Summary
Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.
Abstract
A presença de bactérias como biofilmes estruturadas em feridas crônicas, especialmente em pacientes diabéticos, é pensada para evitar a cicatrização e resolução. Modelos de feridas crónicas do mouse têm sido utilizados para entender as interações subjacentes entre os microrganismos e o hospedeiro. Os modelos desenvolvidos até à data dependem terminal coleção de tecido da ferida para determinação de bactérias viáveis e a utilização de animais de pelo. Enquanto uma visão significativa tem sido adquirida com estes modelos, este procedimento experimental requer um grande número de animais e amostragem é demorada. Nós desenvolvemos um novo modelo murino que incorpora várias inovações ideais para avaliar a progressão do biofilme em feridas crônicas: uma) que utiliza camundongos sem pelos, eliminando a necessidade de remoção do cabelo; b) pré-formado biofilmes se aplica para as feridas que permite a avaliação imediata de persistência e o efeito destas comunidades no host; c) monitora a progressão do biofilme por quantificar a produção de luz por uma cepa bioluminescente geneticamente modificada de Pseudomonas aeruginosa, permitindo o monitoramento em tempo real da infecção, reduzindo o número de animais necessários por estudo. Neste modelo, uma única ferida cheia-profundidade é produzida na parte de trás da STZ-induzida ratos diabéticos sem pelos e inoculada com biofilmes da estirpe bioluminescente Xen 41 p. aeruginosa . Saída de luz das feridas é registrada diariamente em um na vivo sistema de imagem, permitindo a visualização de biofilme rápida in vivo e in situ e localização de bactérias do biofilme dentro as feridas. Este novo método é flexível, pois pode ser usado para estudar outros microorganismos, incluindo espécies geneticamente modificadas e biofilmes de várias espécies e podem ser de especial valor em teste antibiofilme estratégias incluindo antimicrobianos pensos oclusivos.
Introduction
Biofilmes são comunidades complexas de microorganismos incorporados numa matriz de substâncias poliméricas que destacaram-se como um fator que contribui para a resolução do pobre de feridas crónicas1. O estudo dessas populações microbianas altamente organizado, persistente é particularmente importante para pacientes diabéticos, onde a má circulação em membros e mecanismos sensoriais periféricos alterados levar a lesões detectadas2. Nos Estados Unidos, estima-se que 15% dos pacientes diabéticos desenvolverão pelo menos uma úlcera no decorrer de suas vidas. Isso se traduz em uma despesa econômica de cerca de 28 bilhões de dólares no tratamento3,4, sem mencionar a carga emocional e social imensurável. Compreender os fatores que permitem que comunidades microbianas persistir no leito da ferida e o impacto que estes biofilmes nos eventos curativas é imperativo conduzir melhor cuidados para pacientes afetados e impulsionar o desenvolvimento de novas abordagens de tratamento. Portanto, o estabelecimento de modelos reprodutíveis e traduzíveis em vivo para explorar interações bacterianas-host é primordial.
Murino modelos foram desenvolvidos com sucesso para estudar o impacto de biofilmes em feridas crônicas. Estes modelos, no entanto, muitas vezes utilizam espécies de cabelos e avaliar afastamento de biofilme por placa contagens de células bacterianas viáveis do tecido extirpado de animais sacrificados, tornando-os, demorada e dispendiosa.
Uma alternativa de biophotonic para a amostragem de ponto de extremidade de animais na avaliação de infecção foi proposta por Contag et al. (1995) 5 , quem desenvolveu um método para capturar a luminescência de constitutivamente bioluminescentes Salmonella typhimurium para medir a eficácia do tratamento com antibióticos. Outros estudos, aproveitando-se das bactérias emitem bioluminescência seguido. Por exemplo, Rochetta et al. (2001) 6 validado um modelo de infecção para estudar infecções de coxa de Escherichia coli em camundongos através da medição da luminescência usando um intensificação dispositivo de carga acoplada e mais tarde, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 se aproveitou do fotão emitindo Propriedades de uma engenharia cepa de Staphylococcus aureus para investigar a eficácia de vários antibióticos em um cateter modelo de ferida em ratos.
O método caracterizado aqui apresenta um protocolo simples para induzir diabetes em ratos sem pelos, produzir e inocular as feridas com biofilmes bioluminescentes pré-formado de p. aeruginosa e realizar a biophotonic monitoramento da infecção usando um na vivo sistema de imagem. Ele oferece uma direta, rápida, em situ, processo invasivo e quantitativo para avaliar biofilmes em feridas crônicas e além disso, permite análises adicionais tais como imagem microscópica da cicatrização de feridas, coleta de sangue para medições de citocinas e coleção de terminal de tecidos para a histologia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
experimentos com animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University.
1. preparação de pensos oclusivos e espaçadores de Silicone
- cortar o curativo oclusivo transparente fazer quadrados aproximadamente 1 cm x 1 cm com uma tesoura.
- Cortar 10 milímetros círculos sobre uma folha de silicone grossa de 0,5 mm usando uma biópsia 10mm soco. centro uma biópsia de 5mm soco no meio do círculo de 10mm e pressione firmemente para criar um buraco para formar um " donut "-como o disco que será usado como uma tala.
2. animais experimentais
ratos masculinos de SKH-1- uso 8 semana de idade (22-26 g) de um criador comercial. Manter os ratos em condições normais de 21 ° C e um ciclo de claro-escuro de 12 h com livre acesso à comida e água.
- Para induzir diabetes, injetar intraperitonially de ratos com um 13 mg/ml estreptozotocina (STZ) solutionand 25% glicose (250 µ l por / rato) em 5 dias consecutivos.
- Fazer a solução STZ por diluição 65 µ g/ml de STZ 5 µ l de ácido cítrico, pH 4,5 a 100 mM.
- Ajustar o volume injetado para cada rato uma massa final de 65 mg STZ por 1 kg de peso corporal de rato. Injetar o controle de ratos com pH de solução de ácido cítrico 100 mM 4.5 nos mesmos dias.
- Confirmar a hiperglicemia monitorando sangue glicose com um glicosímetro 14 dias após a última injecção de STZ. Ratos diabéticos podem ter poliúria e, então, sua roupa de cama pode precisar ser alterada com mais frequência para eliminar umidade e seus pesos devem ser monitorizados 3 vezes por semana.
3. Biofilmes
- preparação de biofilme
- de biofilmes de colônia crescer 8 para inocular as feridas. Dois dias antes do início da cirurgia uma cultura durante a noite de bioluminescentes p. aeruginosa Xen 41 em caldo tryptic soja (TSB) incubado a 37 ° C e agitando a 200 rpm e esterilizar os filtros de membrana de policarbonato com tamanho de poro 0,2 µm pela exposição aos raios UV luz em uma capa de segurança biológica para 15 min cada lado.
- Um dia antes da cirurgia centrifugar a cultura durante a noite a 20.000 x g por 2 min e lavar 3 vezes com 1 mL de Dulbelcco ' fosfato s tampão salino (DPBS) pipetando para cima e para baixo.
- Diluir a suspensão em DPBS para uma absorvância de 0,05 em 600 nm.
- Pipeta de 10 µ l da cultura diluída em cada membrana descansando num prato tryptic soy agar (TSA). Após permitir que seque, incubar as membranas a 35 ° C por 72 h a crescer biofilmes transferir para novas placas TSA cada 24 h.
- Curva padrão
- antes do início do experimento, fazer uma curva padrão para correlacionar contagens de bioluminescência e bacteriano.
- Preparar biofilmes, conforme descrito em 3.1.
- Fazer diluições em série de biofilmes variando de ½ a 1/24, misturando o biofilme com DPBS e num Vortex até uma solução visualmente homogênea é produzida. Pipeta 200µL das soluções diluídas em uma placa de 96 poços preta e imagem com o na vivo sistema de imagem.
- Espalhar as diluições de placa em placas TSA e incubar a 35 ° C por 24 h.
- Contava (CFU) de unidades formadoras de placas e criar uma curva padrão para correlacionar contagens de bioluminescência e bacteriano.
4. Ferida cirurgia
- induzir anestesia geral com isoflurano em 95% oxygen/5% CO 2 (para evitar a morte de cetoacidose) a uma taxa de fluxo de 1 L/min e manter anestesia utilizando isoflurano 1-3%. Manter animais em esteiras de calor durante a cirurgia.
- Garantir os reflexos profundos pedais do mouse são suprimidos por beliscar o pé com uma pinça e coloque o mouse na posição propensa.
- Administrar meloxicam (0,2 mg/kg) através da injeção sub-cutâneo (30 μl) para controle da dor.
- Limpe a pele das costas com 10% de iodo-povidona três vezes e um pad de isopropanol.
- Usar um soco de biópsia de 4mm estéril para delinear um padrão circular para a ferida de um lado do mouse ' mediana de s ao nível dos ombros. Contorne o padrão com um marcador permanente.
- Usar fórceps serrilhado para levantar a pele no meio do contorno e iris tesoura para criar uma ferida de espessura total que se estende através do tecido subcutâneo, incluindo o carnosus panículo adiposo e excisar a peça circular de tecido.
- Aplique uma cola adesiva médica pele impermeável para a pele dos ratos e posicionar a tala do silicone, aplicando pressão suave. Cobrir a ferida com um penso oclusivo transparente. Após a cirurgia, os animais da gaiola individualmente.
5. Pós-operatórios
- administrar meloxicam (0,2 mg/kg) uma vez por dia, através da injeção de sub-cutâneo para alívio da dor pós-operatória nos próximos 2 dias.
- Animais monitor diariamente para manifestações de dor e perda de peso. Animais diabéticos precisam de injeções de insulina quando eles perderam 15% ou mais do peso corporal.
6. Preparação do inóculo de biofilme e infecção
- inocular ratos 48 h após a cirurgia, conforme descrito nas etapas a seguir.
- Raspar 72 h biofilmes de membranas usando uma espátula estéril, colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora e diluir a 1:2 em DPBS. Mix pipetando brevemente acima e para baixo.
- Placa de propagação inóculo em placas TSA para calcular o total CFU. Para garantir que as contagens são precisas, quebrar o inóculo de biofilme ainda mais por uma série de dois passos de 1min num Vortex intercaladas por uma etapa de sonication 2 min a 40 kHz em um líquido de limpeza ultra-sônico.
- Remova a cobertura do curativo a ferida e silicone tala e leve uma micrografia da ferida com um microscópio com câmera anexada usando uma régua como referência.
- Cortar as pontas das pontas de pipetas 200 µ l e pipetar 10 µ l de inóculo biofilme sobre cada ferimento.
- Imagem do mouse usando o na vivo sistema usando configurações automática de imagens: exposição tempo s 5-300, com médio binning, 1 de f/stop e filtro aberto e campo de visão C (12,9 x 12,9 cm).
- Tampa ferida com molho fresco.
7. Ferida a medição e a imagem latente
- avaliar os sinais clínicos de animais diariamente 9.
- Fornecer alimento, água e alterar as gaiolas conforme necessário.
- Verificação de integridade de curativos diários. Quando o molho estiver presente, somente a bioluminescência pode ser medida devido à oclusão da ferida. No dia 8, curativos são removidos e substituídos não permitindo a medição de fechamento da ferida.
- Pesar animais cada outro dia.
- Para todos os dias, coloque os ratos individualmente em uma câmara de isolamento equipado com um filtro HEPA e a imagem usando o na vivo sistema de imagem diária ou a cada dois dias até que os valores de luminescência cair abaixo do nível do fundo.
- Após dia 8, induzir anestesia geral e leve micrografias da ferida com um microscópio com câmera anexada usando uma régua como referência todos os dias até que as feridas são curadas.
8. A análise histológica
- Euthanize os ratos com um fluxo de 2 l/min de CO 2 em uma eutanásia câmara depois de luminescência cai abaixo dos níveis de fundo e as feridas são completamente curadas. Confirmar a morte por deslocamento cervical como um segundo método de eutanásia.
- Use tesoura de íris para criar uma excisão completa, ampla em torno e sob a área da ferida (cerca de 1 cm de diâmetro) e preservar o tecido em paraformaldeído 4% para análise histológica.
- Outras análises: deteção de citocina
- coletar sangue retrô-orbitally de animais sob anestesia, usando um tubo de vidro capilar e transferi-lo para tubos tratados com EDTA.
- Centrifugar o sangue a 2.000 rpm por 20 min a 4 ° C e congelar o plasma para a deteção de citocina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
No desenvolvimento deste novo modelo, observamos muitas vantagens em utilizar sem pelos SKH-1 em camundongos C57BL/6J, que nós usamos no passado. Animais submetidos a injeções de STZ normalmente experimentam perda de peso gradual, com o aparecimento da diabetes; no entanto, na ferida cura experiências anteriormente realizado pelos nossos laboratórios reproduzindo o modelo apresentado por Dunn et al. (2012) 9 usando a perda de peso C57BL/6J, drástica foi observada (Figura 1). Em contraste, quando usando este ferimento modelo com camundongos SKH-1, observou-se uma perda de peso significativa estatisticamente inferior (P < 0,0001, teste de Mann-Whitney U). Além disso, não há mortes ocorreram a coorte de ratos diabéticos SKH-1 infectados com p. aeruginosa Xen 41 biofilmes, enquanto observou-se uma taxa de mortalidade de 40% para camundongos C57BL/6J infectado em experiências anteriores (Figura 2).
Outra vantagem para o modelo apresentado aqui é que o procedimento experimental para a etapa de remoção de cabelo obrigatória para camundongos C57BL/6J é desnecessário para camundongos SKH-1. Embora em nossas experiências anteriores com ratos cabelos atenção especial foi dada para minimizar a irritação à pele, algum dano ocorreu inevitavelmente (Figura 3). Nomeadamente, no entanto, a maior vantagem na utilização de camundongos sem pelos neste modelo é a eliminação do problema da re-crescimento de cabelo observada em estudos de cicatrização de feridas de longo prazo. Em nossa experiência com camundongos C57BL/6J, re-crescimento de cabelo variava de animal para animal, mas dada a natureza de longo prazo dos estudos, sempre ocorreu e interferiu com dimensões da área ferida ou ferida deslocado talas e/ou curativos utilizados para cobrir infectada feridas, potencialmente resultando em secagem da ferida (Figura 4).
No modelo de cura ferida SKH-1, após confirmação da diabetes, cirurgia pode facilmente ser executada para criar uma cheio-espessura circular ferida na parte de trás do animal. A tala do silicone é mantida no lugar por um adesivo de pele impermeável médica e evita o contato direto com o curativo oclusivo com o leito da ferida recém-criado (Figura 5).
P. aeruginosa Xen 41 bioluminescentes biofilmes cultivadas em membranas de policarbonato (Figura 6) são facilmente e assepticamente transferidos para uma seringa para estar preparado para a entrega para as feridas e os ratos inoculados são monitorados diariamente para clínicos sinais de infecção (Figura 7). Para este modelo, implementamos duas fases distintas. Na primeira fase, após a inoculação do biofilme a ferida estava rodeada por uma tala coberta com um penso oclusivo transparente. Isso resulta em acúmulo de pus que obstruído a ferida. Biofilme-contendo as feridas foram fotografadas diariamente com o na vivo de imagem de sistema para monitorar o desenvolvimento de infecção e avaliar a evolução do biofilme (Figura 8 e Figura 9). Bioluminescência, gravada o fluxo total (p/s), como pode ser correlacionada com densidade bacteriana utilizando uma curva padrão (Figura 10).
No dia 8, de tala e preparação foram removidos para permitir a visualização de cicatrização de feridas. Bioluminescência cai posteriormente devido à perda do pus ao redor da ferida; no entanto, as bactérias permaneceram associadas com a ferida, conforme determinado pela histologia. Esta abordagem de remover o curativo para medir a cicatrização de feridas tem sido utilizada em outras feridas crônicas cura estudos (REFs). Progressão de cicatrização de feridas podem ser determinada tendo micrografias com uma câmera acoplada a um microscópio (Figura 11).
Figura 1: porcentagem comparativa de perda de peso de ratos diabéticos SKH-1 e C57BL/6J. Dia zero corresponde ao peso no dia da última (5th) injeção de STZ. n = 10 ratos para SKH-1 e n = 12 ratos para C57BL/6J. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: taxas de porcentagem de sobrevivência de ratos diabéticos SKH-1 e C57BL/6J, após aplicação de biofilme de p. aeruginosa Xen 41 (dia 1). n = 5 ratos para SKH-1 e n = 10 ratos para C57BL/6J. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Lacerações de pele no futuro ferido área após fazer a barba e usar creme depilatório em camundongos C57BL/6J. (A): dia do procedimento; (B): 4 dias após o procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: (A) C57BL/6J mouse com uma tala de ferida parcialmente removido. (B) levantamento do splint revelou uma ferida curada rodeada de cabelo crescido novamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: procedimento cirúrgico para ferindo camundongos SKH-1. (A) demarcação com punch de biópsia; (B) esboço de demarcação; (C) ferindo concluída; (D) aplicação do adesivo de pele impermeável médica; Tala de colagem (E); (F) ferida coberta com curativo oclusivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: preparação do inóculo biofilme. (A) 72 h colônia biofilmes de Pseudomonas aeruginosa Xen 41 cultivadas em membranas de policarbonato; (B) medição de biofilme usando um syrinGE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: SKH-1 rato diabético 6 dias após o ferimento foi inoculado com o biofilme de p. aeruginosa Xen 41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: monitoramento de biofilme infecção de evolução de bioluminescência de rastreamento ao longo do tempo em ratos diabéticos do SKH-1. (A) dia do pedido de biofilme; (B) 5 dias post-biofilme; (C) 8 dias borne-biofilme; (D) 12 dias post-biofilme; (E) 16 dias post-biofilme; (F) 20 dias post-biofilme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Total fluxo de feridas em ratos diabéticos SKH-1, infectados com p. aeruginosa Xen 41 biofilmes durante o curso da experiência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: estimado CFU por ferida utilizando uma curva padrão de bioluminescência por UFC produzida com biofilmes de p. aeruginosa Xen 41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: cronograma Micrografia de feridas infectadas com p. aeruginosa Xen 41 biofilmes em diabéticos SKH-1 rato, mostrando a progressão da cura. Os dias após a infecção de biofilme são indicados no canto inferior esquerdo de cada imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui descrevemos um novo modelo de mouse para o estudo de biofilmes em feridas diabéticas crônicas que tem muitas vantagens para criar um modelo reproduzível, traduzível e flexível.
A primeira inovação é o uso de camundongos sem pelos. Outros modelos de mouse foram desenvolvidos para estudar diabética ferida crônica cura10,11, mas todos têm contado com o uso de ratos de cabelos que requerem a remoção de pelo por processos que envolvem a depilação ou corte de cabelo, combinado com cremes depilatórios. Esta etapa não é apenas demorado e confuso, mas potencialmente fere a pele dos animais na área onde será colocado o ferimento. Enquanto ratos sem pelos têm sido utilizados em uma série de estudos de carcinogênese12,13, estes ratos não tem sido usados para avaliar a persistência de biofilme em feridas crônicas. Outro problema comum resolvido pelo uso de animais sem pelos, especialmente em estudos de longo prazo, é re-crescimento de cabelo na área ferida, que pode comprometer a avaliação da cicatrização de feridas e perturbar a bandagem.
SKH-1 animais também se mostrou receptivos a induzida por STZ diabetes tipo e, em comparação com camundongos C57BL/6J, tinham estatisticamente significativa perda de peso mais baixa durante o curso do experimento, fazendo a dosagem com insulina desnecessária. Esta é uma característica particularmente interessante como tratamento com insulina pode potencialmente afetar o resultado de infecção, como evidenciado por Watters et al. (2014)14 , que descreveu um aumento em contagens bacterianas em animais diabéticos tratados com insulina infectados com P. aeruginosa biofilmes em comparação com contrapartes sem insulina. Além disso, em nosso modelo, houve uma redução drástica nas taxas de mortalidade na coorte sem pelos indicando que os animais são potencialmente mais resistentes em lidar com a infecção.
Uma segunda característica deste modelo é a aplicação de dejetos de inóculo de biofilme pré-formado medido para infectar as feridas em contraste com células cultivadas planctônicas. Entregando uma comunidade bacteriana já metabolicamente complexa e estruturada para a ferida, as células bacterianas são capazes de iludir o sistema imunitário e os efeitos imediatos dos biofilmes sobre as lesões podem ser determinados.
A terceira vantagem desse novo modelo de ferida é o uso de uma cepa microbiana capaz de produzir bioluminescência que pode ser medida com um na vivo de imagem de sistema para localizar e quantificar as bactérias, espacialmente. Isto permite o acompanhamento em tempo real da evolução do biofilme ao longo do tempo. A estirpe do Xen 41 de p. aeruginosa possui uma única cópia estável do operon luminescences p. luxCDABE no cromossomo bacteriano que resulta na emissão constitutiva de luminescência, que pode ser capturada pela câmera ultra sensível no sistema da imagem latente. Esse recurso em tempo real, não-invasivo, em situ permite medir de biofilme por bioluminescência, mesmo enquanto a tala e a tampa estão no lugar. Esta característica diminui drasticamente o número de animais necessários por estudo, como não há nenhuma necessidade de sacrificar animais em determinados pontos do tempo de monitoramento de biofilme. No entanto, a presença de biofilme e pus ocluídas cicatrização de medição. Neste estudo, nós removemos o curativo no dia 8, para permitir a visualização de cicatrização de feridas, mas este parâmetro pode ser modificado dependendo as questões a ser tratadas.
Por último, como o sistema de imagem é capaz de detectar a bioluminescência até 2,5 cm de profundidade, o modelo recentemente proposto é passível de testes de terapias antimicrobianas seja em forma de solução ou gel ou incorporadas para pensos oclusivos. Um modelo de controlo de infecção em tempo real permite muito maior flexibilidade medir o impacto de diferentes concentrações de dosagens e durações em oposição a um ensaio de ponto de extremidade estático. Este modelo pode contribuir para a validação dos potenciais tratamentos novos para erradicar biofilmes em feridas crônicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a associação americana de Diabetes para apoiar este trabalho (Grant # #7-13-BS-180), instalação suporte de Michigan estado Universidade pesquisa tecnologia para fornecer treinamento e acesso à na vivo sistema de imagem e o Michigan University investigativo histopatologia laboratório estadual para o processamento de biópsias para exame histopatológico do mouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
