Vi presenterer en metode for å kvantifisere vekstfenotyper av individuelle gjærceller etter hvert som de vokser inn i kolonier på faste medier ved bruk av tidsforskjellsmikroskopi betegnet, En-celledubblende evaluering av levende arrays of yeast (ODELAY). Befolknings heterogenitet av genetisk identiske celler som vokser til kolonier, kan observeres og kvantifiseres direkte.
Vekstfenotyper av mikroorganismer er en sterk indikator på deres underliggende genetiske egenskaper og kan segregeres i 3 vekstregimer: lagfase, logfase og stasjonær fase. Hver vekstfase kan avsløre ulike aspekter av kondisjon som er relatert til ulike miljømessige og genetiske forhold. Høyoppløselige og kvantitative målinger av alle 3 faser av vekst er generelt vanskelig å oppnå. Her presenterer vi en detaljert metode for å karakterisere alle 3 vekstfaser på solid media ved hjelp av en analyse som heter En-celledubbling Evaluering av Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY kvantifiserer vekstfenotyper av individuelle celler som vokser til kolonier på fast media ved bruk av tidsforskyvningsmikroskopi. Denne metoden kan direkte observere populasjons heterogenitet med hver vekstparameter i genetisk identiske celler som vokser til kolonier. Denne populasjons heterogeniteten gir et unikt perspektiv for forståelse av genetisk og epigenetisk regulering og respons påGenetiske og miljømessige forstyrrelser. Mens ODELAY-metoden er demonstrert ved bruk av gjær, kan den benyttes på enhver kolonidannende mikroorganisme som er synlig ved lyse feltmikroskopi.
Vekstfenotyper av mikroorganismer er en sterk indikator på deres underliggende genetiske egenskaper til en gitt miljøtilstand. Veksten er klassisk segregert i 3 forskjellige vekstregimer: lagfase, logfase og stasjonær fasevekst 1 . Hver vekstfase kan avsløre ulike aspekter av kondisjon som er avhengig av ulike miljømessige og genetiske forhold. For eksempel kan lagringstid eller lengden på tiden en organisme bruker i lagfase før begynnelsen av eksponentiell vekst, være indikativ for en organismes evne til å reagere på endrede miljøforhold 2 . Doblingstid under logfasevekst, den vanligste metriske for cellulær kondisjon, avslører den samlede effektiviteten til en organisasjons evne til å dele seg ved å metabolisere og bruke miljømaterialer til replikasjon. Stasjonær fase, der veksten etter logfase raskt reduseres, er en annen indikator på kondisjon, som er vanligBrukes som et vekstendepunkt i spotbaserte gjærvækstanalyser.
Flere gjærvækstanalyser er for tiden tilgjengelige og anses som standardmetoder for å evaluere vekstfenotyper i gjær 3 , 4 , 5 . Disse analysene er hovedsakelig basert på metoder for voksende gjær, enten på fast eller i flytende medier. På faste medier overfører koloni-pinningsanalyser et lite antall celler til fast agar med en pinne, og gjærceller får vokse i en bestemt tidsperiode. Kolonier blir deretter avbildet og deres størrelser sammenlignes ved et terminal endepunkt 6 . Disse kolonibestemmingsanalysene har vist seg robuste og skalerbare for å generere gjennomsiktige skjermbilder. Mer nylig har periodisk avbildning ved bruk av flatbed-skannere og kameraer med enkelt-linserefleks (SLR) blitt innarbeidet i disse analysene for å registrere koloni vekst over tid 7 , 8, 9 . Oppløsningen av disse enhetene forhindrer imidlertid dem i å detektere enkeltceller, og disse koloni-pinning-analysene observerer ikke direkte lagtid og kan ikke observere variasjon mellom de enkelte cellene som vokser inn i kolonier.
Væskebaserte vekstanalyser har også vært benyttet for å utføre genom-brede skjermbilder 3 . Kobling av en væskevækstassay med tidsforskjellmikroskopi avslørte populasjons heterogenitet i fordoblingstiden for genetisk identiske individuelle celler, som gir et viktig perspektiv for forståelse av genetisk regulering og miljøtilpasning. Imidlertid måler denne analysen ikke andre aspekter av vekst slik som forsinkelsestid og bæreevne 10 . Her presenterer vi en metode for å karakterisere alle tre vekstfaser av kolonidannende mikroorganismer på fast medium ved hjelp av en analyse vi betegner ODELAY 11 . ODELAY består av utiliZing high-through time-lapse mikroskopi for å ta opp bilder av enkeltceller som vokser inn i kolonier på solid media. Denne populasjonen av individuelle celler som vokser inn i kolonier, avslører den underliggende populasjons heterogeniteten, som ikke oppdages av andre mindre følsomme målinger som terminal endepunktscore. Vi demonstrerer metoden på gjær, men ODELAY kan brukes på enhver organisme som viser kontrast i lysfeltmikroskopi.
ODELAY-analysen har flere kritiske punkter for å sikre reproduserbare og pålitelige fenotypiske målinger. Det første kritiske punktet er konsistent fremstilling av gjærkulturer. Det må tas hensyn til å høste gjærcellene fra logaritmisk vekst. Hvis kulturen er mettet, vil deres populasjons heterogenitet økes, noe som kan forvirre heterogenitet forårsaket av genetiske eller miljømessige ( f.eks. Karbonkilde) faktorer 11 . Det andre kritiske punktet er konsekvent forberedelse av media. Generelt bør et stort volum 10X lagermedieoppløsning genereres og deretter brukes over tid for å minimere batcheffekter. Formulering av media etter vekt, når det er mulig, bidrar til å forbedre konsistensen av mediet over tid ved å sikre tettheten av agar og det totale vanninnholdet i agarosen kan overvåkes nøye. Det tredje kritiske punktet innebærer minimering eller eliminering av mekanisk deformasjon av agarose megdia. Mekanisk deformasjon av mediet vil oftest oppstå under separering av agarosen fra glassruten. Som med mange laboratorieteknikker er det nødvendig med praksis for å mestre dette trinnet.
Variasjon i forsinkelsestid som vist i figur 4 , er ofte relatert til en av de tre faktorene: mekanisk deformasjon av agarosemediet, variasjon i støpt agartykkelse eller en ustabil lyskilde. Hvis agarosemediet varierer i Z-høyde over det spottede systemet, kan høydevariasjonen overvelde rekkevidden til autofokusrutinen, slik at de første bildene blir litt ute av fokus. Av denne grunn må du kontrollere fokushøyden på flere steder i midten og langs kantene av den merkede gruppen for å sikre at autofokusrutinen har tilstrekkelig Z-rekkevidde for å finne fokus. Hvis nødvendig, bruk autofokuspanelet til å øke fokusområdet og øke antallet fokuseringssteg.
En tredje mulighetIon som kan føre til dårlig fokus er en ustabil eller flimrende lyskilde, som kan forstyrre den beregnede fokuspunkten for en bestemt Z-høyde. Tungsten halogenpærer har en tendens til å flimme godt før pærene brenner ut. Effekten av dårlig fokus er observert i et eksempel hvor vekstkurverne dobler mellom første og andre tidspunkter ( Figur 5 A ), mens tilstøtende punkt ikke har samme dip ( Figur 5 B ). I dette tilfellet ble den svake fokustilstanden lindret ved å erstatte wolframhalogenlyskilden.
I praksis har forfatterne funnet at for å redusere flimmer av 100W tungsten halogenpærer, må pærene byttes ut hver 500 time eller omtrent hver annen måned når mikroskopene er under tung bruk. For å unngå dårlige fokusproblemer fra en blinkende pære, erstatt tungstoff halogen lyskilden ofte eller bytt halogenpæren med en diodelyskilde. enEksempel på et datasett som viser lav variasjon i doblingstider, så vel som mer ensartede lagringstider, er vist i figur 6 . Dette datasettet ble tatt med en diode illuminator som gir en mer stabil belysning over tid mens du utfører autofokus.
Mens mange av punktene som er nevnt her for optimalisering av mediepreparasjon, kan synes å være åpenbare, gjentar de fleste storskala-skjermer ikke godt med hverandre 8 , 11 . Derfor har vi nøye beskrevet utarbeidelsen av kulturer og agarosemedier slik at mer reproducerbare fenotypiske skjermbilder kan genereres.
ODELAY-analysen er for tiden begrenset i gjennomstrømning sammenlignet med pinningsbaserte analyser som syntetiske genetiske arrays eller Scan-O-Matic-analysen. Mens disse metodene øker antall stammer som måles, mangler de en evne til å løse enkelte celler aNd kan således ikke måle populasjons heterogenitet som vi observerer i klonale gjærstammer. Opprinnelsen til denne populasjons heterogeniteten forstås ikke for øyeblikket, men sammenslåingen av teknologi og beregning som vist her gir en mulighet for objektivt å adressere de underliggende cellemekanismer 12 .
Forfatterne ønsker å merke seg at ODELAY for tiden bare er optimalisert for et bestemt mikroskopmerke og kroppstype. Endring av ODELAY for andre mikroskopsystemer er rett fram, men krever kunnskap om åpen kildekode-API 13 . Imidlertid er både API og ODELAY-skriptene skrevet for å tilpasses enkelt til forskjellige systemer og eksperimentelle analyser.
Mens ODELAY ble opprinnelig utviklet for gjær, har vi vært i stand til å benytte den uten modifikasjon for å observere vekst av Mycobacterium smegmatis . Observasjon av de andre kolonidannende mikroorganismer erMulig med endringer i kildekoden gitt 11 . Generelt er ODELAY et kraftig og fleksibelt verktøy for å sammenligne mikroorganismer dyrket under ulike miljøforhold og genetiske forstyrrelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner støtte til dette arbeidet ved å gi U54 RR022220 og P50 GM076547 til JDA fra US National Institutes of Health. FDM er en postdoktorell med Canadian Institutes for Health Research. Vi takker også Luxembourgs senter for systembiomedisin og Universitetet i Luxembourg for støtte.
Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm |
Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
50mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
15mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
96 well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.comODELAY for Matlab scripts and software | ||
ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.comODELAY for Mechanincal Drawings | ||
ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.comODELAY for mold drawings |