Summary
Данио рерио является популярной модели животных для изучения механизмов сетчатки дегенерации/регенерации в позвоночных. Этот протокол описывает метод побудить локализованных травмы, нарушая наружной сетчатки с минимальным ущербом для внутренней сетчатки. Впоследствии мы осуществляем мониторинг в vivo сетчатки морфология и Мюллер глии ответ всей регенерации сетчатки.
Abstract
Увлекательный костистых млекопитающих отличается от непрерывного потенциал костистых сетчатки для сетчатки Нейрогенез и восстановление после серьезного ущерба. Исследование путей регенерации в zebrafish может принести новые идеи для разработки новаторских стратегий для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки в млекопитающих. Здесь мы сосредоточились на индукции фокуса поражения внешних сетчатки в взрослых рыбок данио посредством 532 нм Лазер диода. Локализованные травмы позволяет исследовать биологические процессы, которые происходят во время дегенерации сетчатки и регенерации непосредственно в зоне повреждения. С помощью неинвазивных оптическая когерентная томография (Окт), мы были в состоянии определить местоположение поврежденного монитора и области последующей регенерации в vivo. Действительно OCT изображений производит изображения с высоким разрешением, поперечного сечения данио рерио сетчатки, предоставляя информацию, которая была ранее доступна только с гистологическим анализом. Для подтверждения данных от реального времени октября, были исполнены Гистологические срезы и регенеративной ответ после индукции сетчатки травмы были исследованы иммуногистохимия.
Introduction
Видение, вероятно, наиболее важным чувство человека и его обесценения имеет высокие социально экономические последствия. В промышленно развитых странах дегенеративных заболеваний сетчатки составляют большинство потери зрения и слепоты среди взрослого населения1. Пигментный ретинит (RP) является наиболее распространенной причиной унаследованные слепоты у людей в возрасте от 20 до 60, затрагивающих примерно 1,5 миллиона человек во всем мире2,3. Это семейство разнородных наследственных заболеваний сетчатки, характеризуются постепенной утратой фоторецепторов (PRs) следуют дегенерация сетчатки пигментного эпителия и, впоследствии, глиоза и реконструкция внутренних нейронов4. Течение заболевания можно объяснить добавочные потери двух типов клеток PR, обычно начиная с стержней, которые отвечают за ахроматические видение в тусклом свете и конусов, которые необходимы для цвет видение и острота5. Дефект одного гена достаточно, чтобы вызвать RP. Пока более чем 130 мутаций в генах, более 45 были связаны с болезнью6. Это приводит к той или иной болезни фенотипы и является одной из причин, что генная терапия не обобщаемым и таким образом замысловатые терапевтический подход. Таким образом существует настоятельная необходимость разработать новые общие терапевтические подходы для лечения дегенерации сетчатки в ослепительно заболеваний.
Дегенерация сетчатки часто включает в себя потери PR; Таким образом смерть клетки PR является отличительной чертой дегенеративных процессов в сетчатке7. Уже было продемонстрировано, что смерть клетки PR стимулирует Мюллер глии клеток (MC) активации и распространения8. МКН, тип основных глиальных клеток сетчатки позвоночных, когда-то считались не более чем «клей» между сетчатки нейронов. В последние годы многие исследования показали, что MCs действовать как больше, чем просто структурной поддержки9. Среди различных функций MCs также участвуют в Нейрогенез и ремонт10. Действительно в ответ на diffusible факторов от вырождающихся сетчатки, MCs значительно увеличить глиальных фибриллово кислой (СВМС) белков. Таким образом СВМС маркировки может использоваться в качестве маркера для активации MC в средней ответ сетчатки травмы и дегенерации11.
Недавно мы разработали Роман адаптации фокуса травмы с помощью лазера, чтобы побудить дегенерации сетчатки в данио рерио (Danio рерио). Для изучения некоторых биологических процессов, таких как миграция клеток на потерпевшего сайт и точное время событий, которые происходят во время регенерации сетчатки12выгодно фокуса травмы. Кроме того данио рерио стало важным в визуальные исследования из-за сходства между своей зрительной системы и других позвоночных. Грубые гистологических особенностей человека и костистых retinae отображать несколько различий. Соответственно человека и данио рерио retinae содержат те же классы основных клеток, организованной в той же многоуровневой схеме, где светочувствительных фоторецепторов занимают внешний слой, в то время как сетчатки проекции нейронов, клетках ганглия, проживают в сокровенное нейронов слоя, проксимальнее объектива. Сетчатки интернейронов, Амакриновые, биполярный и горизонтальные клетки, локализовать между фоторецептор и ганглий клеток слои13. Кроме того данио рерио сетчатки, доминировали в конус и поэтому ближе к человека сетчатки, чем, например, интенсивно изучали грызунов сетчатки. Увлекательный костистых млекопитающих отличается от стойких нейрогенез рыбы сетчатки глаза и сетчатки восстановление после повреждения. В данио рерио MCs можно дедифференцироваться и посредником регенерации в раненых сетчатки14,15. В курицу MCs имеют некоторые способности также повторно ввести клеточного цикла и дедифференцироваться. После сетчатки травмы в взрослых рыб MCs принять определенные характеристики прародителем и стволовых клеток, перенести поврежденных тканей сетчатки и производить новые нейроны16. Ген выражение профилирование млекопитающих МКН показал неожиданные сходство сетчатки прародителями, и доказательств для встроенных нейрогенный потенциал МКН в курицу, грызунов и даже человека сетчатки растет17. Тем не менее, почему восстановительной реакции у птиц и млекопитающих ниже по сравнению с надежным ответом в рыбе не еще не понимается. Таким образом понимание механизмов внутреннего ремонта в zebrafish может предложить стратегии стимулирования регенерации сетчатки в млекопитающих и человека. Используя механизм эндогенного ремонт МКН как лечебное средство для лечения больных с дегенерация сетчатки скажется выдающийся для нашего общества.
Здесь мы предоставляем шаги необходимо использовать модель дегенерации/регенерации в офтальмологических исследований. Мы в первую очередь на вызывающие фокуса повреждения в нейросенсорной сетчатки, затем по визуализации событий, развивающихся на сайт травмы и наконец визуализации участие соседних MCs. Общий протокол относительно легко выполнить и открывает широкий спектр возможностей для оценки сетчатки потом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все эксперименты присоединилась к заявлению для использования животных в глазной и видение исследований ассоциации исследований зрения и офтальмологии (Арво) и соблюдать соответствующие правила правительственных властей.
1. Животные
- поддерживать TgBAC (gfap:gfap-GFP) данио рерио, 167 (AB) сорт в возрасте 6-9 месяцев в стандартных условиях в воде с температурой 26,5 ° C и свет/темно цикла 14/10 h 18.
- Следовать руководящим принципам ухода за животными участвующих учреждений для экспериментов на животных после утверждения государственными органами.
2. Реверсивные системных анестезии
- подготовить раствор 3-аминобензоат этиловый метансульфонат соли (tricaine), растворяя 400 мг tricaine порошка в 97,9 мл резервуар для воды и 2.1 мл 1 м трис буфер солевой раствор (TBS). Приспособиться к pH 7.0 с 1 М трис (рН 9) и хранить при 4 ° C в темной вверх до одного месяца.
Примечание: Tricaine должен быть подготовлен в воде, как естественной жизни животного, предпочтительно должны использоваться оригинальные бак воды. - Разбавить раствор 1:25 в резервуар для воды и немедленно использовать.
- Место данио рерио в 10 см Петри, содержащие 50 мл раствора анестезии, до тех пор, пока они становятся неподвижными и не реагировать на внешние раздражители (приблизительно 2-5 мин, в зависимости от веса и возраста).
- Передачи каждой рыбы вручную на заказ силиконовые штырь держатель для лазерного лечения ( рис. 1A).
ВНИМАНИЕ! Рыбы может оставаться наркотизированных снаружи цистерны для только до 10 мин. - Обратить вспять анестезии после лечения и/или изображений, место данио рерио в контейнер, содержащий бак воды.
- Для поддержки восстановления, создайте поток свежей бак воды через жабры, перемещая данио рерио взад и вперед в воде.
3. Лазерная фокуса травмы на сетчатке
Примечание: 532 нм диодный лазер используется для создания координационных легкие повреждения на сетчатке данио рерио. Экспериментальная установка лазера позволяет создание воспроизводимых фокуса сетчатки травмы в взрослых рыбок данио.
- Создана выходная мощность лазера: 70 МВт; воздушная диаметр: 50 мкм; длительность импульса: 100 г-жа
осторожно! Использование лазерного света требует надлежащей личной защиты и маркировки области. - Применяют 1-2 капли 2% гидроксипропилметилцеллюлоза местно в глаза до лечения и использовать линзы лазера глазного дна 2,0 мм для направленного лазерного луча на сетчатке.
ВНИМАНИЕ! гидроксипропилметилцеллюлоза капли вязки и может вызвать проблемы в дыхание, если она идет на жабрах. - Место четыре лазерного пятна вокруг зрительного нерва в левой части глаз и использовать право, неочищенные глаз как внутреннего контроля.
4. В естественных условиях Визуализационная диагностика сетчатки морфология
- на день 0, визуализировать данио рерио сетчатки непосредственно после индукции лазер без возрождения их от анестезии. Во всех других моментов времени, используют общий наркоз (см. раздел 2: реверсивный системных анестезии). Место иммобилизованных данио рерио на заказ силиконовые штырь держатель ( рис. 1 Б, в.1).
- Для получения оптимального изображения, вырезать коммерчески доступных гидрогелевые контактные линзы в соответствии глаз данио рерио (Ø = 5,2 мм, r = 2,70 мм, толщина центр = 0,4 мм) с помощью дырокол. Залейте метилцеллюлоза вогнутой поверхности объектива и поместите его над роговицы.
- Оснащения системы OCT с 78D бесконтактный щелевой лампы объектив.
- Фокус инфракрасный (ИК) изображения в ИК + режим октября ( рисунок 2A) для визуализации глазного дна и принимать ИК картинки, нажав " приобретать " кнопку ( рис. 2B) для локализации лазерного пятна на сетчатке, с использованием системы ' программного обеспечения s.
- Визуализация трехмерных раздела слоев сетчатки в ИК + OCT режиме и принимать фотографии, нажав " приобретать " кнопку ( рис. 2B). Наблюдать за тяжести травмы в наружном слое ядерной (ONL) (см. раздел 3: Лазерные фокуса травмы на сетчатке) в этих изображениях.
- Обратить вспять анестезии, после лечения и/или изображений место данио рерио в контейнер, содержащий бак воды.
- Для поддержки восстановления, создайте поток свежей бак воды через жабры, перемещая данио рерио взад и вперед в воде.
- Выполнять аналогичные в vivo томография сетчатки морфологии на день 1, 3, 7, 14 и неделя 6.
5. Гематоксилином & эозином (H & E) окрашивания
- усыпить данио рерио путем погружения в холодной (4 ° C) анестезии решения на льду, по крайней мере 10 минут и enucleate глаза сразу же с помощью небольшой Изогнутый пинцет.
- Исправить весь глаз в параформальдегида 4% (PFA) в фосфатный буфер (PBS) при 4 ° C для 20 h и затем обезвоживает образцы в серию градуированных алкоголя (ксилол 100% для 5 минут дважды, этанол 100% для 5 минут дважды, этанол 96% за 3 мин дважды и этанол 70% 3 ми n раз).
ВНИМАНИЕ! PFA может вызвать раздражение глаз, носа и верхние дыхательные пути. PFA-это известный канцероген человека и предполагаемого репродуктивного риска. - Внедрить образцы в парафин, вырезать 5 мкм секции на уровне головы зрительного нерва и смонтировать их на стеклянных вставках.
- Пятно deparaffinized секции с 0,1% раствор кислоты гематоксилином 5 мин и окунуть слайды два раза в дистиллированной воде после погружения слайды в смесь соляной кислоты (2 мл 25% HCl в 250 мл дистиллированной воды) и аммиака mix (2 мл 25% аммиака в 250 мл дистиллированная вода). Пятно секции с эозином G водный раствор 0,5% за 3 мин после развития гематоксилином пятнать водопроводной воды для по крайней мере 10 мин
- Маунт обезвоженной слайды в монтаж акриловой смолы и наблюдать слайды в световой микроскоп.
6. Иммуногистохимия для активации MC
- тепла deparaffinized секций в буфере извлечения антигена (Tris-ЭДТА + 0,05% неионный тензид, рН 9,0) 3 мин в соответствующие пароход или микроволновой на 10-15 минут и промыть TBS три раза за 5 мин.
- Круг в разделах с силиконовой ручкой и 100 мкл преграждая разрешение (TBS + 10% козий нормальной сыворотки + 1% бычьего сывороточного альбумина, рН 7,6) при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Пятно с анти глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) кролика polyclonal антитела и анти глютамина синтетаза (GS) мыши моноклональные антитела, оба в разведении 1: 200 (40 мкл на сэмпл). Инкубируйте слайд в увлажненные камере при температуре 4 ° C на ночь. Вымойте три раза с TBS + 0.1% Tween-20 для 5 мин.
- Отделка визуализации с соответствующим вторичные антитела. Этот протокол используется коза кролика против IgG H & L зеленый вторичное антитело для СВМС и коза анти мыши IgG H & ярко-красный для GS, оба в разведении 1: 500, при комнатной температуре в течение 1 ч. Л
- Крепление слайды с монтажа носитель, содержащий DAPI и наблюдать слайды под флуоресцентным микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Реальном времени OCT: для того чтобы проанализировать роль МКН в сетчатки ремонт, мы использовали модель травмы лазер, вызывая четко разграничить зоны повреждения сетчатки у рыбок данио. На сайте ущерб был образы с помощью OCT в естественных условиях в первый раз (день 0) в течение 60 минут после травмы (рис. 3). Для компенсации оптики глаза рыбы, на заказ контактных линз был помещен на роговице. Сразу же после лазерного лечения диффузных гипер Светоотражающий сигнал был локализован внешней сетчатки (стрелки). Она также из пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС) внешний сплетениевидный слой (ОБН). Аналогичный сигнал был также обнаруживаемая на 1 день. После 3-й день диффузный сигнал стала более организованной и плотной. Он постоянно был замечен в ядерный слой (ONL) расширение в фоторецепторных слой. После первой недели (7 дней) существует значительное уменьшение поражения среднего размера и только небольшие гипер Светоотражающий сигнал был обнаружен. Начиная с дня 14 до тех пор, пока последний момент расследование (неделя 6), лазерного пятна уже не были видны в ИК и OCT изображений.
Гистологическая Оценка дегенерации сетчатки/регенерации: с целью изучения масштабов и кинетика дегенерации сетчатки/регенерации, H & E пятнать работал в разное время очков после повреждения индукции (день 0, 1, 3, 7, 14 и неделю 6) (рис. 4). Эксперименты были проведены на три глаза три рыбы. Однако не статистический анализ проводился как цель этой рукописи заключается в демонстрации метода. Тонкие изменения в внутренний ядерный слой (INL) и ONL может быть увидено немедленно после лазерной (например, небольшой отек в ONL) и снижение межклеточного пространства в INL в течение 60 минут после лазерного лечения. Вырождение последовал за 6 недель после индукции лазерной травмы. Морфологические изменения наблюдались последовательно после 1 день с дезорганизация СБН и формирование полости в ONL и субретинальное пространстве. Действительно была потеря ядер в рамках ONL в районе ущерба между 1 и 7 дней. Максимальная потеря PR был найден на 3 день. Начиная от 14 дней до 6 недель, внешняя сетчатки восстановила его нормальной морфологии.
Глиальные участие во время сетчатки дегенерации/регенерация: оценить MC активации в разное время точках (день 0, 3, 14) после индукции дегенерация сетчатки, мы провели Иммуногистохимический анализ глиальных клеток маркеров GS и СВМС (рис. 5). Эксперименты были снова на три глаза три рыбы без количественного анализа. GS играет важную роль в контроле уровня внеклеточной глутамата и считается исключительно выражаться в MC сома и его процессы19,20. СВМС является upregulated во время старения и когда повреждена или подчеркнул сетчатке. Он локализуется в конце MC-ноги и обрабатывает21. Слабая СВМС выражение было также найдено во внутренней части сетчатки непострадавший контроль маркировки других типов глиальных клеток, например, астроциты. Аутофлюоресценция сегментов внешний PR также сигнал в ONL, но это может быть четко выделяются. СВМС сигнал был upregulated на 3 день после травмы. Таким образом анализы на 3 день после применения лазерного лечения показал СВМС позитивных MCs только в пределах сайта травмы в ONL сетчатки. День 14 регенерации была практически завершена и СВМС сигнал был downregulated для базового уровня в зоне повреждения. В отличие от СВМС был не значительные изменения в уровне GS выражения. Однако возможно были локализованные Даунрегуляция GS на месте травмы.
Рисунок 1: Установка для индукции лазер травмы данио рерио сетчатки и после анализа Окт. (A) Организация лазерной системы до лечения. Данио рерио (A.1) размещены на силиконовые ПИН держатель с фундус контактные линзы в месте просто до применения лазерного луча. (B) организация системы октября перед изображений. Данио рерио (в.1) размещены до 78D щелевой лампы объектив до обнаружения места повреждения с помощью Окт пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Установка для получения изображений ИК и Окт. (A) скриншот окна программного обеспечения во время визуализации. Изображены режимы ИК и октября. (B) Обзор панели используется для получения изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: IR (слева) и Сен (справа) изображения раненых и ранен участков сетчатки в том же глаз в разное время очков (дней 0, 1, 3, 7, 14 и неделя 6) после лазерного дегенерация сетчатки. В ИК изображения зеленый флажок указывает часть сетчатки, что имеет быть проанализированы и зеленая линия показывает расположение OCT изображения на сетчатке. Стрелки указывают сайты лазерного пятна, обнаружены как гипер Светоотражающий сигналов в баре октября шкалы = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: H & E окрашивание раненых и контралатерального непострадавший данио рерио глаз в разное время очков (дней 0, 1, 3, 7, 14 и неделя 6) после лазерного дегенерация сетчатки. GC, слоя клеток ганглия; INL, внутренний ядерный слой; ONL, ядерный слой. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Иммуногистохимическое определение активации MC. СВМС (зеленый) и GS (красный) окрашивание сетчатки данио рерио раненых и ранен в разное время очков (дней 0, 3, 14) после лазерного дегенерации сетчатки. Зеленый сигнал в ONL-за аутофлюоресценция PR oUter сегментов. Ядра клеток окрашенных с DAPI (синий). Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Регенерации/дегенерация сетчатки в zebrafish были расследованы различных подходов, таких как cytotoxin опосредованной клеток смерти22, механическая травма23и термической травмы24. Мы использовали 532 нм Лазер диода повреждения сетчатки у рыбок данио. Таким образом наша модель предлагает несколько преимуществ. Например мы быстро созданы четко определенные области травмы, локализованных в наружной сетчатки, специально в слое PRs. Кроме того эта экспериментальная установка может быть изменен производить большие площади повреждения для изучения других биологических процессов, например, путем повреждения мембраны Бруха побудить хориоидеи неоваскуляризации. Существует минимальный сопутствующего ущерба и времени восстановительной реакции можно модулировать можно воспроизвести и точно.
Чтобы следовать фенотипические изменения с течением времени, мы использовали Heidelberg Spectralis системы и Гейдельберг глаз исследователя программного обеспечения. Таким образом томография глазного дна ИК оказалась особенно полезны в данио рерио. В отличие от аутофлюоресценция глазного дна (AF), который показывает низкий контраст между пятно лазера и его окрестностях, поврежденных участков, легче локализовать, ИК-изображений. Это позволяет нам обнаружить изменения и мониторинга регенерации в vivo, который не представляется возможным с режимом АФ. Как сообщалось ранее25OCT может использоваться для мониторинга дегенеративных/восстановительные процессы в сетчатке данио рерио. В нашей модели повреждения сетчатки лазер был обнаружен как гипер светоотражающая полоса в ONL (рис. 3), который похож на то, что было сообщено в млекопитающих26. Во время регенерации гипер Светоотражающий сигнал сократилась до тех пор, пока он полностью исчез на 14 день.
Окт изображения коррелировали с морфологические изменения, видел в лазерной поражений (рис. 4). Диффузный гипер Светоотражающий сигнал в OCT изображения (день 0) представляет изменения после лазерной, видели в INL данио рерио умерщвлены в течение 1 часа после лазерного лечения. Тонкие и устранив гипер Светоотражающий сигнал обнаружен на 3 день соответствует формирование полости в ONL из-за потери стержня. Начиная с дня 14, оба OCT и гистологические анализы подтверждают, что внешняя сетчатки восстановила его нормальной морфологии.
В настоящем исследовании мы также оценивали MC ответ во время регенерации сетчатки (рис. 5). Многие группы уже исследовали активации глиальных клеток, особенно MCs, как первоначальный регенеративной ответ на повреждения. Говоря более конкретно они предложили, что патофизиологические MC активации могут побудить MCs принять характеристики стволовых клеток, обеспечивая эндогенного источник новых функционирующих типов клеток, которые могут быть интегрированы в поврежденные участки сетчатки27. Как и ожидалось, мы обнаружили, что повреждения сетчатки лазерной стимулировали MC активации как указано upregulation СВМС. Действительно увеличение СВМС выражение удивительно был обнаружен в 3 дня после травмы и был ограничен в область повреждения. Начиная с дня 14, регенерации была практически завершена и СВМС сигнал был downregulated для базового уровня в зоне повреждения. Таким образом мы показали, что MCs играть активную роль в реорганизации сетчатки и потенциально регенерации, после травмы.
В заключение, лазерно индуцированным сетчатки дегенерации/регенерации модель-это универсальный инструмент для получения быстрого и фокуса повреждение сетчатки данио рерио и следующей регенерации могут быть визуализированы, неинвазивная изображений Окт. Кроме того мы смогли показать, что дегенерация сетчатки глаза лазера сопровождается MC активации и что последующие глиоза восстанавливается после регенерации. Однако детальное исследование типов связанных ячеек (например, микроглии, макрофаги) и пути необходимо выполнить. Критические изменения могут быть необходимы, особенно жить слежения MCs, чтобы лучше понять, как они ведут себя во время рекуперативного процесса (например, миграция из их исходного местоположения в МНЗ в наружной сетчатки, особенно в слое PRs) и их дифференциация по PR клетки. Кроме того легкие повреждения парадигмы могут использоваться побудить широкое и последовательное потери стержня и конус PRs28. Однако преимущество описывается модель является более определенные травмы уголок, где можно изучить местные взаимодействие между вырождающихся фоторецепторных клеток и активированных MCs.
В целом мы считаем, что модель поможет лучше понять дегенеративных/регенеративные процессы в Нейросенсорная Сетчатка и может включить сравнение этих событий с системе млекопитающих. Он может также использоваться для изучения влияния иммунной системы и воздействию нейроактивный веществ. В будущем один может быть в состоянии использовать эти результаты для изменения вырождающихся зрительной системы человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Martin Zinkernagel, MD, PhD и Мириам Reisenhofer, PhD за ее научного вклада в создание модели и Федерика Bisignani за ее превосходную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
