Subpial Adeno-assosiert Virus 9 (AAV9) Vector Levering i voksne mus
Summary
Målet med den foreliggende studien var å utvikle og validere styrken og sikkerheten til spinal adenoassosiert virus 9 (AAV9) -mediert genavgivelse ved bruk av en ny subpialgen-leveringsteknikk hos voksne mus.
Abstract
Den vellykkede utviklingen av en subpial adeno-assosiert virus 9 (AAV9) vektortilførselsteknikk hos voksne rotter og griser er tidligere rapportert. Ved bruk av subpielt anbragte polyetylenkateter (PE-10 eller PE-5) for AAV9-tilførsel, har potensielt transgenuttrykk gjennom spinalparenchyma (hvitt og grått stoff) i subpielt injiserte spinal-segmenter blitt påvist. På grunn av det brede spekteret av transgene musemodeller av neurodegenerative sykdommer, er det et sterkt ønske om å utvikle en kraftig sentralnervesystem (CNS) -targetet vektortilførselsteknikk hos voksne mus. Følgelig beskriver den foreliggende studien utviklingen av en spinal subpiavektoravgivningsanordning og teknikk for å tillate sikker og effektiv spinal AAV9-levering i voksne C57BL / 6J-mus. I spinalt immobiliserte og bedøvede mus ble pia materen (cervikal 1 og lumbal 1-2 spinal segmentnivå) innsnevret med en skarp 34 G nål ved hjelp av en XYZ manipulator. En andre XYZ maNipulator ble deretter brukt til å fremme en sløv 36G nål i lumbal og / eller cervical subpial plass. AAV9-vektoren (3-5 μL; 1,2 x 10 13 genomkopi (gc)) som koder for grønt fluorescerende protein (GFP) ble deretter injisert subpielt. Etter injeksjoner ble nevrologisk funksjon (motor og sensorisk) vurdert periodisk, og dyr ble perfusjonsfiks 14 dager etter AAV9-tilførsel med 4% paraformaldehyd. Analyse av horisontale eller transversale ryggmargseksjoner viste transgenuttrykk i hele ryggmargen, både i grå og hvitt materiale. I tillegg ble intenst retrogradel-mediert GFP-uttrykk sett i nedadgående motoraxoner og nevroner i motorcortexen, nuklearruber og formatio reticularis. Ingen nevrologisk dysfunksjon ble observert i noen dyr. Disse dataene viser at subpiavevektoroverføringsteknikken med hell kan brukes i voksne mus, uten å forårsake prosessrelatert ryggmargsskade, og er assosiert med svært potente transgene ekspresSion gjennom spinal neuraxis.
Introduction
Bruken av AAV vektorer til å behandle en rekke ryggmargen og CNS neurodegenerative lidelser blir en godt akseptert plattform for effektivt å oppregulere eller stille uttrykket av gen (er) av interesse. En av hovedbegrensningene til den mer effektive utnyttelsen av denne teknologien for behandling av CNS / ryggmargen er den begrensede evne til å levere AAV-vektor (er) til den dype hjernen eller ryggmargenparenchyma hos voksne pattedyr.
Det ble for eksempel demonstrert at den systemiske tilførsel av AAV9 hos voksne gnagere, katter eller ikke-humane primater kun er moderat effektiv ved å indusere transgenuttrykk i nevroner i hjernen og ryggmargen 1 , 2 , 3 . Den mer effektive intratekal levering av AAV9-vektorer har også vist seg å føre til bare begrenset transgenuttrykk i anatomisk definerte bassenger av nevroner. Nærmere bestemt har det vært demonerAt den cisternal eller lumbo-sacrale intratekale AAV9-leveransen i ikke-humane primater, griser eller gnagere fører til et høyt nivå av transgenuttrykk i spinal-α-motoneuroner og segmentale dorsale rotganglionneuroner. Imidlertid er minimal eller ingen uttrykk i spinalinterurons eller stigende eller synkende axoner i det hvite stoffet sett 4 , 5 , 6 , 7 . Samlet viser disse dataene at en høy effektiv biologisk-anatomisk barriere eksisterer, som forhindrer diffusjonen av intrathecalt levert AAV til dypere spinalparenchyma.
I en tidligere studie ved bruk av voksne rotter og griser ble en ny subpiavektortilførselsteknikk utviklet 8 . Ved bruk av denne tilnærmingen ble meget potensielt og multisegmentalt transgenuttrykk demonstrert etter en single-bolus subpial AAV9-tilførsel. Intenst GFP-uttrykk ble konsekvent settI nevroner, glialceller og nedadgående / stigende aksoner gjennom de injiserte spinal-segmentene. Denne studien demonstrerte for første gang at pia mater representerer den primære barrieren som begrenser effektiv AAV9 diffusjon i spinalparenchyma fra intratekalt rom. Selv om denne tidligere utviklede teknikken og subpell injeksjonsanordningen er relativt enkel å bruke hos store gnagere (som rotter) eller voksne griser, er systemet ikke egnet for bruk i små dyr, for eksempel voksne mus. På grunn av det høye antall tilgjengelige transgene musemodeller av en rekke neurodegenerative forstyrrelser er det et klart behov for utvikling av en effektiv spinalparenkymalvektortilførselsteknikk hos mus. Tilgjengeligheten av en slik teknikk vil tillate studier av effekten av spesifikt gentymping ( f.eks. Ved bruk av shRNA) eller oppregulering ved bruk av celle-ikke-spesifikk ( f.eks. Cytomegalovirus-CMV eller ubiquitin) eller celle-spesifikk ( f.eks. Synapsin eller glial Fibrillær sureProtein (GFAP)) promotorer under tidlig utvikling etter fødsel eller under sykdommer.
Følgelig har vi i den foreliggende studien utviklet og validert et miniatyr subpielt vektorleveringssystem som effektivt kan brukes i voksne mus. På samme måte, som i tidligere rotte- og grisstudier, demonstrerer dette arbeidet kraftig transgenuttrykk i hele spinalparenchyma etter en single-bolus subpial AAV9-levering i mus. Enkelheten i denne tilnærmingen, den meget gode toleransen for injiserte mus til subpell AAV9-levering og den høye potens for transgenuttrykk i spinalparenchymen antyder at denne teknikken effektivt kan implementeres i en hvilken som helst laboratorieinnstilling og brukes i eksperimenter som retter seg mot spinalgenekspresjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreliggende studien beskriver en teknikk for subpial vektor (AAV9) levering i voksne mus. Som vist i den medfølgende videoen, kan denne tilnærmingen og teknikken effektivt brukes, forutsatt at de nødvendige instrumenter og pia-penetrerende nål og subpiell injeksjonsnål er riktig produsert i henhold til de etablerte og testede spesifikasjonene.
Kritiske tekniske variabler i å utføre en konsekvent og sikker subpial injeksjon i mus:
Som vist kan en subpell in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av SANPORC og ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Nasjonalt bærekraftig program, prosjektnummer LO1609 (tsjekkisk utdanningsdepartement, ungdom og idrett); Og RVO: 67985904 (Stefan Juhas og Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
