Sebrafisk er en populær dyr modell å studere mekanismer for retinal degenerasjon/gjenfødelse virveldyr. Denne protokollen beskriver en metode for å indusere lokaliserte skade forstyrre ytre netthinnen med minimal skade indre netthinnen. Senere, overvåker vi i vivo retinal morfologi og Müller glia respons gjennom netthinnens gjenfødelse.
Fascinerende forskjell teleoster og pattedyr er livslang potensialet av teleost netthinnen for retinal neurogenesis og etter alvorlig skade. Undersøker gjenfødelse stier i sebrafisk kunne bringe ny innsikt å utvikle innovative strategier for behandling av netthinnens degenerative sykdommer i pattedyr. Her, fokuserte vi på induksjon av en fokal leksjonen på ytre netthinnen i voksen sebrafisk ved hjelp av en 532 nm diode laser. En lokalisert skade kan undersøke biologiske prosesser som finner sted under retinal degenerasjon og regeneration direkte på området skade. Bruker ikke-invasiv optical coherence tomografi (OCT), kunne vi definerer plasseringen av skadet område og skjerm påfølgende gjenfødelse i vivo. Faktisk produserer OCT bildebehandling med høy oppløsning, tverrsnittsstudie bilder av sebrafisk netthinnen, som gir informasjon som var tidligere bare tilgjengelig med histologiske analyser. For å bekrefte dataene fra sanntid OCT, histologiske delene ble utført og regenererende svar etter induksjon av netthinnen skaden ble undersøkt av immunhistokjemi.
Visjonen er trolig den viktigste følelsen av mennesket og dens verdifall har samfunnsøkonomiske inntrykk. I den industrialiserte verden utgjør netthinnens degenerative sykdommer flertallet av synstap og blindhet blant voksne1. Retinitis pigmentosa (RP) er den vanligste arvet årsaken til blindhet i folk mellom 20 og 60, påvirker ca 1,5 millioner mennesker verden over2,3. Det er en heterogen arvet retinal lidelser preget av progressiv tap av fotoreseptorer (PRs) etterfulgt av degenerasjon av netthinnens pigment epitel og, senere, gliosis og ombygging av indre neurons4. I løpet av sykdommen kan forklares av inkrementell tap av de to PR celletyper, vanligvis igangsetting med stenger, som er ansvarlig for akromatisk visjon i svakt lys og kjegler, som er essensielle for farge visjon og synsskarphet5. Ett gen feil er tilstrekkelig til å forårsake RP. Hittil er mer enn 130 mutasjoner i over 45 gener forbundet med sykdom6. Dette fører til varierende sykdom fenotyper er en grunn til at genterapi er ikke-generalizable og dermed intrikate terapeutisk tilnærming. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye generelle terapeutiske metoder å behandle netthinnens degenerations i blendende sykdommer.
Retinal degenerasjon ofte innebærer PR tap; Derfor er PR celledød et kjennetegn på utarte prosesser i netthinnen7. Det har allerede vist at PR celledød stimulerer Müller glia celle (MC) aktivisering og spredning8. MCs, hvilken stor glial celle i virveldyr netthinnen, en gang ble ansett å være noe mer enn en “limet” mellom retinal neurons. De siste årene, har mange studier vist at MCs handle mer enn bare strukturell støtte9. Blant de forskjellige funksjonene, MCs deltar også i neurogenesis og reparere10. Faktisk svar diffusible faktorer fra degenereres netthinnen økning MCs betydelig glial fibrillary Sure protein (GFAP) uttrykk. Derfor kan GFAP merking brukes som en markør for MC aktivisering som sekundær svar på netthinnen skader og degenerasjon11.
Nylig har utviklet vi en roman tilpasning av fokal skade bruker en laser til å indusere retinal degenerasjon i sebrafisk (Danio rerio). Fokal skade er fordelaktig for å studere bestemte biologiske prosesser som overføringen av celler på skadde området og nøyaktige tidspunktet for hendelser som finner sted under retinal gjenfødelse12. Videre har sebrafisk som den blitt viktige visuelle forskning på grunn av likheter mellom det visuelle systemet og andre virveldyr. Brutto morfologiske og histologiske funksjoner av menneskelige og teleost retinae viser noen forskjeller. Følgelig, menneskelige og sebrafisk retinae inneholder samme store celle klassene organisert i samme lagdelte mønster, der lyset-sensing fotoreseptorer okkupere det ytterste laget, mens retinal projeksjon neurons, ganglieceller, bor i innerste neuronal lag, proksimale linsen. Netthinnen interneurons, amacrine, bipolar, og vannrett celler, lokalisere mellom photoreceptor og ganglion celle lag13. Videre er sebrafisk netthinnen membran-dominert og derfor nærmere human netthinnen enn, for eksempel intensivt studerte gnager netthinnen. Fascinerende forskjell teleoster og pattedyr er den vedvarende neurogenesis fisk netthinnen og retinal regenerasjon etter skade. I sebrafisk, MCs dedifferentiate og megle gjenfødelse skadet netthinnen14,15. Kylling har MCs noen kapasitet også å skrive inn i cellen syklus og dedifferentiate. Etter retinal skade i voksen fisk, MCs vedta visse egenskaper stamfar og stamceller, overføre til skadede netthinnen vev og produsere nye nerveceller16. Gene expression profilering av pattedyr MCs avslørt uventede likheter retinal progenitors, og bevis for innebygde neurogenic potensialet i MCs i kylling, gnagere og aften human netthinnen vokser17. Likevel er regenerativ svaret fugler og pattedyr er lavere sammenlignet med robust svaret i fisk ennå ikke forstått. Forstå endogene reparasjon mekanismer i sebrafisk kan derfor foreslår strategier for stimulerende retinal gjenfødelse pattedyr og mennesker. Ansette endogene reparasjon mekanismen for MCs som et terapeutisk redskap for behandling av pasienter med retinal degenerasjon ville ha enestående betydning for samfunnet vårt.
Her gir vi de nødvendige trinnene nødvendig å ansette degenerasjon/gjenfødelse modellen i ophthalmica forskning. Vi fokuserte først på inducing fokal skade i neurosensory netthinnen, deretter på avbilding av hendelser utvikling i skaden nettstedet og endelig visualisere involvering av tilstøtende MCs. Generelle protokollen er relativt enkelt å utføre og åpner en rekke muligheter for å vurdere netthinnen etterpå.
Retinal gjenfødelse/degenerasjon i sebrafisk har blitt undersøkt av ulike tilnærminger som cytotoxin-mediert celle død22, mekanisk skade23og termisk skade24. Vi ansatt en 532 nm diode laser skade sebrafisk netthinnen. Dermed tilbyr vår modell flere fordeler. For eksempel, opprettet vi raskt et veldefinert område av skade lokalisert i ytre netthinnen, spesielt i PRs laget. Videre kan denne eksperimentelle set-up endres for å produsere større o…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Martin Zinkernagel, MD, PhD og Miriam Reisenhofer, PhD for henne vitenskapelige inn på etablering modell og Federica Bisignani for hennes utmerket kundestøtte.
Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |