Summary
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח ולאמת את העוצמה והבטיחות של נגיף השד הקשור ל- Adeno-9 (AAV9), באמצעות שימוש בטכניקה חדשה של מתן גנים תת-גנטי בעכברים בוגרים.
Abstract
פיתוח מוצלח של וירוס adpo המשויך וירוס 9 (AAV9) טכניקת משלוח וקטור ב עכברים בוגרים וחזירים כבר דיווחו בעבר. באמצעות צנתרים פוליאתילן ממוקמים subpially (PE-10 או PE-5) עבור משלוח AAV9, ביטוי transgene עוצמה דרך parenchyma השדרה (חומר לבן ואפור) ב subpially מוזרק קטעי השדרה הוכח. בשל מגוון רחב של מודלים עכבר מהונדס של מחלות נוירודגנרטיב, יש רצון עז בפיתוח של מערכת העצבים המרכזית המרכזית (CNS), ממוקד טכניקת משלוח וקטור בעכברים בוגרים. בהתאם לכך, המחקר הנוכחי מתאר את התפתחותו של המכשיר השולחני וקטורית מתן וקטור וטכניקה כדי לאפשר בטוח ויעיל משלוח AAV9 בעמוד השדרה C57BL בוגרים / 6J. ב spinally משותקת ו הרדמה עכברים, pia mater (צוואר הרחם 1 ו המותני 1-2 השדרה מקטע השדרה) היה חתוך עם מחט 34 G חד באמצעות מניפולטור XYZ. שנייה XYZ MANipulator שימש אז כדי לקדם מחט בוטה 36G לתוך המותניים ו / או שטח תת-עורקי. וקטור AAV9 (3-5 μL, 1.2 x 10 13 עותקים הגנום (gc)) קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוזרק אז subpially. לאחר זריקות, תפקוד נוירולוגי (מוטורי וחושני) הוערך מעת לעת, ובעלי חיים היו זלוף קבוע 14 ימים לאחר משלוח AAV9 עם paraformaldehyde 4%. ניתוח של חלקי חוט שדרה אופקיים או רוחביים הראה ביטוי transgene לאורך חוט השדרה כולו, בחומר אפור ולבן. בנוסף, ביטוי retrogradely בתיווך GFP בתיווך נתפס ב אקסונים מנוע נופל יורד נוירונים בקליפת המוח, גרעין ruber, ו formatio reticularis. לא נצפתה שום תפקוד נוירולוגי אצל בעלי חיים. נתונים אלה מראים כי טכניקת העברת הווקטוריה התת-קרקעית יכולה לשמש בהצלחה בעכברים בוגרים, מבלי לגרום לפגיעה בחוט השדרה הקשורה לפרוצדורה, והיא קשורה לתגובות טרנסגניות חזקותSion לאורך neuraxis השדרה.
Introduction
השימוש של וקטורים AAV לטפל במגוון של חוט השדרה והפרעות העצבים המרכזית CNS הופכת פלטפורמה היטב קיבל ביעילות upregulate או להשתיק את הביטוי של הגן (ים) של עניין. אחת המגבלות העיקריות לניצול יעיל יותר של טכנולוגיה זו לטיפול במחלות חוט השדרה (CNS) / עמוד השדרה היא היכולת המוגבלת לספק וקטור AAV למוח העמוק או לחוט השדרה אצל יונקים מבוגרים.
זה הוכח, למשל, כי המסירה המערכתי של AAV9 במכרסמים, חתולים או פרימטים לא אנושיים היא רק די מתונה בהפיכת ביטוי טרנסג'ן בנוירונים במוח ובחוט השדרה 1 , 2 , 3 . משלוח intrathecal יעיל יותר של וקטורים AAV9 הוכח גם להוביל ביטוי transgene מוגבל בבריכות מוגדרים אנטומית של נוירונים. ליתר דיוק, זה היה שדיםTrated כי cisternal או lumbo-sacral intrathecal AAV9 משלוח ב primates שאינם אנושיים, חזירים, או מכרסמים מוביל לרמה גבוהה של ביטוי transgene מוטורי α-motoneurons ו נוירונים הגזע השורש הגבי. עם זאת, ביטוי מינימלי או ללא inintereurons בעמוד השדרה או אקסונים עולה או יורד החומר הלבן הוא ראה 4 , 5 , 6 , 7 . באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי קיים מחסום ביולוגי-אנטומי יעיל ביותר, המונע דיפוזיה של AAV נמסר תוך כדי לתוך פרנכימה בעמוד השדרה עמוק יותר.
במחקר קודם באמצעות חולדות בוגרות וחזירים, טכניקת משלוח וקטור subpial רומן פותחה 8. באמצעות גישה זו, ביטוי רב עוצמה transgene רב פלחי הודגמה לאחר משלוח בולוס יחיד AAV9 subfial. ביטוי GFP אינטנסיבי נראה בעקביותב נוירונים, תאים גליה, ואת אקסונים עולה / עולה דרך מקטעים השדרה מוזרק. מחקר זה הוכיח לראשונה כי pia mater מייצג את המכשול העיקרי הגבלת AAV9 דיפוזיה יעילה לתוך parenchyma השדרה מהחלל intrathecal. בעוד טכניקה זו שפותחה בעבר והתקן הזרקה subpial הוא יחסית קל לשימוש מכרסמים גדולים (כמו חולדות) או חזירים מבוגרים, המערכת אינה מתאימה לשימוש בבעלי חיים קטנים, כגון עכברים בוגרים. בגלל המספר הגבוה של דגמי עכבר מהונדס זמין של מגוון של הפרעות ניווניות, יש צורך ברור לפיתוח של טכניקת העברת וקטור parenchymal השדרה יעיל בעכברים. הזמינות של טכניקה כזו תאפשר את המחקר של ההשפעה של השתקה גנים ספציפיים ( למשל, באמצעות shRNA) או upregulation באמצעות תא שאינו ספציפי ( למשל, cytomegalovirus-CMV או Ubiquitin) או תא ספציפי ( למשל, סינפסה או glial חומצי פיברילריחלבון (GFAP)) היזמים במהלך התפתחות מוקדמת לאחר הלידה או תחת מצבים חולים.
בהתאם לכך, במחקר הנוכחי, פיתחנו ואמתנו מערכת מינימלית של משלוח וקטור תת-מיני, שניתן להשתמש בה ביעילות בעכברים בוגרים. באופן דומה, כמו מחקרים קודמים חולדה חזיר, עבודה זו מוכיח ביטוי transgene עוצמה לאורך פרנכימה בעמוד השדרה לאחר משלוח בולוס יחיד AAV9 subpial בעכברים. הפשטות של גישה זו, את הסבילות טוב מאוד של הזריקו עכברים לאספקה AAV9 subpial, ואת העוצמה הגבוהה של ביטוי transgene ב parenchyma השדרה מרמזים כי טכניקה זו יכולה למעשה להיות מיושם בכל הגדרה במעבדה ומשמש בניסויים מיקוד ביטוי הגן השדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרים אלה בוצעו על פי פרוטוקול שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו ועמדו בקנה אחד עם האגודה להערכת הנחיות מעבדה טיפול בבעלי חיים לשימוש בבעלי חיים. כל המחקרים נעשו באופן שמטרתו למזער את גודל הקבוצה וסבל בעלי החיים.
1. כללי הכנה חיה וכירורגי
- לפני תחילת הליך כירורגי, להפשיר את הנגיף (AAV9-UBI-GFP, 5 aliquots μL) 8 . הכן 5% dextran (10,000 MW) פתרון על ידי ערבוב אבקת dextran במים מזוקקים. מערבבים את פתרון וירוסים עם פתרון 5% dextran 1: 1 לריכוז dextran הסופי של 2.5%.
- חנות הפתרון וירוס על הקרח (4 ° C).
- השתמש C57BL למבוגרים עכברים 6J (זכר ונקבה, 20-30 גרם). להרדים את העכברים באמצעות 5% isoflurane (ב O 2 , 1 L / min) ולשמור אותם 23% ishlurane בשאיפה (ב O 2 , 1 L / min) על ידי חרוט האף במהלך הניתוח, בהתאם קצב הנשימה ואת התגובה צביטה כפות.
- לגלח את הגב של החיות עם קוצץ גילוח לנקות את העור עם chlorhexidine 2%.
- במחקרים התאוששות כרונית בצע טכניקה סטרילית קפדנית.
- אם זריקות תחתונות מותני הם להתבצע, לחתוך את העור המכסה את חוליות Th8-L1 עם איזמל לנתק את השריר parvertebral מ חוליות עמוד השדרה Th10-12 באמצעות מספריים.
- הר החיה למסגרת stereotaxic סטנדרטי באמצעות מלחצי השדרה העכבר.
- לגלח את שני הצדדים של lamina של חוליות Th10-12 באמצעות מקדחה שיניים (מקדחה: 0.9 מ"מ, מהירות: 20,000 סל"ד) עד סדקים להופיע.
- הסר שברי עצם סדוק עם מלקחיים לחשוף את פני הגבי של חוט השדרה המותני.
- לחתוך את הדורה על 1 ס"מ באמצעות מחט 30 G נירוסטה מלקחיים.
- הסר את הממברנה atlanto-occitital של cisterna מגנה באמצעות מחט נירוסטה 23G ו מלקחיים.
- נקו את אתר החתך של כל רקמות ופסולת עצם באמצעות צמר גפן.
- לחתוך את הדורה על 2-3 מ"מ באמצעות מחט 30 G נירוסטה מלקחיים.
2. פתיחת קרום Pial והכנסת מחט תת-קרקעית עבור משלוח AAV9
- הר 34 G מחט חודר מחט לתוך זרוע Z של מניפולטור XYZ באמצעות מחזיק נימי זכוכית ( איור 1A ו- B ).
הערה: כדי לייצר את המחט חודר פיה, קצה משופע המקורי של מחט 34G הוא חידד באמצעות beveller נימי זכוכית עם צלחת שוחקים יהלום - גס (5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר עצה הגדלים) וזווית שחיקה של15 - 20 °. קצה המחט (1 מ"מ אורך, נמדד מהקצה) הוא כפוף בעדינות אז על 90 מעלות ( איור 1B , הכנס שמאל). - באמצעות היקף ניתוח כירורגי, מוגדר הגדלה 8-10 X, לחדור פיא עם מחט חודר פיה על ידי 1 מ"מ ( איור 1C ) באמצעות X- זרוע.
- שמור את הזווית של המחט חודר אל משטח רקמות 5-10 מעלות.
- לאחר פתיחת הפיה, להסיר את המחט חודר פיה אופקית מן החלל תת-קרקעית ( איור 1 ד ') באמצעות X- הזרוע.
הערה: זכור את האתר החודר על ידי ציון דרך, כגון כלי דם. - טען מחט הזרקת 36G קהה עם AAV9-UBI-GFP וירוס באמצעות microsyringe 50 μL מחובר המחט הזרקת עם PE-10 או PE-20 צינורות.
- הר את המחט לתוך זרוע Z של מניפולטור XYZ השני ( איור 1 א B ) באמצעות מחזיק זכוכית נימי ( איור 1 ב , להוסיף ימין).
הערה: כדי לייצר את מחט הזריקה AAV9 subpial, קצה קהה של מחט G 36 מלוטש באמצעות beveller נימי זכוכית עם צלחת שוחקים יהלום - גס (5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר עצה הגדלים) כדי להסיר את הקצוות החדים. קצה המחט (2-3 מ"מ אורך, נמדד מהקצה) הוא אז כפוף בעדינות על 90 מעלות. מחט הזרקת פיא ומחט הזרקת מוחדר לתוך 1-2 ס"מ אורך 20G שפופרת נירוסטה צינורות (10 מ"מ מקצה המחט) מודבק אפוקסי. השימוש של 20 G (0.91 מ"מ קוטר) צינורות נדרש עבור מצורף מאובטח על הזכוכית נימי בעל. - על ידי מניפולציה של X, Y, ו- Z זרועות של מניפולטור השני, למקם את קצה המחט הזרקת AAV9 לתוך האתר חודר פיא ולאחר מכן לקדם אותו על 2-3 מ"מ לתוך החלל מתחת לסף דרך פתח קרום pial הקודם באמצעות זרוע X( איור 1E ו F ).
הערה: 1) AAV9-UBI-GFP מוכן על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר 9 , 10 , ואת titers הסופי מותאמים 1.2 x 10 13 עותקים הגנום לכל מ"ל (gc / mL). 2) אין צורך לסמן את האתר של פתיחת pial כי זה מזוהה בקלות ( איור 1D ). - להזריק את AAV9-UBI-GFP (1.5, 3, או 5 μL) לתוך שטח subpial באמצעות microsyringe 50 μL (ראה טבלה 1 עבור קבוצות ניסיוניות).
- הסר את המחט הזרקת מהחלל subpial לאחר הזרקת AAV9-UBI-GFP הוא שלם.
- סגור את השרירים ואת העור באמצעות תפר monofilament 4.0 ו קליפים כירורגיים.
הערה: אין צורך לאטום את החוליה הפתוחה. - אפשר החיות להתאושש על כרית חימום.
- עבור בקרת כאב להזריק Buprenorphine 0.05 מ"ג / ק"ג / sc כל 12 שעות עבור2-3 ימים לאחר הניתוח.
3. קיבוע-זלוף, רקמות Cryoprotection, מכתים Immunofluorescence
- בנקודת זמן קבועה מראש לאחר זריקות AAV9 subpial, להרדים עמוק את העכברים עם פתרון המתת חסד (ראה טבלה של חומרים , 0.3 מ"ל) ו transcardially perfuse אותם עם 20 מ"ל של מלח מלוחים ולאחר מכן 20 מ"ל של paraformaldehyde 4% PBS.
- לנתח את חוט השדרה ואת המוח באמצעות רונגול עצם שלאחר לתקן אותם פורמלדהיד 4% PBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- Cryoprotect את מיתרי השדרה ואת המוח עם סוכרוז 30% PBS עבור מינימום של 5-7 ימים.
- חותכים את העטרה העטרה, או רוחביים / אופקיים חלקים קפואים (30 מיקרומטר עבה) על cryostat ולאחסן אותם PBS ב 4 ° C.
4. מכתים Immunofluorescence של עמוד השדרה ואת המוח חלקים (ראה טבלה של חומרים)
- דגירה חופשית קטעי צף פרימארנוגדנים בין לילה.
- לאחר הדגירה עם נוגדנים ראשוניים, לשטוף את המדורים שלוש פעמים PBS ו לדגור עם ארנבת פלואורסצנטי נגד חמור ארנב, חמור נגד עוף, וחמור אנטי עזים נוגדנים משני.
- הר את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ, יבש אותם בטמפרטורת החדר, ולכסות אותם עם בינוני נגד דהייה.
- לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescence (מטרות: 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8; ו 63X, NA-1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביטוי טרנסג'ני חזק ב- AAV9 מוזרק:
ניתוח של ביטוי transgene (GFP) בקטעי חוט השדרה ב 14 ימים לאחר משלוח AAV9 הראה AAV9- מינון ביטוי GFP תלוי בכל parenchyma השדרה. ראשית, שתי זריקות דו צדדיות 3 μL של AAV9-UBI-GFP מוזרק לתוך החלל התחתון התחתון המותני היו קשורים עם זיהום כמעט מלא של החומר הלבן והאפור של חוט השדרה המותני כולו, המשתרע על החלקים החזה העליון ( איור 2A ו 2B , עמודות שמאל ואמצע). שתי זריקות בינ"ל 1.5 μL של AAV9-UBI-GFP אל החלל התחתון subpial המותניים היו קשורים זיהום דומה כמעט דומה של החומר הלבן והאפור של חוט השדרה המותני כולו (כפי שנראה לאחר זריקות של 3 μL); עם זאת, קטעי באמצע החזה הראו רק נוירונים נגועים מדי פעם (התחת = "xfig"> איור 2 ב, העמודה הימנית). מכתים עם נוגדנים ספציפיים α-motoneuron (ChAT) ו נוירון ספציפי (NeuN) נוגדנים הראה ביטוי GFP עקבי בכל האוכלוסייה של המותניים α-motoneurons ( איור 2C ) ו interneurons מקומי בקרן הגבי ( איור 2 ד ), אזור ביניים ( איור 2E ), וקרן הגחון ( איור 2F ). שנית, שתי זריקות צוואר הרחם של AAV9 דו חמצני (5 μL עבור כל זריקה) הוביל ביטוי GFP דומה החומר הלבן והאפור של חוט השדרה הצוואר כולו (חומר אפור ולבן) ובקטעים החזה העליון ( איור 3 א ו 3 ב ) . ניתוח של חלקי חוט השדרה המותני של בעלי חיים אותו הראה צפיפות גבוהה של GFP + אקסונים יורד מסתיים באזור של המותני GFP שלילי α-motoneurons ו interneurons ( איור 3Cו -3 D ). האספקה של שני צוואר הרחם דו-צדדית ושתי זריקות גב תחתון דו-צדדיות של AAV9 (5 μL עבור כל זריקה) קשורה לביטוי ה- GFP בחוט השדרה כולו, מקטעי הצוואר הרחבים לקצוות המקדשים, והיו נוכחות הומוגנית בחומר הלבן והאפור ( איור 3E - 3H ).
מדרדר ואנטרוגראדי ביטוי בתיווך טרנסג'ן בתיווך מוטורי ומרכזי חישה סופראספינליים:
ביטוי GFP נרחב בחוט השדרה המותני או צוואר הרחם לאחר משלוח AAV9 subpial היה מזוהה עם retrograde חזון ו anterograde זיהום בתיווך GFP חיוביות ב אקסונים יורד supraspinal ואת נוירונים המוקרנים שלהם ב אקסונים ומסופים של שטחים עולה ( איור 4 ). לפיכך, אינטנסיבי GFP positivity נראתה נוירונים מקומי במבנה הרשתית (RF), גרעין ruber (NR), וקליפת המוח (MC) ( איור 4B - 4D ). באופן דומה, ברור Gore immunoreactivity היה לראות את המסופים של spinocerebellar (SCT), spinoreticular, ו spinothalamic שטחי (STT) ( איור 4B - 4D ).
איור 1 : התקנה ניסיונית לבצע הזרקות תת-עמודיות בעמוד השדרה של עכבר למבוגרים. ( א ) לבצע זריקות תת עמודיות בעכברים בוגרים, שני מניפולטורים XYZ נפרדים משמשים (I ו- II). ( ב ) זרוע Z של כל מניפולטור מחזיק מחזיק נימי זכוכית. בעל נימי אחד מחזיק את המחט הזוויתית המחוללת 34 G, והאחרת מחזיקה את המחט הזקופה של G 36. ( C , D , E ו- F) תמונות המתארות את המיקום של מחט חדירה פיא רק לאחר לנקב פיא ( C : החומר דורה כבר הוסרו), לאחר הסרת מחט חודר פיא ( D ), לאחר החדרת קצה מחט הזריקה subpial ( E ), ולאחר לקדם את מחט הזרקת subpial 3 מ"מ לתוך שטח subpial ( F ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : ביטוי השדרה Parnchymal GFP פוטנציאלי לאחר מותני Subbial AAV9-UBI-GFP משלוח ב עכברים למבוגרים. ( A ) שתי זריקות דו צדדיות של AAV9-UBI-GFP (1.5 או 3 זריקות μL כל אחד) נמסרו לתוך המותניים העליונהUbpial שטח, ובעלי חיים היו זלוף קבוע 14 ימים לאחר משלוח AAV9. ( ב ) ביטוי GFP אינטנסיבי האפור (בתוך אזור מנוקד) וחומר לבן, המשתרע מן המותני אל החלקים החזה העליון, ניתן לראות בעלי חיים מוזרק עם 3 + 3 μL של AAV9 (עמודות שמאל באמצע). ( C, D, E, ו F ) Co מכתים של חלקים חוט השדרה רוחבי נלקח מן הגדלה המותני בבעלי חיים מוזרק עם 3 + 3 μL של AAV9 להראות ביטוי GFP כמעט בכל צ'אט (α-motoneuron סמן), positive α- מונטונורונים ( C ו- F ) ו- interneons חיובי NeuN בקרן הגבי ( D ) ואזור ביניים ( E ). סולם ברים = 1000 מיקרומטר (B); 30 מיקרומטר (C); 100 מיקרומטר (DF). DH: קרן הגבי; LV: lamina V; VH: קרן הגחון. אנא לחץ כאן כדי לראות שם גדולRsion של דמות זו.
איור 3: השוואה של הביטוי GFP השדרה לאחר השדרה צוואר הרחם מתחת הצוואר לעומת עמוד השדרה הצוואר הצוואר בתוספת התחתונה התחתונה AAV9-UBI-GFP משלוח ב עכברים למבוגרים. ( A, B, C ו- D ) חתך אופקי לאורך כל אורך חוט השדרה בבעל חיים שקיבל בעבר זריקות צוואר הרחם העליון צוואר הרחם של AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL). ביטוי GFP אינטנסיבי החומר הלבן והאפור באזור צוואר הרחם ניתן לראות ( ב ). ב חוט השדרה המותני, צפיפות גבוהה של GFP + אקסונים יורד ב funiculus לרוחב (LF) ואת החומר האפור בין NeuN חיובי אבל GFP שלילי נוירונים ניתן לזהות ( C ו- D ). ( E, F, G, ו- H אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4
| קבוצות ניסוי | אתר / רמת משלוח AAV9 (*) | נפח AAV9 פצע, קצב עירוי | זמן הישרדות | ניתוח רקמות |
| קבוצה A (n = 7) | C2 (דו-צדדי) | 5 μL / 5 דקות | 14 ימים | המוח + חוט השדרה |
| קבוצה B (n = 12) | L1-L2 (דו-צדדי) | 1.5 μL או 3μL, 60 שניות / μL | 14 ימים | המוח + חוט השדרה |
| קבוצה C (n = 6) | C2 + L1-L2 (דו-צדדי בכל רמה) | 5 μL / 5 דקות | 14 ימים | עמוד שדרה |
| * - דו צדדי= שתי זריקות subpial אחד מועבר לתוך ימין אחד לשטח השמאלי subpial של קטע מוזרק (ים) מבוצעות. | ||||
טבלה 1: קבוצות ניסוייות. כל הניסויים בוצעו עכברים C57BL בוגרים / 6J.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר הנוכחי מתאר טכניקה של משלוח וקטורי (AAV9) במבוגרים עכברים. כפי שמוצג בסרטון הנלווה, ניתן להשתמש בגישה זו ובטכניקה זו באופן יעיל, בתנאי שהמכשירים הדרושים והמחט החודרת ומחט הזריקה התת - קרקעית מיוצרים כראוי, בהתאם למפרטים שנקבעו ונבדקו.
משתנים טכניים קריטיים בביצוע הזרקה תת-קרקעית עקבית ובטוחה בעכברים:
כפי שהוכח, זריקה subpial יכול בקלות להתבצע בעכברים הרדים מבוגרים לאחר laminectomy צוואר הרחם הגב או המותני. ישנם מספר משתנים טכניים קריטיים המגדירים את ההצלחה של טכניקת הזרקה subpial. ראשית, קצה של 34 G מחט חודר מחט צריך להיות חידד באופן עקבי באמצעות beveller כדי להבטיח את לנקב חלקה של הפיא. כל חוסר עקביות בטכניקה על איך מחט הוא חידד יכול להוביל difficuLties במהלך החדירה פיא ו / או יכול לגרום פגיעה בעמוד השדרה באמצעות כוח רב מדי כדי לנקב את הפיא. בנסיבות רגילות (כפי שמוצג בסרטון ובאיור 1C ו- D ), האתר של פתיחת הפיא אינו מראה סימן לחוט של חוט השדרה או לדימום תת-דופי. במקרים מסוימים, כמה דימום subpial ניתן לראות, אבל זה נמצא לא להיות קשור עם תפקוד לקויי של נוירולוגיה או ביטוי גנים שונה לאחר משלוח AAV9. שנית, חשוב לשמור על אתר כירורגי ללא דם לאחר הדורה מוסר באמצעות electrocautery. כל שאריות דם ספורות יכול לטשטש את זיהוי אמין של משטח הפיא, גם אם מיקרוסקופ כירורגי משמש. כפי שמוצג באיור 1C-F , אתר ללא laminectomy ללא דם ניתן לשמור ביעילות באמצעות חתיכות קטנות קצף ג'ל כדי לכסות את החוליה laminectomized ואת הרקמה הרכה שמסביב. שלישית, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולם המיקום הנכון של בעלי הרדים לתוךאת עמוד השדרה ואת immobilization של עמוד השדרה באמצעות מהדקים בעמוד השדרה. שימוש בלחץ רב מדי במהלך המיקום של מהדק השדרה יכול לגרום לקרע בחוליות; שימוש בלחץ לא מספיק יכול להוביל להתרפות פרוגרסיבית של החוליה משותקת, אשר בדרך כלל קורה פעם מקדחה שיניים משמש לביצוע laminectomy.
נפח subfially מוזרק AAV9 בקורלציה עם גודל הביטוי transgene rostro- הזנב. לפיכך, השימוש בשתי זריקות דו-צדדיות תת-קרקעיות AAV9 דו-צדדיות (3 + 3 μL או 5 + 5 μL) היה קשור לביטוי GFP עקבי בכל החומר האפור המותני והלבן, המתפשט עד לפלחי החזה העליונים. היתה שונות מינימלית בין בעלי חיים בשימוש. AAV9 כרכים הזרקה של 1.5 + 1.5 μL הוביל ביטוי GFP דומה במגזרים מקומי באזור של זריקות; עם זאת, התפשטות הנגיף ואת הביטוי GFP שהתקבל היה מוגבל במגזרים החזה ( הגבלה של ג 'ין משלוח טכניקה: יישומים עתידיים של Subpiאל ג 'ין משלוח טכניקה: לדוגמה, על ידי שימוש ווקטורים השתקת shRNA, זה צפוי כי ירידה יעילה מאוד בביטוי של גנים מוטציה ( למשל, SOD במקרה של הצורה בירושה של ALS) יושג לאורך חוט השדרה, כמו גם spinally - ייצור גרעיני מנוע במוח. שְׁנִיָה,בגלל זיהום יעיל של אקסונים של חומר השדרה הלבן, גנים תרפויטיים ( למשל, קידוד גורמי גדילה) יכולים להיות מוגברת כדי לקדם נביטה אקסונאלית בחיות שנפגעו בטראומה. שלישית, על ידי מניפולציה של נפח או titer של הנגיף נמסר subpially, כמו גם באתר הזרקת subpial, הביטוי של transgene יכול להיות ממוקד לאזור דיסקרטית של חוט השדרה ( למשל, קרן חד צדדית). ביטוי טרנסגני מקומי יכול לשמש לטיפול בכאב או בשריר של שינוי בשריר-שריר על-ידי הגדלת מערכות נוירוטרנסמיטר מעכבות ( למשל, GABA) או מעכבים מערכות מעוררות ( למשל, קולטן גלוטמט מערכת מצמידים). רביעית, בנוסף למסירה AAV, מולקולות אחרות או וקטורים עם מחסור דם חמור מחסום המוח ( למשל, מיקרו RNA) סביר להניח יועברו בצורה יעילה יותר לתוך פרנכימה בעמוד השדרה לאחר משלוח subpial. אלה יכולים להיות יעיל נבדק על ידי usinאת הטכניקה המתוארת בכתב יד זה. לבסוף, כפי שהוכח במחקר הנוכחי, הטכניקה subpial יכול לשמש בהצלחה עכברים בוגרים עם ממוצע bodyweights (BW) בין 20 ל 30 גרם. לכן, סביר להניח כי באותה טכניקה הגדרה ניסיונית ניתן להשתמש במינים בעלי חיים אחרים עם BW דומה ( למשל, Sprague-Dawley (SD) עכברוש גורים). BW של P6 ו P21 חולדות SD הוא סביב 17 ו - 62 גרם, בהתאמה. שימוש גורי עכברוש במהלך השלב המוקדם של התפתחות שלאחר הלידה יכול להיות כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של הגן הספציפי או downregulation בפיתוח של מעגלים עצביים בעמוד השדרה ועיבוד סנסורי ומנוע.
אחת המגבלות היחסיות של טכניקת הזרקה מתחת לאדמה (בהשוואה למסירה תוך-intrathecal) היא טבע פולשני יותר של גישה זו כאשר laminectomy הגבי חייב להתבצע כדי לאפשר גישה אל פני הגבי של חוט השדרה. עם זאת, ביטוי transgene עוצמה לראות את כל חוט השדרה במרכזי המוח supraspinal נראה להוכיח את היתרון הברור על משלוח AAV intrathecal, אשר מאופיין ביטוי טרנסגני סלקטיבי subpopulation של α-motoneurons ו afferents העיקרי (אבל לא קיים ב נוירונים של laminae חוט השדרה עמוק) 8 .
באופן דומה, כפי שהוכח במחקרים קודמים עכברים בוגרים וחזירים, ביטוי transgene יעיל ביותר יכול להיות מושג בחומר השדרה לבן ואפור בעכברים בוגרים באמצעות משלוח AAV9 subpial. בנוסף, בגלל הממדים הקטנים יחסית (במיוחד אורך) של חוט השדרה של העכבר, אספקת AAV9 רק שתי רמות חוט השדרה (צוואר הרחם העליון העליון המותני) מספיקה כדי להוביל כמעט להשלים את חוט השדרה זיהום. למאפיין זה יכולות להיות השלכות חשובות על תכנון גישות טיפוליות ספציפיות לשינוי המחלה על-ידי השתקת גנים ממוקדים או upregulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מרטין Marsala הוא מייסד שותף של Neurgain Technologies, Inc (סן דייגו, ארה"ב).
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק SANPORC ו ALSA קרן (מרטין מרסלה); תוכנית הקיימות הלאומית, מספר פרויקט LO1609 (משרד החינוך הצ'כי, הנוער והספורט); ו RVO: 67985904 (סטפן Juhas ו Jana Juhasova).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
