Kommer til lys Side: In Vivo overvågning af Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniske sår i en diabetisk Hairless Murine Model
Summary
Her beskriver vi en roman diabetisk murine model udnytte hairless mus for real-time, ikke-invasiv overvågning af biofilm sårinfektioner af en bioluminescerende Pseudomonas aeruginosa. Denne metode kan tilpasses til at evaluere infektion af andre bakteriearter og genetisk modificerede mikroorganismer, herunder flere arter biofilm, og teste effekten af antibiofilm strategier.
Abstract
Tilstedeværelse af bakterier som struktureret biofilm i kroniske sår, især hos diabetikere, menes at hindre sårheling og opløsning. Kroniske sår musemodeller har været brugt til at forstå de underliggende samspil mellem mikroorganismer og værten. De modeller udviklet til dato er afhængige af brugen af hårede dyr og terminal samling af sår væv til bestemmelse af levedygtige bakterier. Mens betydelig indsigt er opnået med disse modeller, denne eksperimentelle procedure kræver et stort antal dyr og prøvetagning er tidskrævende. Vi har udviklet en roman murine model, der indeholder flere optimal nyskabelser for at evaluere biofilm progression i kroniske sår: en) det udnytter hairless mus, eliminerer behovet for hårfjerning; b) gælder præformerede biofilm på sår, gør det muligt for den umiddelbare vurdering af persistens og virkningen af disse Fællesskaber på vært; c) overvåger biofilm progression af kvantificere lys produktion af en genetisk manipuleret en bioluminescerende stamme af Pseudomonas aeruginosa, giver mulighed for tidstro overvågning af infektionen dermed reducere antallet af dyr kræves pr. undersøgelse. I denne model, er en enkelt fuld-dybde sår produceret på bagsiden af STZ-induceret diabetisk hairless mus og podes med biofilm af P. aeruginosa en bioluminescerende stamme Xen 41. Lyseffekten fra sårene registreres dagligt i en i vivo imaging system, giver mulighed for i vivo og i situ hurtige biofilm visualisering og lokalisering af biofilm bakterier inden for sår. Denne nye metode er fleksibel, da det kan bruges til at studere andre mikroorganismer, herunder genetisk modificerede arter og flere arter biofilm, og kan være af særlig værdi i anti-biofilm teststrategier herunder antimikrobiel okklusiv forbindinger.
Introduction
Biofilm er komplekse samfund af mikroorganismer indkapslet i en matrix af polymere stoffer, der er blevet fremhævet som en medvirkende faktor for den dårlig opløsning af kroniske sår1. Studiet af disse meget organiseret, vedvarende mikrobielle populationer er særligt vigtigt for hvor dårligt blodomløb på lemmer og ændrede perifer sensorisk mekanismer føre til uopdaget læsioner2-diabetikere. I USA anslås det, at 15% af diabetespatienter vil udvikle mindst ét sår i løbet af deres liv. Dette svarer til en økonomisk udgift for omkring 28 milliarder dollars i behandling3,4, for ikke for at nævne de immensurable følelsesmæssige og sociale byrder. Forstå de faktorer, der giver mulighed for mikrobielle samfund at fremture i såret seng og disse biofilm indvirkning i de helbredende begivenheder er bydende nødvendigt at køre bedre pleje for ramte patienter og drive udviklingen af nye behandlingsmetoder. Etablering af reproducerbar og oversætbare i vivo modeller for at udforske bakteriel-værtssammenspil er derfor altafgørende.
Blevet udviklet murine modeller for at studere virkningerne af biofilm i kroniske sår. Disse modeller, men ofte udnytte hår arter og evaluere biofilm clearance af plade tæller for levedygtige bakterieceller skåret væv fra ofrede dyr, hvilket gør dem tidskrævende og dyrt.
Et biophotonic alternativ til slutpunktet prøveudtagning af dyr i evaluering infektion blev først foreslået af Contag mfl. (1995) 5 , der har udviklet en metode til at fange luminescence fra constitutively en bioluminescerende Salmonella typhimurium at måle antibiotisk behandling virkning. Andre undersøgelser, at drage fordel af bioluminescens energieffektiv bakterier fulgt. For eksempel Rochetta mfl. (2001) 6 valideret en infektion model for at studere Escherichia coli låret infektioner i mus ved at måle luminescence ved hjælp af en øget afgift – sammen enhed og senere, Kadurugamuwa mfl. (2003) 7 benyttede sig af den photon udsender egenskaber af en manipuleret stamme af Staphylococcus aureus at undersøge effekten af flere antibiotika i et kateter sår model i mus.
Metoden kendetegnet her præsenterer en enkel protokol for at fremkalde diabetes i hairless mus, producere og podes sår med præ-dannet en bioluminescerende biofilm af P. aeruginosa, og gennemføre biophotonic overvågning af infektionen ved hjælp af en i vivo imaging system. Det tilbyder en direkte, hurtig, i situ, non-invasiv og kvantitative proces at evaluere biofilm i kroniske sår og derudover giver mulighed for yderligere analyse, såsom mikroskopisk billeddannelse af healing sår, intermitterende blod samling for cytokin målinger, og terminal væv indsamling til histologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en ny musemodel for studier af biofilm i diabetisk kroniske sår, der er mange fordele ved at oprette en reproducerbar, oversætbare og fleksibel model.
Den første nyhed er brugen af hairless mus. Andre musemodeller er blevet udviklet for at studere diabetisk kronisk sårheling10,11, men alle har påberåbt sig anvendelsen af hår mus der kræver fjernelse af pels af processer, der involverer enten voks eller hår kli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke den amerikanske Diabetes Association til støtte for dette arbejde (Grant # #7-13-BS-180), Michigan State University forskning teknologi støtte facilitet til uddannelse og adgang til den i vivo imaging system og den Michigan State University undersøgende histopatologi Lab for forarbejdning mus biopsier for histopatologiske undersøgelse.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
