Her beskriver vi en roman diabetiker murine modell utnytte hairless mus for sanntid, ikke-invasiv, overvåking av biofilm sårinfeksjoner av bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Denne metoden kan tilpasses å evaluere infeksjon i andre bakterie-art og genmodifiserte mikroorganismer, inkludert flere arter biofilm, og teste effekten av antibiofilm strategier.
Tilstedeværelsen av bakterier som strukturert biofilm i kroniske sår, spesielt i diabetespasienter, antas å hindre sårheling og oppløsning. Kronisk musen sår modeller har blitt brukt for forstå underliggende samspillet mellom mikroorganismer og verten. Modeller utviklet ennå stole på bruk av håret dyr og terminal samling av såret vev for fastsettelse av levedyktig bakterier. Mens betydelig innsikt har fått med disse modellene, denne eksperimentelle prosedyren krever et stort antall dyr og prøvetaking er tidkrevende. Vi har utviklet en roman murine modell som flere optimal evaluere biofilm progresjon i kroniske sår: en) den utnytter hairless mus, eliminerer behovet for hårfjerning; b) gjelder pre-formet biofilm sår tillater for umiddelbar evalueringen av utholdenhet og effekten av disse samfunnene på host; c) overvåker biofilm progresjon av kvantifisere lys produksjon av en genmodifisert bioluminescent stamme av Pseudomonas aeruginosa, slik at sanntids overvåking av infeksjonen dermed redusere antall dyr må etter studien. I denne modellen er et enkelt full-dybde sår produsert på baksiden av STZ-indusert diabetiker hairless mus og inokulert med biofilm av P. aeruginosa bioluminescent belastningen Xen 41. Lys-output fra sårene registreres daglig i en i vivo tenkelig system, slik at i vivo og i situ rask biofilm visualisering og lokalisering av biofilm bakterier i sårene. Denne romanen metoden er fleksibel som det kan brukes å studere andre mikroorganismer, inkludert genmodifiserte arter og flere arter biofilm, og kan være av spesiell verdi i testing anti-biofilm strategier, inkludert antimikrobielle occlusive bandasjer.
Biofilm er komplekse samfunn av mikroorganismer i en matrise polymere stoffer som har blitt markert som en medvirkende faktor for dårlig løsning av kroniske sår1. Studiet av disse godt organisert, vedvarende mikrobielle populasjoner er spesielt viktig for diabetiker pasienter hvor dårlig sirkulasjon på lemmer og endret perifere sensoriske mekanismer føre til uoppdaget lesjoner2. I USA anslås det at 15% av diabetespasienter vil utvikle minst én sår i løpet av livet. Dette betyr en økonomisk utgift på rundt 28 milliarder dollar behandling3,4, for ikke for å nevne immensurable følelsesmessige og sosiale byrden. Forstå faktorene at mikrobielle samfunn å vedvare i såret sengen og effekten disse biofilm har i helbredende hendelsene er viktig å kjøre bedre omsorg for pasientene påvirkes og drive utviklingen av nye behandlingsmetoder. Derfor er etableringen av reproduserbar og oversettbare i vivo modeller for å utforske bakteriell vert interaksjoner avgjørende.
Murine modeller har blitt utviklet for å studere virkningen av biofilm i kroniske sår. Disse modellene, men ofte utnytte håret arter og evaluere biofilm klarering av platen teller levedyktig bakterieceller forbrukeravgift vev fra ofret dyr, noe som gjør dem tidkrevende og kostbare.
Et biophotonic alternativ til endepunktet prøvetaking av dyr i evaluering infeksjon ble først foreslått av Contag et al. (1995) 5 , som utviklet en metode for å fange luminescence fra constitutively bioluminescent Salmonella typhimurium å måle antibiotikabehandling effekt. Andre studier utnytter bioluminescens-emitting bakterier fulgte. For eksempel Rochetta et al. (2001) 6 godkjent en infeksjon modell for å studere Escherichia coli lår infeksjoner i mus ved å måle luminescence bruker en intensivert kostnad – sammen enhet og senere, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 dro fordel av Foton emitting egenskapene til en konstruert stamme av Staphylococcus aureus å undersøke effekten av flere antibiotika i et kateter såret modellen i mus.
Metoden preget Her presenterer en enkel protokoll for å få diabetes i hairless mus, produsere og vaksinere sår med pre-formet bioluminescent biofilm av P. aeruginosa, og utføre biophotonic overvåking av infeksjon med en i vivo imaging system. Det tilbyr en direkte rask i situ, ikke-invasiv og kvantitativ prosessen å evaluere biofilm i kroniske sår og i tillegg gir ytterligere analyse som mikroskopiske bildebehandling av healing sår, intermitterende blod samling for cytokin målinger og terminal vev samling for histology.
Her beskriver vi en ny musemodell for å studere biofilm i diabetiker kroniske sår som har mange fordeler med å opprette en reproduserbare, oversettbare og fleksibel modell.
Den første innovasjonen er bruk av hairless mus. Andre mus modeller er utviklet for å studere diabetiker kronisk sårheling10,11, men alle har stolt på bruk av håret mus krever fjerning av pelsen av prosesser som involverer enten voksing eller hår klipping k…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne gjerne takke American Diabetes Association for å støtte dette arbeidet (Grant # #7-13-BS-180), Michigan State University Research teknologi støtte anlegg for gi opplæring og tilgang i vivo tenkelig system og Michigan State University undersøkende histopatologi Lab for behandling musen biopsier for histopathological eksamen.
Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |