且与高效转基因表达有关整个脊髓神经轴突。

Introduction

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使用AAV载体治疗各种脊髓和CNS神经退行性疾病正在成为一个被广泛接受的平台,可有效地上调或沉默感兴趣的基因的表达。更有效地利用该技术治疗CNS /脊髓障碍的关键限制之一是将AAV载体递送到成年哺乳动物的深部脑或脊髓实质的能力有限。

据证实,例如,AAV9的成年啮齿动物,猫,或非人灵长类动物的全身性递送是在脑和脊髓1,2,3神经元诱导转基因表达仅适度有效。 AAV9载体更有效的鞘内输送也已显示导致在解剖学定义的神经元池中只有有限的转基因表达。更具体地说,它已经是恶魔认为在非人灵长类动物,猪或啮齿动物中的顺式或骶 - 囊性鞘内AAV9传递导致脊髓α运动神经元和节段背根神经节神经元中高水平的转基因表达。然而,在脊柱的interneurons或升序或在白质下行轴突最小的或没有表达看到4个 ,5,6,7。总的来说,这些数据表明,存在高度有效的生物解剖屏障,其防止鞘内递送的AAV扩散进入更深的脊髓实质。

在以前使用成年大鼠和猪的研究中,开发了一种新型的唾液腺载体递送技术8 。使用这种方法,在单次推荐的subpial AAV9递送后证明了高效和多节段的转基因表达。一贯看到强烈的GFP表达在神经元,神经胶质细胞和下降/上升的轴突通过注射的脊髓段。这项研究首次表明,该皮肤表现出限制从鞘内空间扩散到脊髓实质的有效AAV9的主要障碍。虽然这种先前开发的技术和亚型注射装置相对容易在大型啮齿动物(如大鼠)或成年猪中使用,但该系统不适合用于小型动物,例如成年小鼠。由于各种神经变性疾病的可用转基因小鼠模型的数量很多,所以显然需要在小鼠中发展有效的脊髓实质载体递送技术。这种技术的可用性将允许研究特异性基因沉默( 例如,使用shRNA)或使用细胞非特异性( 例如巨细胞病毒-CNV或泛素)或细胞特异性( 例如,突触素或胶质细胞)的上调的作用纤维酸性蛋白质(GFAP))启动子。

因此,在本研究中,我们开发和验证了一种可以有效地用于成年小鼠的微型载体递送系统。类似地,如在以前的大鼠和猪研究中,这项工作在小鼠中单次推注AAV9单次递送后,证明在整个脊髓实质中有力的转基因表达。这种方法的简单性,注射的小鼠对于亚临床AAV9递送的非常好的耐受性以及脊髓实质中转基因表达的高效力表明该技术可以在任何实验室设置中有效地实施并用于靶向脊髓基因表达的实验中。

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Protocol

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这些研究是根据加利福尼亚大学圣地亚哥分校动物保健和使用委员会批准的方案进行的,并符合动物实验动物保护评估指南。所有研究都以使组大小和动物痛苦最小化的方式进行。

一般动物和手术准备

  1. 开始外科手术之前,解冻病毒(AAV9-UBI-GFP;5μL等分试样) 8 。通过将葡聚糖粉末在蒸馏水中混合,制备5%葡聚糖(10,000 MW)溶液。将病毒溶液与1%的5%葡聚糖溶液混合至2.5%的最终葡聚糖浓度。
    1. 将病毒溶液储存在冰上(4℃)。
  2. 使用成年C57BL / 6J小鼠(雄性和雌性,20-30克)。麻醉小鼠使用5%异氟烷(O 2,1 L / min),并保持在2-3%吸入异氟烷(O 2,1 L / min)由手术中的鼻锥,取决于呼吸频率和爪夹紧响应。
  3. 用剃须刀剃刮动物的背部,并用2%氯己定清洁皮肤。
  4. 在慢性恢复研究中遵循严格的无菌技术。
  5. 如果要进行腰椎间盘注射,用手术刀切开覆盖Th8-L1椎骨的皮肤,并用剪刀从Th10-12脊椎椎骨上分离椎旁肌。
    1. 使用鼠标脊柱夹将动物装入标准立体定位框架。
    2. 使用牙钻(钻头:0.9mm,速度:20,000rpm)刮掉Th10-12椎骨椎板的两侧,直到出现裂缝。
    3. 用镊子去除破裂的骨碎片,暴露脊髓背脊表面。
    4. 使用30 G不锈钢针和镊子切开硬脑膜约1厘米。
  6. 使用23G不锈钢针头和镊子取出大the the to膜。
  7. 使用棉签清洁任何组织和骨碎片的切口部位。
  8. 使用30 G不锈钢针和镊子将硬膜切开约2-3毫米。

2.打开瓣膜并插入AAV9交付的腋下针

  1. 使用玻璃毛细管支架将34 G穿刺针插入XYZ操纵器的Z形臂( 图1AB )。
    注意:为了制造穿透针,使用具有金刚石研磨板的玻璃毛细管斜面(粗糙(5.0μm至50μm尖端尺寸))和34G针尖的原始斜角尖端磨削角度15 - 20°。然后将针的尖端(1mm长度,从尖端测量)轻轻地弯曲到约90°( 图1B ,左插入物)。
  2. 使用外科手术解剖范围,设置为8-10 X放大倍数,使用X型手臂将穿刺针穿透皮瓣约1 mm( 图1C )。
    1. 将穿刺针的角度保持在5-10°的组织表面。
  3. 皮瓣打开后,使用X型手臂将ia穿刺针从水平空间( 1D)水平取出。
    注意:记住由地标(例如血管)穿透的部位。
  4. 使用与PE-10或PE-20管连接到注射针的50μL微量注射器,装入带有AAV9-UBI-GFP病毒的钝性36G注射针头。
  5. 将针安装到第二XYZ操纵器的Z形臂上( 图1A B )使用玻璃毛细管支架( 图1B ,右插入)。
    注意:为了制造亚型AAV9注射针,使用具有金刚石研磨板的玻璃毛细管斜面(粗糙(5.0μm至50μm尖端尺寸))抛光36 G针头的钝头,以去除尖锐边缘。然后将针的尖端(2-3mm长度,从尖端测量)轻轻弯曲至约90°。将穿刺和腋下注射针插入1-2厘米长的20G从属不锈钢管(距针头10毫米)并用环氧胶粘。需要使用20 G(0.91 mm直径)的管道,以确保与玻璃毛细管支架的连接。
  6. 通过操纵第二操纵器的X,Y和Z臂,将AAV9注射针的尖端定位到穿刺部位,然后通过先前的膜片开口将其推进到约2-3mm的唾液空间中,使用X臂( 图1EF )。
    注:1)AAV9-UBI-GFP是根据先前报道的协议9,10制备,并最终滴度每mL(GC /毫升)调节至1.2×10 13个基因组拷贝。 2)由于容易识别,所以不需要标记小开口的位置( 图1D )。
  7. 使用50μL微量注射器将AAV9-UBI-GFP(1.5,3或5μL)注入涎腺空间(参见实验组的表1 )。
  8. 在完成AAV9-UBI-GFP注射后,从唾液空间中取出注射针。
  9. 使用4.0单丝缝合线和手术夹将肌肉和皮肤关闭。
    注意:没有必要密封开放的椎骨。
  10. 让动物在加热垫上恢复。
  11. 对于疼痛控制,每12小时注射丁丙诺啡0.05 mg / kg / sc术后2-3天

3.灌注固定,组织低温保护和免疫荧光染色

  1. 在AAV9次注射后的预定时间点,用安乐死溶液深度麻醉小鼠(参见材料表 ,0.3mL),并用20mL肝素化盐水随后用20mL的4%多聚甲醛PBS溶液灌注。
  2. 使用骨骨折解剖脊髓和脑,并在4℃下将其固定在4%甲醛的PBS中过夜。
  3. 用30%蔗糖在PBS中冷冻保护脊髓和大脑至少5-7天。
  4. 在低温恒温器上切割冠状,横向或纵向/横向冷冻切片(30μm厚),并将其储存在4°C的PBS中。

4.脊髓和脑切片的免疫荧光染色(参见材料表)

  1. 孵化自由浮动部分在初级y抗体过夜。
  2. 与初级抗体孵育后,在PBS中洗涤切片三次,并与荧光结合的驴抗兔,驴抗鸡和驴抗山羊二抗孵育。
  3. 将显微镜载玻片放置在室温下干燥,并用抗褪色培养基覆盖。
  4. 使用荧光荧光显微镜(目标:10X,NA-0.3; 20X,NA-0.8;和63X,NA-1.4)捕获图像。

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Representative Results

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亚型AAV9注射片段中强有力的转基因表达:
在AAV9递送14天后脊髓切片中转基因(GFP)表达的分析显示整个脊髓实质中具有AAV9-剂量依赖性GFP表达。首先,注射到上腰椎间质空间中的两次双侧3μL注射AAV9-UBI-GFP与全部腰脊髓中白色和灰质的近完全感染相关,延伸至上胸段( 图2A2B ,左列和中间列)。两只双侧1.5μL注射AAV9-UBI-GFP进入上腰椎间质空间,与全脊椎脊髓中白色和灰色物质的近似完全感染相似(注射3μL后观察到);然而,胸中段仅显示偶然感染的神经元(ass =“xfig”>图2B,右列)。使用α-运动神经元特异性(ChAT)和神经元特异性(NeuN)抗体的染色显示在整个驼背α-运动神经元群体( 图2C )和位于背角的中间神经元( 图2D ),中间区( 图2E )和腹角( 图2F )。其次,AAV9两次双侧颈部注射(每次注射5μL)导致整个颈髓(灰色和白质)和上胸段( 图3A3B )的白色和灰色物质中GFP表达相似, 。在同一动物中分析腰椎脊髓切片显示高密度的GFP +下降轴突终止于腰部GFP阴性α运动神经元和中间神经元附近( 图3C3D )。两只双侧颈椎和两只双侧上腹部注射AAV9(每次注射5μL)的输送与整个脊髓中的GFP表达相关,从上颈部到骶骨段,并均匀地存在于白色和灰质中( 图3E- 3H )。

逆行和顺行运输介导的脊髓运动和感觉中心的转基因表达:
在腋下AAV9传播后,腰椎或颈部脊髓中广泛的GFP表达与脊柱后下垂轴突及其突出的神经元以及上行的轴突和末端的鲁棒逆行和顺行感染介导的GFP阳性相关( 图4 )。因此,在网状结构(RF)中定位的神经元中观察到强的GFP阳性,,核仁(NR)和运动皮层(MC)( 图4B- 4D )。类似地,在脊髓小脑(SCT),细胞周期和脊髓灰质层(STT)的末端中观察到GFP的免疫反应性( 图4B- 4D )。

图1
图1 :在成年鼠标中执行脊柱唾液注射的实验设置。A )为了在成年小鼠中进行脊柱支架注射,使用两个单独的XYZ操纵器(I和II)。 ( B )每个操纵器的Z形臂都装有玻璃毛细管支架。一个毛细管支架夹持穿透穿刺的34 G针头,第二个保持钝性36 G支架注射针头。 ( CDEF)在插入穿刺针( D )的尖端之后,在穿刺穿刺针( D )之后,描绘直立穿刺针( C ;硬脑膜已经被去除)之后的穿刺针的位置的图像E ),并且在将腋下注射针3mm延伸到唾液空间( F )之后。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2
图2 :成年小鼠腰椎后路AAV9-UBI-GFP递送后的强直性脊髓实质性GFP表达。A )两次双侧注射AAV9-UBI-GFP(每次1.5或3μL注射)输送到上腰椎肛交空间和动物在AAV9分娩后14天灌注固定。 ( B )注射3 + 3μLAAV9(左侧柱和中间柱)的动物,可以看到灰色(虚线区域内)的强烈GFP表达和从腰部延伸至上胸段的白质。 ( C,D,EF )注射3 +3μLAAV9的动物的腰椎增大的横向脊髓切片的共染色显示在几乎所有ChAT(α-运动神经元标记) - 阳性α-运动神经元( CF )和背角( D )和中间区( E )中的NeuN阳性中间神经元。刻度棒=1,000μm(B); 30μm(C); 100(DF)。 生署:背角; LV:椎板V; VH:腹角。 请点击这里查看更大的ve这个数字的rsion。

图3
图3: 成年小鼠脊髓后颈部脊柱后路子宫颈与唾液中AAV9-UBI-GFP递送后脊髓GFP表达的比较。A,B,CD )水平剖面在先前接受上颈部腋下注射AAV9-UBI-GFP(5 +5μL)的动物中穿过脊髓的整个长度。可以看出宫颈区白色和灰质中的GFP表达增强( B )。在腰脊髓中,可以鉴定出外侧fun ulus(LF)中高密度GFP +下降轴突和NeuN阳性但GFP阴性神经元之间的灰质( CD )。 ( E,F,GH 请点击此处查看此图的较大版本。

图4
图4 rong>:在脑运动和感觉中心的强制逆行和顺行AAV9-UBI-GFP介导的GFP表达。 ( A )描述在颈髓,延髓,小脑和运动皮层(MC)中存在强烈的GFP阳性的低功率图像。 ( B )从矢状脑部分获取的更高功率的图像,并显示在网状结构(RF),细胞核(NR)和脊髓 - 小脑轴突(SCT)的轴突中的神经元中GFP荧光的存在。 ( C )从冠状脑切片获取的低功率图像,其显示在网状丘脑核(STT)区域中的运动皮层(MC)和脊髓锥体末端的锥体神经元中存在GFP荧光。 ( D )大功率图像显示在运动皮层的锥体神经元中强烈的GFP表达。刻度棒=2,000μm(A); 1,000μm(B和C); 60μm(D)。csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。

实验组 AAV9送货地点/级别(*) 体积AAV9注射液,输注速率 生存时间 组织分析
A组(n = 7) C2(双边) 5μL/ 5 min 14天脑+脊髓
B组(n = 12) L1-L2(双侧) 1.5μL或3μL,60 sec /μL 14天脑+脊髓
C组(n = 6) C2 + L1-L2(各级双边) 5μL/ 5 min 14天脊髓
* - 双边=执行两次输入到注射段的右侧和一个左侧的空间的唾液中注射。

表1:实验组。所有实验均在成年C57BL / 6J小鼠中进行。

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Discussion

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目前的研究描述了一种在成年小鼠中的辅助载体(AAV9)递送技术。如所附视频所示,该方法和技术可以有效地被使用,只要根据既定和测试的规格,正确地制造所需的仪器和穿刺针和腋下注射针。

在小鼠中进行一致和安全的唾液注射的关键技术变量:
如所证明的,在背侧颈椎或腰椎板切除术后,可以在成年麻醉的小鼠中容易地进行支气管注射。有几个关键的技术变量定义了腋下注射技术的成功。首先,34 G穿刺针的尖端需要使用斜角度来一致地磨光,以确保皮瓣的平滑穿刺。关于针尖如何削尖的技术的任何不一致都可能导致困难在穿透期间和/或可能通过使用太多的力来刺穿皮肤而引起脊柱损伤。在正常情况下(如视频图1CD所示 ),开口部位没有显示脊髓损伤或腋下出血的迹象。在某些情况下,可以看到一些涎腺出血,但这被发现与AAV9递送后神经功能障碍或基因表达改变无关。其次,通过使用电烙术去除硬脑膜后,保持手术部位免于血液是重要的。即使使用手术显微镜,任何有斑点的血液残留物都会掩盖皮肤表面的可靠识别。 如图1C-F所示,可以使用小的凝胶泡沫块有效地维持无血清椎板切除部位,以覆盖椎板切除的椎骨和周围的软组织。第三,需要特别注意麻醉动物的正确放置脊柱骨架和使用脊柱夹固定脊柱。在脊柱夹钳放置过程中使用过大的压力可引起椎体破裂;使用不足的压力可导致固定的椎骨逐渐松动,这通常在使用牙钻进行椎板切除术后发生。

亚型注射的AAV9的体积与rostro-caudal转基因表达的大小相关。因此,使用两个腰部双侧腋下AAV9注射(3 + 3μL或5 + 5μL)与整个腰椎灰质和白质中一致的GFP表达相关,延伸到上胸段。所用动物的变异性最小。 AAV9注射体积为1.5±1.5μL,导致局部化在注射附近的片段中具有相似的GFP表达;然而,病毒的扩散和所产生的GFP表达在胸段受限(

唾液基因传递技术的限制:
疝气注射技术(与鞘内输送相比)的相对限制之一是当必须进行背侧椎板切除术以允许进入脊髓背表面时该方法的侵入性更强。然而,在整个脊髓和脊髓后脑中心看到的有效的转基因表达似乎表现出明显优于鞘内AAV递送的优点,其特征在于α-运动神经元和原代传入的亚群中的选择性转基因表达(但不存在在更深脊髓层的神经元中) 8

Subpi的未来应用基因传递技术:
类似地,如在成年大鼠和猪的以前的研究中所证明的,通过使用亚型AAV9递送,可以在成年小鼠的脊髓白质和灰质物质中实现高度有效的转基因表达。另外,由于小鼠脊髓的尺寸相对较小(特别是长度),仅在两个脊髓水平(上颈椎和上腰椎)处输送AAV9足以导致近完全脊髓感染。该特征可以通过靶向基因沉默或上调来设计具体的疾病修复治疗方法具有重要的意义。

例如,通过使用shRNA沉默载体,预期突变基因的表达( 例如,在遗传形式的ALS的情况下为SOD)的高度有效降低将在整个脊髓以及脊髓中实现 - 运动脑运动核。第二,由于脊髓白质轴突的高效感染,治疗性基因( 例如,编码生长因子)可以被上调,以促进脊髓创伤受伤动物的轴突发芽。第三,通过操纵次要递送的病毒的体积或滴度以及唾液中注射的位置,转基因的表达可以靶向脊髓的离散区域( 例如,单侧背角)。通过上调抑制性神经递质系统( 例如, GABA)或抑制兴奋性系统( 例如,谷氨酸受体系统) 局部转基因表达可潜在地用于疼痛或肌肉痉挛性改善治疗。第四,除了AAV递送之外,其他分子或血脑屏障渗透性差的载体( 微RNA)可能在唾液分泌后更有效地输送到脊髓实质中。这些可以通过使用有效的测试g本手稿中描述的技术。最后,如目前的研究所示,耻骨技术可以成功地用于平均体重(BW)在20至30g之间的成年小鼠中。因此,可以在具有相似BW的其他动物物种( 例如, Sprague-Dawley(SD)大鼠幼仔)中使用相同的技术和实验装置。 P6和P21 SD大鼠的BW分别为17和62g。在产后发育早期使用大鼠幼仔可能是研究特定基因上调或下调在脊髓神经回路发育,感觉和运动过程中的作用的有用工具。

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Disclosures

Martin Marsala是Neurgain Technologies,Inc.(美国圣地亚哥)的联合创始人。

Acknowledgments

这项研究得到了SANPORC和ALSA基金会赠款(Martin Marsala)的支持。国家可持续发展计划,项目编号LO1609(捷克教育,青年和体育部);和RVO:67985904(Stefan Juhas和Jana Juhasova)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

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References

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在成年小鼠中的亚型腺相关病毒9(AAV9)载体递送
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Cite this Article

Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).More

Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).

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