Summary

La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes

Published: July 13, 2017
doi:

Summary

L'objectif de la présente étude était de développer et de valider la puissance et la sécurité de la délivrance de gènes médiés par le virus 9 associé à l'adéno-lésion spinale (AAV9) en utilisant une nouvelle technique de délivrance de gène subpial chez des souris adultes.

Abstract

Le développement réussi d'une technique de délivrance de vecteur de virus adéno-associé subpial 9 (AAV9) chez des rats et des cochons adultes a été signalé précédemment. En utilisant des cathéters en polyéthylène (PE-10 ou PE-5) placés sous le point de vue de l'AAV9, on a démontré une expression efficace du transgène à travers le parenchyme rachidien (matière blanche et grise) dans les segments de la colonne vertébrale injectés subtilement. En raison de la vaste gamme de modèles de souris transgéniques de maladies neurodégénératives, il existe un fort désir de développer une technique de transfert de vecteur cible ciblée du système nerveux central puissant (SIC) chez des souris adultes. En conséquence, la présente étude décrit le développement d'un dispositif de délivrance de vecteur sous-viral de la colonne vertébrale et d'une technique permettant une délivrance sûre et efficace d'AAV9 de la colonne vertébrale chez des souris adultes C57BL / 6J. Chez les souris épieillées et anesthésiées, la pia-mère (cervical 1 et le segment segmentaire lombaire 1-2) a été incisé avec une aiguille pointue de 34 G en utilisant un manipulateur XYZ. Une deuxième XYZ maLe nipulateur a ensuite été utilisé pour avancer une aiguille 36G émoussée dans l'espace sous-espace lombaire et / ou cervical. Le vecteur AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 copies du génome (gc)) codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) a ensuite été injecté subtilement. Après les injections, la fonction neurologique (moteur et sensorielle) a été évaluée périodiquement, et les animaux ont été fixés par perfusion 14 jours après la délivrance d'AAV9 avec du paraformaldéhyde à 4%. L'analyse des sections de la moelle épinière horizontale ou transversale a montré une expression du transgène dans toute la moelle épinière, tant en matière grise que blanche. De plus, une expression intense de GFP récidiviste a été observée dans les axones moteurs et les neurones descendants dans le cortex moteur, le noyau nucléaire et la formatio reticularis. Aucun dysfonctionnement neurologique n'a été noté chez aucun animal. Ces données montrent que la technique de délivrance du vecteur sous-viral peut être utilisée avec succès chez la souris adulte, sans causer de lésions de la moelle épinière liée à la procédure, et est associée à un transgène très efficacePendant tout le neuraxis rachidien.

Introduction

L'utilisation de vecteurs d'AAV pour traiter une variété de troubles neurodégénératifs de la moelle épinière et du SNC devient une plate-forme bien acceptée pour réguler efficacement ou faire taire l'expression des gènes d'intérêt. L'une des principales limites à l'utilisation plus efficace de cette technologie pour traiter les troubles du SNC et de la moelle épinière est la capacité limitée de délivrer un vecteur (s) d'AAV au cerveau profond ou au parenchyme de la moelle épinière chez les mammifères adultes.

Il a été démontré, par exemple, que la distribution systémique d'AAV9 chez les rongeurs adultes, les chats ou les primates non humains n'est que modérément efficace pour induire l'expression du transgène dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière 1 , 2 , 3 . La délivrance intrathécale plus efficace des vecteurs AAV9 a également montré qu'il ne conduisait qu'à une expression limitée du transgène dans des pools de neurones anatomiquement définis. Plus précisément, ce sont des démonsQue l'administration d'AAV9 intracellulaire cisternal ou lumbo-sacré chez des primates, des porcs ou des rongeurs non humains conduit à un niveau élevé d'expression du transgène dans les motoneurones α-spinales et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale segmentaire. Cependant, une expression minimale ou nulle des interneurones de la colonne vertébrale ou des axones ascendants ou descendants dans la matière blanche est vue 4 , 5 , 6 , 7 . Collectivement, ces données montrent qu'une barrière biologique-anatomique hautement efficace existe, ce qui empêche la diffusion d'AAV délivré par voie intrathécale dans un parenchyme rachidien plus profond.

Dans une étude antérieure portant sur des rats adultes et des porcs, une nouvelle technique de transmission de vecteur subfaire a été développée 8 . À l'aide de cette approche, une expression du transgène hautement efficace et multi-segmentaire a été démontrée après une administration de l'AAV9 subpial à un seul bolus. Une expression intensive des GFP a été constamment observéeDans les neurones, les cellules gliales et les axones descendants / ascendants à travers les segments de la colonne vertébrale injectés. Cette étude a démontré pour la première fois que la pia-mère représente la principale barrière limitant la diffusion efficace d'AAV9 dans le parenchyme rachidien de l'espace intrathécal. Bien que cette technique développée précédemment et son dispositif d'injection subpial soit relativement facile à utiliser chez les grands rongeurs (comme les rats) ou les cochons adultes, le système ne convient pas aux petits animaux, comme les souris adultes. En raison du nombre élevé de modèles de souris transgéniques disponibles d'une variété de troubles neurodégénératifs, il existe un besoin évident de développement d'une technique de délivrance de vecteur spinale parenchymateuse efficace chez la souris. La disponibilité d'une telle technique permettrait d'étudier l'effet d'un inhibition spécifique des gènes ( p. Ex., En utilisant l'ARNm) ou une régulation positive en utilisant des cellules non spécifiques ( p. Ex. Cytomégalovirus-CMV ou ubiquitine) ou spécifiques de cellules ( p. Ex ., Synapsine ou gliale Acide fibrillaireProtéines (GFAP)) pendant le développement post-natal tôt ou dans des conditions malades.

En conséquence, dans la présente étude, nous avons développé et validé un système miniature de distribution de vecteurs subtiles qui peut être utilisé efficacement chez la souris adulte. De même, comme dans les études antérieures sur le rat et le porc, ce travail démontre une expression puissante du transgène dans tout le parenchyme rachidien après une délivrance de l'AAV9 subpial à bol unique chez la souris. La simplicité de cette approche, la très bonne tolérance des souris injectées à la transmission de l'AAV9 subpériale et la forte puissance de l'expression du transgène dans le parenchyme de la colonne vertébrale suggèrent que cette technique peut être mise en œuvre efficacement dans n'importe quel milieu de laboratoire et utilisée dans des expériences ciblant l'expression des gènes rachidiens.

Protocol

Ces études ont été réalisées dans le cadre d'un protocole approuvé par le comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Californie, à San Diego, et étaient conformes à l'Association pour l'évaluation des directives sur les soins de l'animal de laboratoire à des fins animales. Toutes les études ont été effectuées de manière à minimiser la taille du groupe et la souffrance des animaux. 1. Préparation générale de…

Representative Results

Expression transgénique efficace dans les segments Subpially AAV9-injectés: L'analyse de l'expression du transgène (GFP) dans les sections de la moelle épinière à 14 jours après l'accouchement de l'AAV9 a montré une expression de la GFP dépendante de la dose AAV9 tout au long du parenchyme de la colonne vertébrale. Tout d'abord, deux injections bilatérales de 3 μL d'AAV9-UBI-GFP injectées dans l'espace subpial lombair…

Discussion

L'étude actuelle décrit une technique de délivrance de vecteur subpial (AAV9) chez des souris adultes. Comme cela a été démontré dans la vidéo qui l'accompagne, cette approche et cette technique peuvent être utilisées efficacement, à condition que les instruments requis et l'aiguille pia-penetrante et l'aiguille d'injection subpienne soient correctement fabriquées, conformément aux spécifications établies et testées.

Variables techniques critiques …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par la subvention de la Fondation SANPORC et ALSA (Martin Marsala); Le programme national de durabilité, numéro de projet LO1609 (Ministère tchèque de l'éducation, de la jeunesse et des sports); Et RVO: 67985904 (Stefan Juhas et Jana Juhasova).

Materials

C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50μl Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1000U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

References

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
  4. Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
  5. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
  6. Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
  7. Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
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  10. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).

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Cite This Article
Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).

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