Summary
Her beskriver vi en roman diabetiker murine modell utnytte hairless mus for sanntid, ikke-invasiv, overvåking av biofilm sårinfeksjoner av bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Denne metoden kan tilpasses å evaluere infeksjon i andre bakterie-art og genmodifiserte mikroorganismer, inkludert flere arter biofilm, og teste effekten av antibiofilm strategier.
Abstract
Tilstedeværelsen av bakterier som strukturert biofilm i kroniske sår, spesielt i diabetespasienter, antas å hindre sårheling og oppløsning. Kronisk musen sår modeller har blitt brukt for forstå underliggende samspillet mellom mikroorganismer og verten. Modeller utviklet ennå stole på bruk av håret dyr og terminal samling av såret vev for fastsettelse av levedyktig bakterier. Mens betydelig innsikt har fått med disse modellene, denne eksperimentelle prosedyren krever et stort antall dyr og prøvetaking er tidkrevende. Vi har utviklet en roman murine modell som flere optimal evaluere biofilm progresjon i kroniske sår: en) den utnytter hairless mus, eliminerer behovet for hårfjerning; b) gjelder pre-formet biofilm sår tillater for umiddelbar evalueringen av utholdenhet og effekten av disse samfunnene på host; c) overvåker biofilm progresjon av kvantifisere lys produksjon av en genmodifisert bioluminescent stamme av Pseudomonas aeruginosa, slik at sanntids overvåking av infeksjonen dermed redusere antall dyr må etter studien. I denne modellen er et enkelt full-dybde sår produsert på baksiden av STZ-indusert diabetiker hairless mus og inokulert med biofilm av P. aeruginosa bioluminescent belastningen Xen 41. Lys-output fra sårene registreres daglig i en i vivo tenkelig system, slik at i vivo og i situ rask biofilm visualisering og lokalisering av biofilm bakterier i sårene. Denne romanen metoden er fleksibel som det kan brukes å studere andre mikroorganismer, inkludert genmodifiserte arter og flere arter biofilm, og kan være av spesiell verdi i testing anti-biofilm strategier, inkludert antimikrobielle occlusive bandasjer.
Introduction
Biofilm er komplekse samfunn av mikroorganismer i en matrise polymere stoffer som har blitt markert som en medvirkende faktor for dårlig løsning av kroniske sår1. Studiet av disse godt organisert, vedvarende mikrobielle populasjoner er spesielt viktig for diabetiker pasienter hvor dårlig sirkulasjon på lemmer og endret perifere sensoriske mekanismer føre til uoppdaget lesjoner2. I USA anslås det at 15% av diabetespasienter vil utvikle minst én sår i løpet av livet. Dette betyr en økonomisk utgift på rundt 28 milliarder dollar behandling3,4, for ikke for å nevne immensurable følelsesmessige og sosiale byrden. Forstå faktorene at mikrobielle samfunn å vedvare i såret sengen og effekten disse biofilm har i helbredende hendelsene er viktig å kjøre bedre omsorg for pasientene påvirkes og drive utviklingen av nye behandlingsmetoder. Derfor er etableringen av reproduserbar og oversettbare i vivo modeller for å utforske bakteriell vert interaksjoner avgjørende.
Murine modeller har blitt utviklet for å studere virkningen av biofilm i kroniske sår. Disse modellene, men ofte utnytte håret arter og evaluere biofilm klarering av platen teller levedyktig bakterieceller forbrukeravgift vev fra ofret dyr, noe som gjør dem tidkrevende og kostbare.
Et biophotonic alternativ til endepunktet prøvetaking av dyr i evaluering infeksjon ble først foreslått av Contag et al. (1995) 5 , som utviklet en metode for å fange luminescence fra constitutively bioluminescent Salmonella typhimurium å måle antibiotikabehandling effekt. Andre studier utnytter bioluminescens-emitting bakterier fulgte. For eksempel Rochetta et al. (2001) 6 godkjent en infeksjon modell for å studere Escherichia coli lår infeksjoner i mus ved å måle luminescence bruker en intensivert kostnad - sammen enhet og senere, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 dro fordel av Foton emitting egenskapene til en konstruert stamme av Staphylococcus aureus å undersøke effekten av flere antibiotika i et kateter såret modellen i mus.
Metoden preget Her presenterer en enkel protokoll for å få diabetes i hairless mus, produsere og vaksinere sår med pre-formet bioluminescent biofilm av P. aeruginosa, og utføre biophotonic overvåking av infeksjon med en i vivo imaging system. Det tilbyr en direkte rask i situ, ikke-invasiv og kvantitativ prosessen å evaluere biofilm i kroniske sår og i tillegg gir ytterligere analyse som mikroskopiske bildebehandling av healing sår, intermitterende blod samling for cytokin målinger og terminal vev samling for histology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dyreforsøk ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Michigan State University.
1. forberedelse av Occlusive dressinger og silikon avstandsstykker
- kuttet gjennomsiktig occlusive dressing å gjøre rutene ca 1 cm x 1 cm med saks.
- Kutte 10 mm sirkler på 0,5 mm tykk silikon ark bruker en 10 mm biopsi punch. Center en 5 mm biopsi punch i 10 mm sirkelen og trykk fast for å lage et hull å danne en " bolle "-som plate som skal brukes som en splint.
2. forsøksdyr
- Bruk 8 uker gamle (22-26 g) mannlige SKH-1 mus fra en reklamen oppdretter. Holde mus i standard betingelser for 21 ° C og en 12 h lys og mørke syklus med gratis tilgang til mat og vann.
- For å indusere diabetes, injisere mus intraperitonially 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand 25% glukose (250 µl per / mus) på 5 dager.
- Gjør den STZ løsningen ved utvannende 65 µg av STZ i 5 µL av 100 mM sitronsyre, pH 4.5.
- Lydstyrken injisert for hver musen til siste masse 65 mg STZ per 1 kg musen kroppsvekt. Injisere kontroll mus med 100 mM sitronsyre løsningen pH 4.5 på samme dager.
- Bekrefte hyperglykemi ved blod glukose avlytting med en glucosemåler 14 dager etter siste STZ injeksjon. Diabetiker mus kan ha polyuri og så deres sengetøy må endres oftere for å eliminere fuktighet og deres vekter bør overvåkes 3 ganger i uken.
3. Biofilm
- Biofilm forberedelse
- vokse kolonien biofilm 8 å vaksinere sår. To dager før kirurgi en overnatting kultur av bioluminescent P. aeruginosa Xen 41 i tryptic soya kjøttkraft (TSB) ruges på 37 ° C og riste på 200 rpm og sterilisere polykarbonat membran filtre med 0,2 µm porestørrelse ved eksponering for UV lys i biologiske sikkerhetskabinett hette til 15 minutter per side.
- En dag før kirurgi sentrifuge natten kultur på 20.000 x g i 2 minutter og vaske 3 ganger med 1 mL av Dulbelcco ' s fosfat bufrede saltvann (DPBS) av pipettering opp og ned.
- Fortynne suspensjon i DPBS til en absorbansen av 0,05 på 600 nm.
- Pipette 10 µL av utvannet kultur på hver membran hviler på en tryptic soya agar (TSA) plate. Etter at tørke, ruge membraner ved 35 ° C i 72 h å vokse biofilm overføring til frisk TSA plater hver 24 h.
- Standardkurve
- før starten av eksperimentet gjøre en standard kurve å korrelere bioluminescens og bakteriell teller.
- Forberede biofilm som beskrevet i 3.1.
- Gjør føljetong fortynninger av biofilm spenner fra 1 til 1/24 ved å blande biofilm med DPBS og vortexing til en visuelt homogen løsning er produsert. Pipetter 200µL utvannet løsninger i en svart 96-brønns plate og bilde med i vivo tenkelig system.
- Spre plate fortynninger på TSA tallerkener og ruge ved 35 ° C i 24 h.
- Teller kolonien danner enheter (CFU) på plater, og lage en standard kurve for å sammenligne bioluminescens og bakteriell teller.
4. Sår kirurgi
- induserer narkose ved hjelp av isoflurane i 95% oxygen/5% CO 2 (for å forhindre dødsfall fra ketoacidosis) på en strømningshastighet på 1 L/min og opprettholde anestesi med 1-3% isoflurane. Opprettholde dyr på varme matter under operasjonen.
- Dypt pedal reflekser av musen er undertrykt av knipe foten med pinsett og plassere musen i liggende stilling.
- Administrere har meloksikam (0,2 mg/kg) via sub kutan injeksjon (30 μl) for smertebehandling.
- Tørke huden på ryggen med 10% povidon-jod tre ganger og en isopropanol pad.
- Bruker et sterilt 4 mm biopsi slag for å skissere en rundskriv mønster for såret på siden av musen ' s midtlinjen på nivå på skuldrene. Omriss mønster med en permanent penn.
- Bruke taggete tang for å løfte huden i disposisjon og iris saksen opprette et full-tykkelse sår som strekker seg gjennom subkutant vev inkludert panniculus carnosus og avgiftsdirektoratet sirkulær stykke vev.
- Gjelder en medisinsk vanntett hud selvklebende lim på huden av mus og plasser silikon pinnen bruke mildt press. Dekk såret med en gjennomsiktig occlusive dressing. Etter operasjonen, individuelt bur dyrene.
5. Postoperative Management
- administrere har meloksikam (0,2 mg/kg) én gang daglig via sub kutan injeksjon for postoperativ smerte lettelse for de neste 2 dagene.
- Monitor dyr daglig for manifestasjoner av smerte og vekttap. Diabetiker dyr trenger insulin injeksjoner når de har mistet 15% eller mer av kroppsvekten.
6. Biofilm Inoculum forberedelse og infeksjon
- vaksinere mus 48 timer etter operasjonen som beskrevet i fremgangsmåten.
- Skrape 72 h biofilm fra membraner bruker en steril slikkepott, plasserer den i et microcentrifuge rør og fortynne 1:2 i DPBS. Blandingen av kort pipettering opp og ned.
- Spredning plate inoculum på TSA plater til å beregne totale CFU. For å sikre at teller nøyaktig, bryte ned biofilm inoculum videre av en rekke to 1 min vortexing trinnene under Sommer steg en 2 min sonication på 40 kHz i en ultrasonisk renere.
- Fjerne dressing dekker såret og silikon splint og ta et mikroskop-bilde av såret med et mikroskop med vedlagte kameraet bruker en linjal for referanse.
- Kutte tips av 200 µL pipette-spisser og Pipetter 10 µL av biofilm inoculum på hver såret.
- Image musen med den i vivo imaging system som bruker auto-innstillinger: eksponering tid 5-300 s, med middels binning, 1 f/stopp og åpne filter og synsfelt C (12.9 cm x 12.9 cm).
- Cover sår med frisk dressing.
7. Såret måling og bildebehandling
- vurdere det kliniske underskriver av dyr daglige 9.
- Skaffe mat, vann og endre burene behov.
- Sjekke integriteten til dressinger daglig. Når dressing, kan bare bioluminescens måles på grunn av okklusjon av såret. På dag 8 dressinger er fjernet og erstattet ikke tillater måling av såret nedleggelsen.
- Veier dyr annenhver dag.
- For alle dager, plassere mus individuelt i en isolert kammer HEPA-filter og bilde med i vivo tenkelig system daglig eller hver dag før luminescence verdiene faller under bakgrunn nivå.
- Etter dag 8 kan indusere narkose og ta micrographs av såret med et mikroskop med vedlagte kameraet bruker en linjal for referanse annenhver dag til sår er helbredet.
8. Histologiske analyse
- Euthanize mus med en flyt av 2 l/min av CO 2 i en euthanasia kammer etter luminescence faller under bakgrunn nivåer og sårene blir fullstendig helbredet. Bekrefte død av cervical forvridning som andre av euthanasia.
- Bruke iris saks å opprette en bred, full excision rundt og under såret området (rundt 1 cm i diameter) og bevare vevet i 4% paraformaldehyde for histologiske analyse.
- Andre analyse: cytokin oppdagelsen
- samle blod retro-orbitally fra dyr under narkose bruker kapillær røret og overføre den til EDTA-behandlet rør.
- Sentrifuge blod på 2000 rpm for 20 min på 4 ° C og fryse plasma for gjenkjenning av cytokin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utviklingen av denne nye modellen, observerte vi mange fordeler i å utnytte naken SKH-1 over C57BL/6J mus, som vi har brukt tidligere. Dyr utsatt for STZ injeksjoner normalt oppleve gradvis vekttap med utbruddet av diabetes; imidlertid utført sår helbredelse eksperimenter tidligere av våre laboratorier gjengi modellen presentert av Dunn et al. (2012) 9 bruker C57BL/6J, drastiske vekttap ble observert (figur 1). I kontrast, når benytter denne modell med SKH-1 mus en statistisk signifikant lavere vekttap ble observert (P < 0.0001, Mann-Whitney U test). Videre skjedde ingen dødsfall i diabetiker SKH-1 mus kohort infisert med P. aeruginosa Xen 41 biofilm mens en 40% dødelighet ble observert for C57BL/6J infiserte mus i forrige eksperimenter (figur 2).
En annen fordel å modellen presentert her er at den eksperimentelle prosedyren for hår fjerning trinn obligatorisk for C57BL/6J mus er unødvendig for SKH-1 mus. Selv om våre tidligere eksperimenter med håret mus spesiell oppmerksomhet ble gitt til minimere irritasjon til hud, skjedde noe skade uunngåelig (Figur 3). Spesielt, men er den største fordelen i å utnytte hairless mus i denne modellen eliminering av problemet med hår ettervekst observert i langsiktig sårheling studier. Vår erfaring med C57BL/6J mus, hår ettervekst varierte fra dyr til dyr men gitt de langsiktige naturen av studiene, det alltid oppstod og forstyrret såret området mål eller forstuet såret Splinter og/eller bandasjer brukes til å dekke infisert sår, noe som kan resultere i tørking av såret (Figur 4).
I SKH-1 sår helbredelse modellen, når diabetes er bekreftet, kan kirurgi enkelt kjøres for å opprette en sirkulær full-tykkelse sår på baksiden av dyret. Den silikon holdes på plass av en medisinsk vanntett hud lim og unngår direkte kontakt fra occlusive dressing med nyopprettede såret seng (figur 5).
P. aeruginosa Xen 41 bioluminescent biofilm dyrket på polykarbonat membraner (figur 6) lett og tas aseptisk overføres til en sprøyte være forberedt for levering til sår og inokulerte mus overvåkes daglig klinisk underskriver av infeksjon (figur 7). For denne modellen implementert vi to distinkte faser. I den første fasen etter vaksinasjon av biofilm var såret omgitt av en splint dekket med en gjennomsiktig occlusive dressing. Dette resulterer i pus akkumulering som okkludert såret. Biofilm inneholder sår ble fotografert daglig med i vivo tenkelig system for å overvåke infeksjon utvikling og vurdere biofilm evolusjon (Figur 8 og figur 9). Bioluminescens, som totalt flux (p/s), kan være korrelert med bakteriell tetthet med en standard kurve (Figur 10).
På dag 8, ble skinne og dressing fjernet for å tillate effekt på sårtilheling. Bioluminescens synker senere på grunn av pus rundt såret; imidlertid forble bakterier assosiert med såret etter histology. Denne tilnærmingen for å fjerne dressing å måle sårheling blitt benyttet i andre kroniske sår helbredelse studier (REFs). Sårheling progresjon kan bestemmes ved å ta micrographs med et kamera festet til et mikroskop (Figur 11).
Figur 1: komparativ prosent vekttap SKH-1 og C57BL/6J diabetiker mus. Dag null tilsvarer vekt på dagen av siste (5th) STZ injeksjon. n = 10 mus for SKH-1 og n = 12 mus for C57BL/6J. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: prosent overlevelse av SKH-1 og C57BL/6J diabetiker mus etter P. aeruginosa Xen 41 biofilm søknad (dag 1). n = 5 mus for SKH-1 og n = 10 mus for C57BL/6J. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hud kuttskader i fremtiden såret området etter barbering og bruke depilatory kremen på C57BL/6J mus. (A): for fremgangsmåten. (B): 4 dager etter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: (A) C57BL/6J mus med en delvis fjernet såret skinne. (B) løft av pinnen avdekket et helbredet sår omgitt av nytt fullvoksen hår. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: kirurgisk prosedyre for såret SKH-1 mus. (A) avgrensning med biopsi slag; (B) omrisset av avgrensning; (C) såret fullført. (D) bruk av medisinsk vanntett hud lim; (E) liming skinne; (F) såret dekket med occlusive dressing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: utarbeidelse av biofilm inoculum. (A) 72 h kolonien biofilm av Pseudomonas aeruginosa Xen 41 dyrket på polykarbonat membraner; (B) måling av biofilm bruker en syrinGE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: SKH-1 diabetiker musen 6 dager etter at såret var inokulert med P. aeruginosa Xen 41 biofilm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: overvåking av biofilm infeksjon ved å spore bioluminescens utviklingen over tid i diabetiker SKH-1 mus. (A) dagen i biofilm programmet; (B) 5 dager innlegg-biofilm; (C) 8 dager innlegg-biofilm; (D) dager innlegg-biofilm; (E) 16 dager innlegg-biofilm; (F) 20 dager innlegg-biofilm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Total forandring fra sår i SKH-1 diabetiker mus infisert med P. aeruginosa Xen 41 biofilm i løpet av eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: anslått CFU per såret ved hjelp av en standard kurve av bioluminescens per CFU produsert med P. aeruginosa Xen 41 biofilm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: mikroskop-bilde tidslinje av sår infisert med P. aeruginosa Xen 41 biofilm diabetiker SKH-1 musen viser progresjon av healing. Dager etter biofilm infeksjon vises i nedre venstre hjørne av hvert bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en ny musemodell for å studere biofilm i diabetiker kroniske sår som har mange fordeler med å opprette en reproduserbare, oversettbare og fleksibel modell.
Den første innovasjonen er bruk av hairless mus. Andre mus modeller er utviklet for å studere diabetiker kronisk sårheling10,11, men alle har stolt på bruk av håret mus krever fjerning av pelsen av prosesser som involverer enten voksing eller hår klipping kombinert med depilatory kremer. Dette trinnet er ikke bare tidkrevende og rotete, men skader potensielt huden dyrene i området hvor såret skal plasseres. Mens hairless mus har blitt brukt i en rekke kreft studier12,13, har ikke disse musene brukt til å evaluere biofilm utholdenhet i kroniske sår. Et annet vanlig problem løst ved bruk av hårløse dyr, spesielt i langsiktige studier, er hår ettervekst i såret området, som kan sette evaluering av sårheling og forstyrre Bandasjering.
SKH-1 dyr også bevist mottakelig for STZ-indusert Type I diabetes og med C57BL/6J mus, hadde statistisk signifikant lavere vekttap i løpet av eksperimentet, gjør dosering med insulin unødvendig. Dette er en spesielt interessant trekk som behandling med insulin kan potensielt påvirke infeksjon utfallet som gjenspeiles av Watters et al. (2014)14 som beskrev en økning i bakteriell teller i insulin-behandlede diabetiker dyr infisert med P. aeruginosa biofilm i forhold til ingen insulin kolleger. I tillegg i vår modell var det en drastisk reduksjon i dødelighet i hairless kohort som indikerer at dyrene er potensielt mer motstandsdyktige i håndteringen av infeksjon.
En andre funksjonen av denne modellen er anvendelsen av målt pre-formet biofilm inoculum slurry å infisere sår i motsetning planktoniske voksen celler. Ved å levere en allerede metabolically komplekse og strukturert bakterielle samfunnet til såret, bakterieceller kunne unngå immunsystemet og den umiddelbare effekten av biofilm på lesjoner kan bestemmes.
Den tredje fordelen av denne sår modellen er bruk mikrobiell belastning produsere bioluminescens som kan måles med en i vivo imaging system til romlig lokalisere og kvantifisere bakterier. Dette gjør at sanntid sporing av biofilm utviklingen over tid. P. aeruginosa Xen 41 belastningen besitter en enkelt stabil kopi av P. luminescences luxCDABE operon på bakteriell kromosomet som resulterer i konstituerende utslipp luminescence, som kan være fanget av ultra-følsom kameraet i tenkelig system. Denne sanntid, ikke-invasiv, i situ funksjonen lar måling av biofilm av bioluminescens selv skinne og dekk er på plass. Denne funksjonen reduserer drastisk antall dyr nødvendig per studie, som det er ikke nødvendig å ofre dyr på bestemte tidspunkt for biofilm overvåking. Imidlertid okkludert biofilm og pus måling sårtilheling. I denne studien vi fjernet bandasjen på dag 8 å tillate visualisering av sårheling, men denne parameteren kan endres avhengig av spørsmål blir adressert.
Endelig tenkelig systemet er i stand til å oppdage bioluminescens opptil er 2,5 cm dybde, nylig foreslåtte modellen mottakelig for testing av antimikrobielle behandlinger enten i form av løsning eller gels eller innarbeidet til occlusive bandasjer. Sanntid infeksjon overvåking modell gir mye større fleksibilitet til å måle effekten av ulike dosering konsentrasjoner og varigheter i motsetning til en statisk end-point analysen. Denne modellen kan bidra til validering av potensielle romanen behandlinger å utrydde biofilm i kroniske sår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne gjerne takke American Diabetes Association for å støtte dette arbeidet (Grant # #7-13-BS-180), Michigan State University Research teknologi støtte anlegg for gi opplæring og tilgang i vivo tenkelig system og Michigan State University undersøkende histopatologi Lab for behandling musen biopsier for histopathological eksamen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al.
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
