La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes
Summary
L'objectif de la présente étude était de développer et de valider la puissance et la sécurité de la délivrance de gènes médiés par le virus 9 associé à l'adéno-lésion spinale (AAV9) en utilisant une nouvelle technique de délivrance de gène subpial chez des souris adultes.
Abstract
Le développement réussi d'une technique de délivrance de vecteur de virus adéno-associé subpial 9 (AAV9) chez des rats et des cochons adultes a été signalé précédemment. En utilisant des cathéters en polyéthylène (PE-10 ou PE-5) placés sous le point de vue de l'AAV9, on a démontré une expression efficace du transgène à travers le parenchyme rachidien (matière blanche et grise) dans les segments de la colonne vertébrale injectés subtilement. En raison de la vaste gamme de modèles de souris transgéniques de maladies neurodégénératives, il existe un fort désir de développer une technique de transfert de vecteur cible ciblée du système nerveux central puissant (SIC) chez des souris adultes. En conséquence, la présente étude décrit le développement d'un dispositif de délivrance de vecteur sous-viral de la colonne vertébrale et d'une technique permettant une délivrance sûre et efficace d'AAV9 de la colonne vertébrale chez des souris adultes C57BL / 6J. Chez les souris épieillées et anesthésiées, la pia-mère (cervical 1 et le segment segmentaire lombaire 1-2) a été incisé avec une aiguille pointue de 34 G en utilisant un manipulateur XYZ. Une deuxième XYZ maLe nipulateur a ensuite été utilisé pour avancer une aiguille 36G émoussée dans l'espace sous-espace lombaire et / ou cervical. Le vecteur AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 copies du génome (gc)) codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) a ensuite été injecté subtilement. Après les injections, la fonction neurologique (moteur et sensorielle) a été évaluée périodiquement, et les animaux ont été fixés par perfusion 14 jours après la délivrance d'AAV9 avec du paraformaldéhyde à 4%. L'analyse des sections de la moelle épinière horizontale ou transversale a montré une expression du transgène dans toute la moelle épinière, tant en matière grise que blanche. De plus, une expression intense de GFP récidiviste a été observée dans les axones moteurs et les neurones descendants dans le cortex moteur, le noyau nucléaire et la formatio reticularis. Aucun dysfonctionnement neurologique n'a été noté chez aucun animal. Ces données montrent que la technique de délivrance du vecteur sous-viral peut être utilisée avec succès chez la souris adulte, sans causer de lésions de la moelle épinière liée à la procédure, et est associée à un transgène très efficacePendant tout le neuraxis rachidien.
Introduction
L'utilisation de vecteurs d'AAV pour traiter une variété de troubles neurodégénératifs de la moelle épinière et du SNC devient une plate-forme bien acceptée pour réguler efficacement ou faire taire l'expression des gènes d'intérêt. L'une des principales limites à l'utilisation plus efficace de cette technologie pour traiter les troubles du SNC et de la moelle épinière est la capacité limitée de délivrer un vecteur (s) d'AAV au cerveau profond ou au parenchyme de la moelle épinière chez les mammifères adultes.
Il a été démontré, par exemple, que la distribution systémique d'AAV9 chez les rongeurs adultes, les chats ou les primates non humains n'est que modérément efficace pour induire l'expression du transgène dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière 1 , 2 , 3 . La délivrance intrathécale plus efficace des vecteurs AAV9 a également montré qu'il ne conduisait qu'à une expression limitée du transgène dans des pools de neurones anatomiquement définis. Plus précisément, ce sont des démonsQue l'administration d'AAV9 intracellulaire cisternal ou lumbo-sacré chez des primates, des porcs ou des rongeurs non humains conduit à un niveau élevé d'expression du transgène dans les motoneurones α-spinales et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale segmentaire. Cependant, une expression minimale ou nulle des interneurones de la colonne vertébrale ou des axones ascendants ou descendants dans la matière blanche est vue 4 , 5 , 6 , 7 . Collectivement, ces données montrent qu'une barrière biologique-anatomique hautement efficace existe, ce qui empêche la diffusion d'AAV délivré par voie intrathécale dans un parenchyme rachidien plus profond.
Dans une étude antérieure portant sur des rats adultes et des porcs, une nouvelle technique de transmission de vecteur subfaire a été développée 8 . À l'aide de cette approche, une expression du transgène hautement efficace et multi-segmentaire a été démontrée après une administration de l'AAV9 subpial à un seul bolus. Une expression intensive des GFP a été constamment observéeDans les neurones, les cellules gliales et les axones descendants / ascendants à travers les segments de la colonne vertébrale injectés. Cette étude a démontré pour la première fois que la pia-mère représente la principale barrière limitant la diffusion efficace d'AAV9 dans le parenchyme rachidien de l'espace intrathécal. Bien que cette technique développée précédemment et son dispositif d'injection subpial soit relativement facile à utiliser chez les grands rongeurs (comme les rats) ou les cochons adultes, le système ne convient pas aux petits animaux, comme les souris adultes. En raison du nombre élevé de modèles de souris transgéniques disponibles d'une variété de troubles neurodégénératifs, il existe un besoin évident de développement d'une technique de délivrance de vecteur spinale parenchymateuse efficace chez la souris. La disponibilité d'une telle technique permettrait d'étudier l'effet d'un inhibition spécifique des gènes ( p. Ex., En utilisant l'ARNm) ou une régulation positive en utilisant des cellules non spécifiques ( p. Ex. Cytomégalovirus-CMV ou ubiquitine) ou spécifiques de cellules ( p. Ex ., Synapsine ou gliale Acide fibrillaireProtéines (GFAP)) pendant le développement post-natal tôt ou dans des conditions malades.
En conséquence, dans la présente étude, nous avons développé et validé un système miniature de distribution de vecteurs subtiles qui peut être utilisé efficacement chez la souris adulte. De même, comme dans les études antérieures sur le rat et le porc, ce travail démontre une expression puissante du transgène dans tout le parenchyme rachidien après une délivrance de l'AAV9 subpial à bol unique chez la souris. La simplicité de cette approche, la très bonne tolérance des souris injectées à la transmission de l'AAV9 subpériale et la forte puissance de l'expression du transgène dans le parenchyme de la colonne vertébrale suggèrent que cette technique peut être mise en œuvre efficacement dans n'importe quel milieu de laboratoire et utilisée dans des expériences ciblant l'expression des gènes rachidiens.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'étude actuelle décrit une technique de délivrance de vecteur subpial (AAV9) chez des souris adultes. Comme cela a été démontré dans la vidéo qui l'accompagne, cette approche et cette technique peuvent être utilisées efficacement, à condition que les instruments requis et l'aiguille pia-penetrante et l'aiguille d'injection subpienne soient correctement fabriquées, conformément aux spécifications établies et testées.
Variables techniques critiques …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la subvention de la Fondation SANPORC et ALSA (Martin Marsala); Le programme national de durabilité, numéro de projet LO1609 (Ministère tchèque de l'éducation, de la jeunesse et des sports); Et RVO: 67985904 (Stefan Juhas et Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
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