Vi præsenterer en metode til kvantificering af vækstfænotyper af individuelle gærceller, da de vokser ind i kolonier på faste medier ved anvendelse af tidsforskydningsmikroskopi betegnet, En-celledobbeltbedømmelse af levende arrays af gær (ODELAY). Befolknings heterogenitet af genetisk identiske celler, der vokser ind i kolonier, kan observeres og kvantificeres direkte.
Vækstfænotyper af mikroorganismer er en stærk indikator for deres underliggende genetiske egnethed og kan adskilles i 3 vækstregimer: lagfase, logfase og stationær fase. Hver vækstfase kan afsløre forskellige aspekter af fitness, der er relateret til forskellige miljømæssige og genetiske forhold. Højopløsnings- og kvantitative målinger af alle 3 faser af vækst er generelt vanskelige at opnå. Her præsenterer vi en detaljeret metode til at karakterisere alle 3 vækstfaser på fast medium ved hjælp af et assay kaldet En-celle Doubling Evaluering af Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY kvantificerer vækstfænotyper af individuelle celler, der vokser ind i kolonier på fast medium ved anvendelse af tidsforskydningsmikroskopi. Denne metode kan direkte observere befolknings heterogenitet med hver vækstparameter i genetisk identiske celler, der vokser ind i kolonier. Denne population heterogenitet tilbyder et unikt perspektiv for forståelse af genetisk og epigenetisk regulering og svar påGenetiske og miljømæssige forstyrrelser. Mens ODELAY-metoden er demonstreret ved anvendelse af gær, kan den anvendes på enhver kolonidannende mikroorganisme, der er synlig ved lyse feltmikroskopi.
Vækstfænotyper af mikroorganismer er en stærk indikator for deres underliggende genetiske egnethed til en given miljøtilstand. Væksten er klassisk adskilt i 3 forskellige vækstregimer: lagfase, logfase og stationær fase vækst 1 . Hver vækstfase kan afsløre forskellige aspekter af fitness, som er afhængige af forskellige miljømæssige og genetiske forhold. For eksempel kan lagretid eller den tid, en organism bruger i lagfase før starten af eksponentiel vækst, indikere en organismes evne til at reagere på ændrede miljøforhold 2 . Doblingstid under logfasevækst, den mest almindelige metric for cellulær træning, afslører den samlede effektivitet af en organisations evne til at opdele ved at metabolisere og udnytte miljømaterialer til replikation. Stationær fase, hvor vækst efter logfase hurtigt reduceres, er en anden indikator for fitness, som er regelmæssigAnvendes som et vækstendipunkt i punktbaserede gærvækstassays.
Flere gærvækstassays er aktuelt tilgængelige og betragtes som standardmetoder til evaluering af vækstfænotyper i gær 3 , 4 , 5 . Disse analyser er primært baseret på metoder til dyrkning af gær enten på faststof eller i flydende medier. På faste medier overfører koloni-pinningsassays et lille antal celler på fast agar med en pin, og gærceller får lov til at vokse i en bestemt tidsperiode. Kolonier afbildes derefter og deres størrelser sammenlignes ved et terminal endepunkt 6 . Disse kolonibestemmelsesanalyser har vist sig robuste og skalerbare til at generere genomsamlede skærme. For nylig er periodisk billeddannelse ved hjælp af fladskanningsscannere og kameraer med enkeltlinsrefleks (SLR) blevet indarbejdet i disse analyser for at registrere koloni-vækst over tid 7 , 8, 9 . Imidlertid forhindrer opløsningen af disse indretninger dem fra at detektere enkeltceller, og disse koloni-pinning-analyser observerer således ikke direkte lagtid og kan ikke observere variation mellem de enkelte celler, der vokser ind i kolonier.
Væskebaserede vækstassays er også blevet anvendt til at udføre genomsamlede skærme 3 . Kobling af et væskevækstassay med tidsforskydningsmikroskopi afslørede populations heterogenitet i fordoblingstiden for genetisk identiske individuelle celler, hvilket giver et vigtigt perspektiv for forståelse af genetisk regulering og miljøtilpasning. Imidlertid måler dette assay ikke andre aspekter af vækst såsom forsinkelsestid og bæreevne 10 . Her præsenterer vi en metode til at karakterisere alle tre vækstfaser af kolonidannende mikroorganismer på fast medium ved hjælp af et assay, som vi betegner ODELAY 11 . ODELAY består af utiliZing high-through time-lapse mikroskopi for at optage billeder af enkeltceller, der vokser ind i kolonier på fastmedier. Denne population af individuelle celler, der vokser ind i kolonier, afslører den underliggende befolknings heterogenitet, som ikke påvises af andre mindre følsomme målinger såsom terminal endepunktscoring. Vi demonstrerer metoden på gær, men ODELAY kan anvendes til enhver organisme, der viser kontrast i lysfeltmikroskopi.
ODELAY-analysen har flere kritiske punkter for at sikre reproducerbare og pålidelige fænotypiske målinger. Det første kritiske punkt er konsistent fremstilling af gærkulturer. Der skal udvises forsigtighed for at høste gærcellerne fra logaritmisk vækst. Hvis kulturerne er mættede, vil deres befolknings heterogenitet blive forøget, hvilket kan forvirre heterogenitet forårsaget af genetiske eller miljømæssige ( fx carbonkilde) faktorer 11 . Det andet kritiske punkt er konsekvent forberedelse af medierne. Generelt skal der genereres et stort volumen på 10X stockmedieopløsning og derefter anvendes over tid for at minimere batcheffekter. Formulering af medier efter vægt, når det er muligt, hjælper med at forbedre konsistensen af mediet over tid ved at sikre agarets densitet, og agarosens samlede vandindhold kan overvåges nøje. Det tredje kritiske punkt indebærer minimering eller eliminering af enhver mekanisk deformation af agarosen migdia. Mekanisk deformation af mediet vil oftest forekomme under adskillelse af agarosen fra glasskinnerne. Som med mange laboratorieteknikker er det nødvendigt at praktisere dette trin.
Variation i forsinkelsestid som afbildet i figur 4 er ofte relateret til en af de tre faktorer: mekanisk deformation af agarosemediet, variation i den formede agartykkelse eller en ustabil lyskilde. Hvis agarosemediet varierer i Z-højde over det plettede array, kan højdevariationen overvælde autofokusrutinen, hvilket medfører, at de indledende billeder er lidt ude af fokus. Af denne grund skal du kontrollere fokushøjden på flere steder i midten og langs kanterne af det plettede array for at sikre, at autofokusrutinen har tilstrækkelig Z-rækkevidde til at finde fokus. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge autofokuspanelet til at øge fokusområdet og øge antallet af fokuseringstrin.
En tredje mulig betingelseIon, der kan føre til dårlig fokus er en ustabil eller flimrende lyskilde, som kan forstyrre den beregnede fokus score for en bestemt Z-højde. Tungsten halogenpærer har tendens til at flimre godt, før pærerne brænder ud. Effekten af dårlig fokus er observeret i et eksempel, hvor vækstkurverne dyppes mellem de første og anden tidspunkter ( Figur 5 A ), mens det tilstødende punkt ikke har samme dip ( Figur 5 B ). I dette tilfælde blev den fattige fokustilstand lindret ved at erstatte wolfram halogen lyskilden.
I praksis har forfatterne fundet, at pærerne skal udskiftes hver 500 h eller groft hver anden måned, når mikroskoperne er i kraftig brug, for at reducere flimmeren af 100 W wolfram halogenpærer. For at undgå dårlige fokusproblemer fra en flimrende pære, skal du ofte udskifte wolfram halogen lyskilden eller udskifte halogenpæren med en diode lyskilde. enEksempel på et datasæt, som viser lav variation i fordoblingstider samt mere ensartede forsinkelsestider, er vist i figur 6 . Dette datasæt blev taget med en diode illuminator, som giver en mere stabil belysning over tid, mens autofokus udføres.
Mens mange af de punkter, der er nævnt her for at optimere medieforberedelse, synes at være indlysende, lægger de fleste storskalaer i litteraturen sig ikke godt sammen med hinanden 8 , 11 . Derfor har vi omhyggeligt beskrevet fremstillingen af kulturer og agarosemedier, således at der kan genereres mere reproducerbare fænotypiske skærme.
ODELAY-assayet er for tiden begrænset i gennemstrømning sammenlignet med pinningbaserede assays, såsom syntetiske genetiske arrays eller Scan-O-Matic-analysen. Mens disse metoder øger antallet af stammer, der måles, mangler de en evne til at løse individuelle celler aNd kan således ikke måle befolknings heterogenitet, som vi observerer inden for klonholdige gærstammer. Oprindelsen af denne population heterogenitet forstås ikke i øjeblikket, men sammenlægningen af teknologi og beregning som vist her giver mulighed for objektivt at adressere de underliggende cellulære mekanismer 12 .
Forfatterne ønsker at bemærke, at ODELAY i øjeblikket kun er optimeret til et bestemt mikroskopmærke og kropstype. Ændring af ODELAY for andre mikroskopsystemer er lige fremad, men vil kræve viden om open source API 13 . Men både API'en og ODELAY-scriptene er skrevet for let at tilpasse til forskellige systemer og eksperimentelle analyser.
Mens ODELAY oprindeligt var udviklet til gær, har vi kunnet udnytte den uden modifikation for at observere væksten af Mycobacterium smegmatis . Observation af de andre kolonidannende mikroorganismer erMuligt med ændringer til kildekoden, der er angivet 11 . Generelt er ODELAY et kraftfuldt og fleksibelt værktøj til sammenligning af mikroorganismer dyrket under forskellige miljømæssige forhold og genetiske forstyrrelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender støtte til dette arbejde ved at tildele U54 RR022220 og P50 GM076547 til JDA fra de amerikanske nationale institutter for sundhed. FDM er en postdoktor med de canadiske institutter for sundhedsforskning. Vi takker også Luxembourg Center for Systems Biomedicine og Luxembourgs Universitet til støtte.
Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm |
Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
50mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
15mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
96 well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.comODELAY for Matlab scripts and software | ||
ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.comODELAY for Mechanincal Drawings | ||
ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.comODELAY for mold drawings |