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Neuroscience

La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes

doi: 10.3791/55770 Published: July 13, 2017

Summary

L'objectif de la présente étude était de développer et de valider la puissance et la sécurité de la délivrance de gènes médiés par le virus 9 associé à l'adéno-lésion spinale (AAV9) en utilisant une nouvelle technique de délivrance de gène subpial chez des souris adultes.

Abstract

Le développement réussi d'une technique de délivrance de vecteur de virus adéno-associé subpial 9 (AAV9) chez des rats et des cochons adultes a été signalé précédemment. En utilisant des cathéters en polyéthylène (PE-10 ou PE-5) placés sous le point de vue de l'AAV9, on a démontré une expression efficace du transgène à travers le parenchyme rachidien (matière blanche et grise) dans les segments de la colonne vertébrale injectés subtilement. En raison de la vaste gamme de modèles de souris transgéniques de maladies neurodégénératives, il existe un fort désir de développer une technique de transfert de vecteur cible ciblée du système nerveux central puissant (SIC) chez des souris adultes. En conséquence, la présente étude décrit le développement d'un dispositif de délivrance de vecteur sous-viral de la colonne vertébrale et d'une technique permettant une délivrance sûre et efficace d'AAV9 de la colonne vertébrale chez des souris adultes C57BL / 6J. Chez les souris épieillées et anesthésiées, la pia-mère (cervical 1 et le segment segmentaire lombaire 1-2) a été incisé avec une aiguille pointue de 34 G en utilisant un manipulateur XYZ. Une deuxième XYZ maLe nipulateur a ensuite été utilisé pour avancer une aiguille 36G émoussée dans l'espace sous-espace lombaire et / ou cervical. Le vecteur AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 copies du génome (gc)) codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) a ensuite été injecté subtilement. Après les injections, la fonction neurologique (moteur et sensorielle) a été évaluée périodiquement, et les animaux ont été fixés par perfusion 14 jours après la délivrance d'AAV9 avec du paraformaldéhyde à 4%. L'analyse des sections de la moelle épinière horizontale ou transversale a montré une expression du transgène dans toute la moelle épinière, tant en matière grise que blanche. De plus, une expression intense de GFP récidiviste a été observée dans les axones moteurs et les neurones descendants dans le cortex moteur, le noyau nucléaire et la formatio reticularis. Aucun dysfonctionnement neurologique n'a été noté chez aucun animal. Ces données montrent que la technique de délivrance du vecteur sous-viral peut être utilisée avec succès chez la souris adulte, sans causer de lésions de la moelle épinière liée à la procédure, et est associée à un transgène très efficacePendant tout le neuraxis rachidien.

Introduction

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L'utilisation de vecteurs d'AAV pour traiter une variété de troubles neurodégénératifs de la moelle épinière et du SNC devient une plate-forme bien acceptée pour réguler efficacement ou faire taire l'expression des gènes d'intérêt. L'une des principales limites à l'utilisation plus efficace de cette technologie pour traiter les troubles du SNC et de la moelle épinière est la capacité limitée de délivrer un vecteur (s) d'AAV au cerveau profond ou au parenchyme de la moelle épinière chez les mammifères adultes.

Il a été démontré, par exemple, que la distribution systémique d'AAV9 chez les rongeurs adultes, les chats ou les primates non humains n'est que modérément efficace pour induire l'expression du transgène dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière 1 , 2 , 3 . La délivrance intrathécale plus efficace des vecteurs AAV9 a également montré qu'il ne conduisait qu'à une expression limitée du transgène dans des pools de neurones anatomiquement définis. Plus précisément, ce sont des démonsQue l'administration d'AAV9 intracellulaire cisternal ou lumbo-sacré chez des primates, des porcs ou des rongeurs non humains conduit à un niveau élevé d'expression du transgène dans les motoneurones α-spinales et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale segmentaire. Cependant, une expression minimale ou nulle des interneurones de la colonne vertébrale ou des axones ascendants ou descendants dans la matière blanche est vue 4 , 5 , 6 , 7 . Collectivement, ces données montrent qu'une barrière biologique-anatomique hautement efficace existe, ce qui empêche la diffusion d'AAV délivré par voie intrathécale dans un parenchyme rachidien plus profond.

Dans une étude antérieure portant sur des rats adultes et des porcs, une nouvelle technique de transmission de vecteur subfaire a été développée 8 . À l'aide de cette approche, une expression du transgène hautement efficace et multi-segmentaire a été démontrée après une administration de l'AAV9 subpial à un seul bolus. Une expression intensive des GFP a été constamment observéeDans les neurones, les cellules gliales et les axones descendants / ascendants à travers les segments de la colonne vertébrale injectés. Cette étude a démontré pour la première fois que la pia-mère représente la principale barrière limitant la diffusion efficace d'AAV9 dans le parenchyme rachidien de l'espace intrathécal. Bien que cette technique développée précédemment et son dispositif d'injection subpial soit relativement facile à utiliser chez les grands rongeurs (comme les rats) ou les cochons adultes, le système ne convient pas aux petits animaux, comme les souris adultes. En raison du nombre élevé de modèles de souris transgéniques disponibles d'une variété de troubles neurodégénératifs, il existe un besoin évident de développement d'une technique de délivrance de vecteur spinale parenchymateuse efficace chez la souris. La disponibilité d'une telle technique permettrait d'étudier l'effet d'un inhibition spécifique des gènes ( p. Ex., En utilisant l'ARNm) ou une régulation positive en utilisant des cellules non spécifiques ( p. Ex. Cytomégalovirus-CMV ou ubiquitine) ou spécifiques de cellules ( p. Ex ., Synapsine ou gliale Acide fibrillaireProtéines (GFAP)) pendant le développement post-natal tôt ou dans des conditions malades.

En conséquence, dans la présente étude, nous avons développé et validé un système miniature de distribution de vecteurs subtiles qui peut être utilisé efficacement chez la souris adulte. De même, comme dans les études antérieures sur le rat et le porc, ce travail démontre une expression puissante du transgène dans tout le parenchyme rachidien après une délivrance de l'AAV9 subpial à bol unique chez la souris. La simplicité de cette approche, la très bonne tolérance des souris injectées à la transmission de l'AAV9 subpériale et la forte puissance de l'expression du transgène dans le parenchyme de la colonne vertébrale suggèrent que cette technique peut être mise en œuvre efficacement dans n'importe quel milieu de laboratoire et utilisée dans des expériences ciblant l'expression des gènes rachidiens.

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Protocol

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Ces études ont été réalisées dans le cadre d'un protocole approuvé par le comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Californie, à San Diego, et étaient conformes à l'Association pour l'évaluation des directives sur les soins de l'animal de laboratoire à des fins animales. Toutes les études ont été effectuées de manière à minimiser la taille du groupe et la souffrance des animaux.

1. Préparation générale des animaux et de la chirurgie

  1. Avant de commencer la procédure chirurgicale, décongeler le virus (AAV9-UBI-GFP, 5 μl d'aliquotes) 8 . Préparez une solution à 5% de dextrane (10 000 MW) en mélangeant de la poudre de dextrane dans de l'eau distillée. Mélangez la solution de virus avec une solution de dextrane à 1% 1: 1 jusqu'à une concentration finale en dextrane de 2,5%.
    1. Stocker la solution de virus sur de la glace (4 ° C).
  2. Utiliser des souris adultes C57BL / 6J (hommes et femmes, 20 à 30 g). Anesthésier les souris en utilisant 5% d'isoflurane (en O 2 , 1 L / min) et les maintenir à 2-3% d'isoflurane inhalé (en O 2 , 1 L / min) par le cône du nez pendant la chirurgie, selon le taux de respiration et la réponse au pincement des pattes.
  3. Raser le dos des animaux avec des tondeuses à raser et nettoyer la peau avec 2% de chlorhexidine.
  4. Dans les études de récupération chronique, suivre une technique stérile stricte.
  5. Si des injections subpiales lombaires doivent être effectuées, couper la peau en recouvrant les vertèbres Th8-L1 avec un scalpel et détacher le muscle paravertébral des vertèbres rachidiennes Th10-12 à l'aide de ciseaux.
    1. Monter l'animal dans un cadre stéréotaxique standard en utilisant des pinces de la colonne vertébrale de la souris.
    2. Raser les deux côtés de la lame de la vertèbre Th10-12 à l'aide d'une perceuse dentaire (foret: 0,9 mm, vitesse: 20 000 tr / min) jusqu'à ce que les fissures apparaissent.
    3. Enlevez les fragments d'os craqués avec une pince et exposez la surface dorsale de la moelle épinière.
    4. Couper l'ouverture d'environ 1 cm à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable 30 G et d'une pince.
  6. Retirez la membrane atlanto-occipitale de la cisterna magna à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable 23G et d'une pince.
  7. Nettoyer le site d'incision de tout débris tissulaire et osseux à l'aide de coton-tige.
  8. Couper l'estrat d'environ 2-3 mm à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable 30 G et d'une pince.

2. Ouverture de la Membrane Pial et insertion de l'aiguille Subpial pour livraison AAV9

  1. Montez l'aiguille pénétrante pia de 34 G dans le bras Z d'un manipulateur XYZ à l'aide d'un support capillaire en verre ( Figure 1A et B ).
    REMARQUE: Pour fabriquer l'aiguille pia-pénétrante, l'extrémité chanfreinée originale de l'aiguille 34G est aiguisée à l'aide d'un biseau capillaire en verre avec une plaque abrasive en diamant - grossière (tailles de 0,5 μm à 50 μm) et un angle de meulage de15 - 20 °. La pointe de l'aiguille (1 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite doucement pliée à environ 90 ° ( Figure 1B , insert gauche).
  2. En utilisant une portée de dissection chirurgicale, réglée à un grossissement 8-10 X, pénétrer la pia avec l'aiguille pia-pénétrant d'environ 1 mm ( Figure 1C ) en utilisant le bras X.
    1. Garder l'angle de l'aiguille pénétrante sur la surface du tissu à 5-10 °.
  3. Après l'ouverture de la pia, retirez l'aiguille pia-pénétrante à l'horizontale de l'espace sous-espace ( Figure 1 D) à l'aide du bras X.
    REMARQUE: Rappelez-vous le site pénétré par un repère, tel qu'un vaisseau sanguin.
  4. Chargez une aiguille d'injection 36G émoussée avec le virus AAV9-UBI-GFP en utilisant une micro-jambe de 50 μL reliée à l'aiguille d'injection avec des tubes PE-10 ou PE-20.
  5. Montez l'aiguille dans le bras Z d'un deuxième manipulateur XYZ ( Figure 1A B ) à l'aide d'un support capillaire en verre ( Figure 1B , insert droit).
    REMARQUE: Pour fabriquer l'aiguille d'injection subafficelle AAV9, la pointe émoussée d'une aiguille 36 G est polie à l'aide d'un biseau capillaire en verre avec plaque abrasive en diamant - grossière (tailles de 0,5 μm à 50 μm) pour enlever les bords tranchants. La pointe de l'aiguille (2-3 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite pliée doucement à environ 90 °. Les aiguilles d'injection pia-pénétrantes et subpériales sont insérées dans un tube en acier inoxydable esclave 20G de 2 cm de long (10 mm de l'extrémité de l'aiguille) et collées avec de l'époxy. L'utilisation d'un tube de 20 G (0,91 mm de diamètre) est requise pour une fixation sécurisée au support capillaire en verre.
  6. En manipulant les bras X, Y et Z du deuxième manipulateur, positionnez l'extrémité de l'aiguille d'injection AAV9 dans le site pia-pénétré, puis avancez-le environ 2-3 mm dans l'espace sous-espace à travers l'ouverture précédente de la membrane par le biais de la X-bras( Figure 1E et F ).
    NOTE: 1) L'AAV9-UBI-GFP est préparé selon les protocoles 9 , 10 précédemment rapportés, et les titres finaux sont ajustés à 1,2 x 10 13 copies du génome par ml (gc / mL). 2) Il n'est pas nécessaire de marquer le site de l'ouverture du pial car il est facilement identifiable ( Figure 1D ).
  7. Injecter l'AAV9-UBI-GFP (1.5, 3 ou 5 μL) dans l'espace sub-dépistage à l'aide d'une micro-jambage de 50 μL (voir tableau 1 pour les groupes expérimentaux).
  8. Retirez l'aiguille d'injection de l'espace sous-espace après l'achèvement de l'injection AAV9-UBI-GFP.
  9. Fermez le muscle et la peau à l'aide de sutures de monofilaments 4.0 et de clips chirurgicaux.
    REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de sceller la vertèbre ouverte.
  10. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant.
  11. Pour le contrôle de la douleur injecter Buprénorphine 0,05 mg / kg / sc toutes les 12 h pour2-3 jours après la chirurgie.

3. La fixation par perfusion, la cryoprotection tissulaire et la coloration par immunofluorescence

  1. A un point de temps prédéterminé après les injections subatiles d'AAV9, anesthésier profondément les souris avec une solution d'euthanasie (voir la Table des matériaux , 0,3 mL) et les perfuser transcardialement avec 20 ml de solution salée héparinée suivie de 20 ml de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS.
  2. Dissectionnez les cordes et le cerveau de la moelle épinière à l'aide d'un rongeur osseux et postez-les dans du formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C.
  3. Cryoproteger les cordes épineuses et le cerveau avec 30% de saccharose dans du PBS pendant au moins 5 à 7 jours.
  4. Couper les sections congelées coronales, transversales ou longitudinales / horizontales (30 μm d'épaisseur) sur un cryostat et les stocker dans du PBS à 4 ° C.

4. Immunofluorescence Coloration des sections de la moelle épinière et du cerveau (voir la table des matières)

  1. Incuber les sections flottantes en primaireY pendant toute la nuit.
  2. Après incubation avec des anticorps primaires, laver les sections trois fois dans du PBS et incuber avec des anticorps anti-lapin anti-lapin, anti-poulet et anti-chèvre anti-poulet et anti-poulet conjugués à la fluorescence.
  3. Montez les sections sur les lames de microscopie, séchez-les à température ambiante et recouvrez-les avec un milieu anti-décoloré.
  4. Capturez des images à l'aide d'un microscope à fluorescence à épifluorescence (objectifs: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 et 63X, NA-1.4).

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Representative Results

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Expression transgénique efficace dans les segments Subpially AAV9-injectés:
L'analyse de l'expression du transgène (GFP) dans les sections de la moelle épinière à 14 jours après l'accouchement de l'AAV9 a montré une expression de la GFP dépendante de la dose AAV9 tout au long du parenchyme de la colonne vertébrale. Tout d'abord, deux injections bilatérales de 3 μL d'AAV9-UBI-GFP injectées dans l'espace subpial lombaire supérieur ont été associées à une infection presque totale de la matière blanche et grise dans la moelle épinière entière, s'étendant jusqu'aux segments thoraciques supérieurs ( figure 2A Et 2B , colonnes gauche et intermédiaire). Deux injections bilatérales de 1,5 μL d'AAV9-UBI-GFP dans l'espace subpial lombaire supérieur ont été associées à une infection similaire presque complète de la matière blanche et grise dans la moelle épinière entière (comme on l'a vu après des injections de 3 μL); Cependant, les segments mi-thoraciques ne présentaient que des neurones occasionnellement infectés (Ass = "xfig"> Figure 2B, colonne de droite). La coloration avec les anticorps spécifiques de l'α-motoneurone (CHAT) et des neurones spécifiques (NeuN) a montré une expression de GFP cohérente dans toute la population des α-motoneurones lombaires ( Figure 2C ) et des interneurones localisées dans la corne dorsale ( Figure 2D ), zone intermédiaire ( Figure 2E ) et corne ventrale ( figure 2F ). Deuxièmement, deux injections cervicales bilatérales d'AAV9 (5 μL pour chaque injection) ont conduit à une expression GFP similaire dans la matière blanche et grise dans la moelle épinière cervicale (matière grise et blanche) et dans les segments thoraciques supérieurs ( Figure 3A et 3B ) . L'analyse des sections de la moelle épinière lombaire dans les mêmes animaux a montré une forte densité d'axones descendants GFP + se terminant au voisinage des α-motoneurones et des interneurones lombaires GFP-négatifs ( figure 3CEt 3D ). La livraison de deux injections bilatérales cervicales et deux injections lombaires supérieures bilatérales d'AAV9 (5 μL pour chaque injection) était associée à l'expression de la GFP dans toute la moelle épinière, des segments cervical supérieur à sacré et était homogène dans la matière blanche et grise ( Figure 3E- 3H ).

L'expression transgène médiée par le transport rétrograde et antérogène transportée dans les centres sensoriels et moteurs supraspinaux:
L'expression de GFP généralisée dans la moelle épinière lombaire ou cervicale après l'accouchement subalpente de l'AAV9 a été associée à une positivité réelle et antérograde de la GFP médiée par une infection antérograde dans les axones descendants supraspinal et leurs neurones en saillie et dans les axones et les terminaux des parcours ascendants ( figure 4 ). Ainsi, une positivité intense des GFP a été observée dans les neurones localisés dans la formation réticulaire (RF), Nucleus ruber (NR) et cortex moteur (MC) ( Figure 4B- 4D ). De même, une immunoréactivité GFP claire a été observée dans les terminaux des voies spinocérébelleuses (SCT), spinoréticulaires et spinothalamiques (STT) ( Figure 4B- 4D ).

Figure 1
Figure 1 : Configuration expérimentale pour effectuer des injections sous-épines spinales dans une souris adulte. ( A ) Pour effectuer des injections sous-épines spinales chez la souris adulte, deux manipulateurs XYZ séparés sont utilisés (I et II). ( B ) Le bras Z de chaque manipulateur contient un support capillaire en verre. Un support capillaire retient l'aiguille 34 G pia-penetrante et la seconde contient l'aiguille d'injection sous-gonflable 36 G. ( C , D , E et F) Les images qui représentent la position de l'aiguille pia-pénétration juste après la ponction pia ( C , la dureté est déjà enlevée), après retrait de l'aiguille pia-pénétrante ( D ), après l'insertion de la pointe de l'aiguille d'injection subpienne ( E ), et après l'avancement de l'aiguille d'injection subale de 3 mm dans l'espace sous-espace ( F ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Expression de la GFP parenchymateuse de la colonne vertébrale positive après la livraison de la soupape lombaire AAV9-UBI-GFP chez les souris adultes. ( A ) Deux injections bilatérales d'AAV9-UBI-GFP (1,5 ou 3 μL d'injections chacune) ont été introduites dans le lombaire supérieurL'espace ubpial et les animaux ont été fixés par perfusion 14 jours après l'accouchement de l'AAV9. ( B ) L'expression intense de GFP dans le gris (à l'intérieur de la zone en pointillé) et la matière blanche, s'étendant du segment lombaire au segment thoracique supérieur, peut être observée chez les animaux injectés avec 3 + 3 μL d'AAV9 (colonnes de gauche et de milieu). ( C, D, E et F ) La co-coloration des sections transversales de la moelle épinière à partir de l'agrandissement lombaire chez les animaux injectés avec 3 + 3 μL d'AAV9 montre une expression de GFP dans pratiquement tous les marqueurs de α-motoneuron (α- Les motoneurones ( C et F ) et les interneurones NeuN-positives dans la corne dorsale ( D ) et la zone intermédiaire ( E ). Barres d'échelle = 1000 μm (B); 30 μm (C); 100 μm (DF). DH: corne dorsale; LV: lame V; VH: corne ventrale. Cliquez ici pour voir un plus grandDe cette figure.

figure 3
Figure 3: Comparaison de l'expression de la GFP spinale après Spinal Subpial Cervical Versus Spinal Subpial Cervical plus Subpial Lumbar AAV9-UBI-GFP Delivery in Adult Mice. ( A, B, C et D ) Une section horizontale coupe toute la longueur de la moelle épinière chez un animal qui a reçu auparavant des injections subpiennes cervicales supérieures de AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL). On peut voir une expression intense de la GFP dans la matière blanche et grise dans la région cervicale ( B ). Dans la moelle épinière lombaire, une forte densité d'axones descendants GFP + dans le funicule latéral (LF) et la matière grise entre les neurones NeuN-positifs mais GFP-négatifs peuvent être identifiés ( C et D ). ( E, F, G et H Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 Rong: Expression de GFP médiocre et antérogène AAV9-UBI-GFP dans les centres de cerveau et sensoriels. ( A ) Une image de faible puissance représentant la présence d'une positivité intense de GFP dans la moelle épinière cervicale, la moelle épinière, le cérébelle et le cortex moteur (MC). ( B ) Une image à plus haute puissance tirée d'une section sagittale du cerveau et montrant la présence de fluorescence GFP dans les neurones dans la formation réticulaire (RF), le noyau nucléique (NR) et les axones du tractus spino-cérébelleux (SCT). ( C ) Une image de faible puissance tirée des coupes coronales du cerveau montrant la présence de fluorescence GFP dans les neurones pyramidaux dans le cortex moteur (MC) et dans les terminaux du tractus spinothalamique dans les zones des noyaux thalamiques réticulaires (STT). ( D ) Une image de haute puissance démontrant une expression de GFP intense dans les neurones pyramidaux dans le cortex moteur. Barres d'échelle = 2 000 μm (A); 1000 μm (B et C); 60 μm (D).Csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Groupes expérimentaux Site / niveau de livraison AAV9 (*) Volume d'AAV9 inj, taux de perfusion Temps de survie Analyse tissulaire
Groupe A (n = 7) C2 (bilatéral) 5 μL / 5 min 14 jours Cerveau + moelle épinière
Groupe B (n = 12) L1-L2 (bilatéral) 1,5 μL ou 3μL, 60 sec / μL 14 jours Cerveau + moelle épinière
Groupe C (n = 6) C2 + L1-L2 (bilatéral à chaque niveau) 5 μL / 5 min 14 jours Moelle épinière
* - bilatéral= Deux injections subpiales, l'une livrée dans la partie droite et l'espace sous-espace gauche du ou des segments injectés.

Tableau 1: Groupes expérimentaux. Toutes les expériences ont été réalisées chez des souris C57BL / 6J adultes.

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Discussion

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L'étude actuelle décrit une technique de délivrance de vecteur subpial (AAV9) chez des souris adultes. Comme cela a été démontré dans la vidéo qui l'accompagne, cette approche et cette technique peuvent être utilisées efficacement, à condition que les instruments requis et l'aiguille pia-penetrante et l'aiguille d'injection subpienne soient correctement fabriquées, conformément aux spécifications établies et testées.

Variables techniques critiques dans la réalisation d'une injection subpienne cohérente et sûre chez les souris:
Comme démontré, une injection subpienne peut être facilement réalisée chez des souris anesthésiées adultes après une laminectomie cervicale ou lombaire dorsale. Il existe plusieurs variables techniques critiques qui définissent le succès de la technique d'injection subpienne. Tout d'abord, la pointe de l'aiguille pénétrante pia de 34 G doit être nettement affinée à l'aide d'un biseau pour assurer la ponction douce de la pia. Toute incohérence dans la technique sur la façon dont l'aiguille est aiguisée peut entraîner des difficultésPendant la pia pénétration et / ou peut provoquer une lésion de la colonne vertébrale en utilisant trop de force pour percer la pia. Dans des circonstances normales (comme le montre la vidéo et sur les figures 1C et D ), le site de l'ouverture pia ne montre aucun signe de lésion de la moelle épinière ou de saignement subpial. Dans certains cas, on peut observer un saignement subpial, mais on a constaté qu'il ne s'agissait pas d'un dysfonctionnement neurologique ou d'une modification de l'expression des gènes après l'accouchement de l'AAV9. Deuxièmement, il est important de garder le site chirurgical exempt de sang après la fin de la dureté en utilisant une électrocauterie. Tout résidu de sang irrégulier peut obscurcir l'identification fiable de la surface de pia, même si un microscope chirurgical est utilisé. Comme le montre la figure 1C-F , un site de laminectomie sans sang peut être maintenu efficacement à l'aide de petits morceaux de mousse de gel pour couvrir la vertèbre laminectomisée et les tissus mous environnants. Troisièmement, une attention particulière doit être accordée au placement correct des animaux anesthésiés dans laLe cadre de la colonne vertébrale et l'immobilisation de la colonne vertébrale à l'aide de pinces de la colonne vertébrale. L'utilisation de trop de pression pendant le placement des pinces de la colonne vertébrale peut provoquer une rupture vertébrale; L'utilisation d'une pression insuffisante peut conduire à un desserrement progressif de la vertèbre immobilisée, ce qui se produit habituellement une fois qu'une perceuse dentaire est utilisée pour effectuer la laminectomie.

Le volume d'AAV9 subtilement injecté est en corrélation avec l'amplitude de l'expression du transgène rostro-caudal. Ainsi, l'utilisation de deux injections bilatérales bilatérales d'AAV9 sous-faciales (3 + 3 μL ou 5 + 5 μL) a été associée à une expression GFP cohérente dans l'ensemble de la matière grise et de la matière blanche, s'étendant jusqu'aux segments thoraciques supérieurs. Il y avait une variabilité minimale chez les animaux utilisés. Les volumes d'injection AAV9 de 1,5 + 1,5 μL ont conduit à une expression GFP similaire dans les segments localisés au voisinage des injections; Cependant, la propagation du virus et l'expression GFP résultante étaient limitées dans les segments thoraciques (

Limitation de la technique de distribution de gène Subpial:
L'une des limitations relatives de la technique d'injection subpienne (par rapport à l'accouchement intrathécal) est la nature plus invasive de cette approche lorsqu'une laminectomie dorsale doit être effectuée pour permettre l'accès à la surface dorsale de la moelle épinière. Cependant, l'expression du transgène puissant observée à travers la moelle épinière et dans les centres du cerveau supraspinal semble démontrer l'avantage évident par rapport à l'accouchement intrathécal AAV, qui se caractérise par une expression sélective du transgène dans une sous-population de α-motoneurones et d'afférences primaires (mais n'est pas présente Dans les neurones dans les lames de la moelle épinière plus profondes) 8 .

Futures applications du SubpiAl Gene Delivery Technique:
De même, comme cela a été démontré dans des études antérieures chez des rats adultes et des porcs, une expression du transgène hautement efficace peut être obtenue dans la peau de la colonne vertébrale et de la matière grise chez les souris adultes en utilisant une accouchement subalpente d'AAV9. En outre, en raison des dimensions relativement plus petites (en particulier la longueur) de la moelle épinière de souris, la délivrance d'AAV9 à seulement deux niveaux de moelle épinière (lombaire supérieur et supérieur) est suffisante pour conduire à une infection de la moelle épinière presque complète. Cette caractéristique peut avoir une implication importante dans la conception d'approches de traitement spécifiques à la modification de la maladie, soit par un inhibition des gènes ciblés, soit par une régulation positive.

Par exemple, en utilisant des vecteurs silencieux shRNA, on s'attend à ce qu'une diminution très efficace de l'expression de gènes mutés ( p. Ex. SOD dans le cas de la forme héréditaire de SLA) soit obtenue dans toute la moelle épinière ainsi que dans les spinelles - projetant des noyaux moteurs cérébraux. Seconde,En raison de l'infection très efficace des axones de la substance blanche rachidienne, les gènes thérapeutiques ( par exemple, codant des facteurs de croissance) peuvent être régulés à la hausse pour favoriser la germination axonale chez les animaux blessés par traumatisme rachidien. Troisièmement, en manipulant le volume ou le titre du virus subtilement délivré ainsi que le site de l'injection subpienne, l'expression du transgène peut être ciblée sur une région discrète de la moelle épinière ( par exemple, la corne dorsale unilatérale). L'expression du transgène localisé peut potentiellement être utilisée dans le traitement modificateur de la douleur ou de la spasticité musculaire en régulant à la hausse les systèmes neurotransmetteurs inhibiteurs ( par exemple, GABA) ou en inhibant les systèmes d'excitation ( par exemple, le système de récepteur couplé au glutamate). Quatrièmement, en plus de la distribution d'AAV, d'autres molécules ou vecteurs avec une faible perméabilité à la barrière hémato-encéphalique ( p. Ex., Micro-ARN) seront plus efficacement transmis dans le parenchyme rachidien après l'accouchement subpial. Ceux-ci peuvent effectivement être testés par usinLa technique décrite dans ce manuscrit. Enfin, comme le montre l'étude actuelle, la technique subpienne peut être utilisée avec succès chez des souris adultes avec des poids corporels moyens (BW) compris entre 20 et 30 g. Ainsi, il est probable que la même technique et la même configuration expérimentale peuvent être employées dans d'autres espèces animales avec des BW semblables ( par exemple, les chiots à rat Sprague-Dawley (SD)). Le BW des rats SD P6 et P21 est d'environ 17 et 62 g, respectivement. L'utilisation des chats de rat au stade précoce du développement post-natal peut être un outil utile pour étudier le rôle de la régulation négative ou du gène spécifique dans le développement des circuits neuronaux de la moelle épinière et du traitement sensoriel et moteur.

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Disclosures

Martin Marsala est cofondateur de Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, États-Unis).

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par la subvention de la Fondation SANPORC et ALSA (Martin Marsala); Le programme national de durabilité, numéro de projet LO1609 (Ministère tchèque de l'éducation, de la jeunesse et des sports); Et RVO: 67985904 (Stefan Juhas et Jana Juhasova).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

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References

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La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes
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Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).More

Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).

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