Summary
O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.
Abstract
Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é o potencial ao longo da vida da retina teleósteos para retina neurogênese e regeneração após danos graves. Investigar os caminhos de regeneração no zebrafish pode trazer novas perspectivas para desenvolver estratégias inovadoras para o tratamento de doenças degenerativas da retina em mamíferos. Neste documento, enfocamos a indução de uma lesão focal da retina exterior no zebrafish adulto por meio de um laser de díodo 532 nm. Uma lesão localizada permite investigar os processos biológicos que ocorrem durante a degeneração da retina e regeneração diretamente na área de danos. Usando a tomografia de coerência óptica não-invasiva (OCT), fomos capazes de definir a localização da regeneração subsequente danificada área e monitor in vivo. Com efeito, imagens OCT produz imagens de alta resolução, transversais da retina zebrafish, fornecendo informações que anteriormente só existiam disponíveis com análise histológica. A fim de confirmar os dados de outubro em tempo real, realizaram-se cortes histológicos e resposta regenerativa após a indução da lesão da retina foi investigada por imuno-histoquímica.
Introduction
Visão é, provavelmente, o sentido mais essencial do ser humano e sua deficiência tem um alto impacto sócio-económico. No mundo industrializado, doenças degenerativas da retina representam a maioria da perda de visão e cegueira entre a população adulta de1. Retinite pigmentosa (RP) é a causa herdada mais comum de cegueira em pessoas entre as idades de 20 e 60, afetando aproximadamente 1,5 milhões de pessoas em todo o mundo2,3. É uma família heterogénea de desordens hereditárias da retina, caracterizada por perda progressiva dos FOTORRECEPTORES (PRs) seguido de degeneração do epitélio pigmentar da retina e, posteriormente, gliose e remodelação de neurônios interna4. O curso da doença pode ser explicado pela perda incremental a dois tipos de células PR, geralmente começando com as hastes, que são responsáveis pela visão acromática na penumbra e os cones, que são essenciais para cor visão e acuidade visual5. Um defeito único gene é suficiente para causar a RP. Até agora mais de 130 mutações em mais de 45 genes têm sido associadas com a doença6. Isto leva a diferentes fenótipos de doença e é uma razão que a terapia genética é não-generalizáveis e, portanto, uma abordagem terapêutica intrincada. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas abordagens terapêuticas gerais para tratar os degenerations retinais em cegueira doenças.
Degeneração da retina, muitas vezes envolve a perda do PR; Portanto, a morte celular de PR é uma característica dos processos degenerativos na retina7. Já foi demonstrado que a morte de célula PR estimula Müller glia célula (MC) ativação e proliferação8. MCs, o tipo de célula glial principais na retina vertebrado, foram considerados uma vez como nada mais do que uma "cola" entre os neurônios da retina. Nos últimos anos, muitos estudos têm mostrado que os MCs agir como mais do que mera estrutural suportam9. Entre as diferentes funções, MCs também participem neurogênese e reparar10. Com efeito, em resposta a fatores diffusible da retina degeneração, MCs aumentam significativamente a expressão de proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Portanto, GFAP rotulagem pode ser usado como um marcador para ativação de MC como uma resposta secundária a lesão da retina e degeneração11.
Recentemente, nós desenvolvemos uma adaptação do romance de lesões focais, usando um laser para induzir a degeneração da retina no peixe-zebra (Danio rerio). Lesão focal é vantajoso para o estudo de certos processos biológicos, como a migração de células no local da ferida e o momento exato de eventos que ocorrem durante a regeneração da retina12. Além disso, o zebrafish tornou-se importante na pesquisa visual por causa das semelhanças entre o seu sistema visual e o dos outros vertebrados. Brutas características morfológicas e histológicas de humanos e teleósteos retinae exibem algumas diferenças. Por conseguinte, humanos e zebrafish retinae contêm as mesmas classes de célula principais organizadas no mesmo padrão em camadas, onde sensor de luz fotorreceptores ocupam a camada mais externa, enquanto os neurônios de projeção da retina, as células ganglionares, residem nas intimidades camada neuronal, proximal à lente. Os interneurônios da retina, o amacrine, bipolar e células horizontais, localizar-se entre o fotoreceptor e gânglio célula camadas13. Além disso, a zebrafish retina é cone-dominado e, portanto, mais próximo da retina humana que, por exemplo, a retina de roedor intensivamente estudada. Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é a neurogênese persistente na retina de peixe e regeneração da retina após danos. No zebrafish, MCs podem dedifferentiate e mediar a regeneração em retina lesada14,15. Frango, MCs têm alguma capacidade também para re-introduzir o ciclo celular e dedifferentiate. Após lesão da retina em peixes adultos, MCs adoptarem certas características do progenitor e células-tronco, migram para o tecido danificado da retina e produzem novos neurônios16. Gene expressão perfilação de mamíferos MCs revelou inesperadas semelhanças com progenitores da retina, e evidência de potencial neurogênica intrínseca de MCs no frango, roedores e retina humana está crescendo17. No entanto, porque a resposta regenerativa em aves e mamíferos é menor comparada com a resposta robusta em peixes não é ainda compreendida. Portanto, compreender os mecanismos de reparação endógena no zebrafish pode sugerir estratégias para estimular regeneração da retina em mamíferos e seres humanos. Empregar o mecanismo de reparação endógena de MCs como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de pacientes com degeneração da retina teria um impacto notável para a nossa sociedade.
Neste documento, nós fornecemos as etapas necessárias para empregar o modelo de degeneração/regeneração em pesquisa oftálmica. Primeiro enfocamos induzindo focal danos na retina marcante, em seguida, sobre as imagens dos eventos, desenvolvendo-se no local da lesão e finalmente revelador envolvimento dos MCs adjacentes. O protocolo geral é relativamente fácil de executar e abre uma grande variedade de possibilidades para avaliar a retina depois.
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Protocol
todos os experimentos aderiu à instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisas da Associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) e respeitar os regulamentos relacionados das autoridades governamentais.
1. animais
- TgBAC manter (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 estirpe de (AB) com idade entre 6-9 meses em condições normais na água com uma temperatura de 26,5 ° C e um ciclo claro/escuro de 14/10 h 18.
- Seguir as orientações de cuidados com animais das instituições envolvidas para as experiências em animais após aprovação pelas autoridades governamentais.
2. Anestesia sistêmica reversível
- Prepare a solução-mãe de sal de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato etílico (tricaina) dissolvendo-se 400 mg de pó tricaina em 97,9 mL de água do aquário e 2,1 mL de 1 M de Tris tampão salino (TBS). Ajustar o pH 7.0 com 1 M Tris (pH 9) e loja a 4 ° C, no escura acima de um mês.
Nota: Tricaina deve ser preparada em água como as condições de vida natural do animal, de preferência água de tanque original deve ser usada. - Diluir a solução-mãe 01:25 na água do tanque e use imediatamente.
- Colocar o zebrafish em uma placa de Petri contendo 50 mL de solução de anestesia, até que eles ficam imobilizados e não respondem aos estímulos externos (aproximadamente 2-5 min, dependendo do peso e idade) de 10 cm.
- Transferir cada peixe com a mão a um titular de pin de silicone feito sob medida para o tratamento a laser ( figura 1A).
CUIDADO! Os peixes podem permanecer anestesiados fora do tanque para até 10 min só. - Para reverter anestesia após o tratamento e/ou imagem, coloque o peixe-zebra no recipiente contendo água de tanque.
- Para apoiar a recuperação, criar um fluxo de água do tanque fresco sobre as brânquias, movendo o zebrafish e para trás na água.
3. Lesão Focal na Retina a laser
Nota: A 532 nm laser diode é usado para criar danos focais de luz na retina do zebrafish. A montagem experimental do laser permite o estabelecimento de uma lesão da retina focal pode ser reproduzido no zebrafish adulto.
- Configurar a potência de saída do laser: 70 mW; diâmetro de antena: 50 µm; a duração do pulso: 100 ms.
cuidado! O uso do laser requer proteção pessoal apropriada e rotulagem da área de. - Aplicar 1-2 gotas de hidroxipropilmetilcelulose 2% topicamente no olho antes do tratamento e usar uma lente de laser do fundo de 2,0 mm para concentrar o feixe do laser-com o objetivo na retina.
CUIDADO! gotas de hidroxipropilmetilcelulose são viscosas e pode causar problemas em respirar se continua as brânquias. - Pontos de laser lugar quatro em torno do nervo óptico à esquerda do olho e usar o olho direito, tratado como controle interno.
4. Na vivo Imagem latente da morfologia retiniana
- no dia 0, Visualizar a retina zebrafish diretamente após a indução do laser sem revivê-los da anestesia. Em todos os outros pontos de tempo, empregar a anestesia geral (ver secção 2: anestesia sistêmica reversível). Coloque o zebrafish imobilizado em um suporte de pino de silicone feito sob medida ( Figura 1 B, b. 1).
- Para obter imagens ideais, cortar uma lente de contato do hydrogel comercialmente disponíveis para caber o olho de peixe-zebra (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, espessura de centro = 0,4 mm) por meio de um furador. Preencha a superfície côncava da lente com metilcelulose e coloque sobre a córnea.
- Equipar o sistema OCT com uma lente de lâmpada de fenda sem contato 78D.
- Foco imagem infravermelha (IR) no IR + modo OCT ( Figura 2A) para visualizar o fundo do olho e levar o IR fotos clicando o " adquirir " botão ( Figura 2B) para localizar o manchas na retina usando o sistema de laser ' software s. Modo de
- Visualize uma seção tridimensional das camadas da retina no OCT + IR e tirar as fotos, clicando o " adquirir " botão ( Figura 2B). Observar a gravidade da lesão na camada nuclear externa (ONL) (ver secção 3: lesão focal na retina a Laser) nestas imagens.
- Reverter anestesia, após o tratamento e/ou imagem de lugar o zebrafish em um recipiente contendo água de tanque.
- Para apoiar a recuperação, criar um fluxo de água do tanque fresco sobre as brânquias, movendo o zebrafish e para trás na água.
- Executar semelhante na vivo imagens da morfologia da retina no dia 1, 3, 7, 14 e semana 6.
5. Hematoxilina & eosina (H & E) coloração
- eutanásia zebrafish por submersão em frio (4 ° C) solução de anestesia no gelo pelo menos 10 min e enucleate os olhos imediatamente, por meio de pequenas pinças curvas.
- Corrigir os olhos todo em paraformaldeído 4% (PFA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C para 20 h e desidrata-se em seguida as amostras em uma série gradual do álcool (xileno 100% por 5 min duas vezes, etanol 100% por 5 min duas vezes, etanol 96% por 3 min duas vezes e etanol 70% 3 mi n uma vez).
CUIDADO! PFA pode ser irritante para os olhos, nariz e faixa respiratória superior. PFA é um conhecido carcinógeno humano e um risco reprodutivo suspeito. - Incorporar as amostras em parafina, corte 5 µm seções ao nível da cabeça do nervo óptico e montá-los em lâminas de vidro.
- Mancha as seções deparaffinized com solução de hematoxilina ácida 0,1% por 5 min e mergulhe os slides duas vezes em água destilada depois mergulhar as lâminas em uma mistura de ácido clorídrico (2 mL 25% HCl em 250 mL água destilada água) e amoníaco (amônia 25% 2 mL em 250 mL de mistura água destilada). Manchar as seções com eosina G solução aquosa 0,5% por 3 min após o desenvolvimento da coloração por água da torneira durante pelo menos 10 min. a hematoxilina
- Montar as lâminas desidratadas em meio de montagem de resina acrílica e observar as lâminas ao microscópio de luz.
6. Imuno-histoquímica para a ativação de MC
- aqueça as seções deparaffinized no buffer de recuperação de antígeno (Tris-EDTA + 0,05% de detergente não-iônico, pH 9.0) para 3 min em um navio apropriado ou um microondas por 10-15 min e lavar três vezes com TBS para 5 min cada.
- Círculo, as seções com um silicone pen e adicionar 100 µ l obstrui a solução (TBS + soro normal de cabra 10% + 1% albumina de soro bovino, pH 7,6) em temperatura ambiente por 1 h.
- Mancha com anticorpo policlonal de coelho de proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) e com antiglutamina sintetase (GS) anticorpo monoclonal de rato, ambos em uma diluição de 1: 200 (40 µ l por amostra). Incube o slide em uma câmara umidificado a 4 ° C durante a noite. Lavar três vezes com TBS + 0.1% Tween 20 por 5 min cada.
- Visualização de acabamento com o apropriado anticorpos secundários. Este protocolo utilizado uma cabra de anti-coelho IgG H & anticorpo secundário L verde para GFAP e um anti-rato de cabra IgG H & vermelho brilhante L para GS, ambos em uma diluição de 1: 500 em temperatura ambiente por 1 h.
- Montar as lâminas com meio de montagem contendo DAPI e observar os slides sob o microscópio de fluorescência.
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Representative Results
OCT em tempo real: a fim de analisar o papel dos MCs na reparação da retina, usamos um modelo de lesão laser induzindo uma zona bem delineada de danos na retina zebrafish. O site do dano foi fotografado por meio da OCT na vivo pela primeira vez (dia 0) dentro de 60 minutos após a lesão (Figura 3). Para compensar o sistema ótico do olho de peixe, uma lente de contato feito por foi colocada sobre a córnea. Imediatamente após o tratamento com laser, um sinal de hiper-reflexivo difuso era localizado na retina exterior (setas). -Prazo do epitélio pigmentado da retina (RPE) até a camada plexiforme exterior (OPL). Um sinal similar também foi detectável no dia 1. Após o dia 3, este sinal difuso tornou-se mais organizado e mais densa. Foi visto consistentemente na camada nuclear externa (ONL) estendendo-se para a camada de fotorreceptoras. Após a primeira semana (7 dias), houve uma diminuição significativa no tamanho médio de lesão e foi detectado apenas um pequeno sinal de hiper-reflexiva. A partir de dia 14 até o último ponto de tempo investigado (semana 6), as manchas do laser já não eram visíveis em imagens IR e OCT.
Avaliação histológica da retina degeneração/regeneração: a fim de investigar a extensão e a cinética da retina degeneração/regeneração, H & E coloração foi empregado em pontos diferentes de tempo após a indução de danos (dia 0, 1, 3, 7, 14 e a semana 6) (Figura 4). Experimentos foram realizados em três olhos de três peixes. No entanto, nenhuma análise estatística foi realizada como o objetivo deste manuscrito é demonstrar o método. Mudanças sutis na camada nuclear interna (INL) e ONL pode ser visto pós-laser imediata (por exemplo, ligeiro edema no Oni) e reduzido espaço intercelular no INL dentro de 60 minutos após o tratamento com laser. A degeneração foi seguida por 6 semanas após a indução da lesão do laser. Mudanças morfológicas foram consistentemente observadas após 1 dia com desorganização do SPE e com uma formação de cavidade em Oni e no espaço subretinal. De fato, houve uma perda de núcleos dentro o ONL na área de danos, entre os dias 1 e 7. A perda máxima de PR foi encontrada no dia 3. A partir de 14 dias a 6 semanas, a retina exterior teve restabelecida sua morfologia normal.
Gliais envolvimento durante a retina degeneração/regeneração: avaliar MC ativação em pontos diferentes de tempo (dias 0, 3, 14) após a indução de degeneração da retina, realizamos análises imuno-histoquímica para os marcadores de células gliais GS e GFAP (Figura 5). Experimentos foram realizados novamente em três olhos de três peixes sem análise quantitativa. GS desempenha um papel importante em controlar o nível de glutamato extracelular e é considerado para ser exclusivamente expressos em soma de MC e seus processos19,20. GFAP é upregulated durante o envelhecimento, e quando a retina estiver danificada ou estressada. Ele está localizado em MC ponta-pés e processa21. Fraca expressão de GFAP também foi encontrado na parte interna da retina ileso-controle outros tipos de células gliais, os astrócitos , por exemplo, de rotulagem. A autofluorescência dos segmentos PR exteriores também forneceu um sinal no Oni, mas isto pode ser claramente distinguido. O sinal GFAP foi upregulated em pós-lesão dia 3. Desse modo, as análises realizadas no dia 3, após o tratamento com laser mostrou MCs GFAP positivo somente dentro do local da lesão no Oni da retina. De dia 14, a regeneração foi em grande parte completa e o sinal GFAP foi ativador para nível de linha de base na área de danos. Ao contrário de GFAP não houve alteração considerável no nível de expressão do GS. No entanto, houve uma downregulation localizada de GS no local da lesão.
Figura 1: configuração para a indução da lesão do laser da retina zebrafish e após análise de OCT. (A) arranjo do sistema antes do tratamento do laser. Zebrafish (a. 1) colocado no porta-pino do silicone com lente de contato do fundo no lugar apenas antes da aplicação do raio laser. (B) arranjo do sistema OCT antes de imagem. Zebrafish (b. 1) colocados antes de lente de lâmpada de fenda 78D antes da detecção de sites o dano por meio de outubro , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: configuração para adquirir as imagens IR e OCT. (A) imagem da janela de software durante a imagem latente. IR e OCT modos são retratados. (B) visão geral do painel usado para adquirir as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: IR (à esquerda) e OCT (à direita) imagens dos sítios feridos e ilesos da retina no mesmo olho em horários diferentes pontos (dias 0, 1, 3, 7, 14 e 6 semana) após a degeneração retiniana induzida por laser. Nas imagens de IR, uma caixa verde indica a parte da retina que tem ser analisado e a linha verde mostra a localização das imagens OCT na retina. As setas indicam locais dos pontos do laser detectados como sinais de hiper-reflexivo na barra de escala de outubro = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: H & E coloração dos feridos e o contralateral ileso zebrafish olho em horários diferentes pontos (dias 0, 1, 3, 7, 14 e 6 semana) após a degeneração retiniana induzida por laser. GC, camada de células ganglionares; INL, camada nuclear interna; ONL, camada nuclear exterior. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: deteção Immunohistochemical de ativação MC. GFAP (verde) e GS (vermelho) mancha na retina zebrafish feridos e ilesos em horários diferentes pontos (dias 0, 3, 14), após a degeneração retiniana induzida por laser. O sinal verde do Oni é devido a autofluorescência do o PRsegmentos de Uter. Núcleo de células está manchado com DAPI (azul). Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Regeneração/degeneração da retina no zebrafish foi investigada por abordagens diferentes, como de morte celular mediada por cytotoxin22, lesão mecânica23e lesões térmicas24. Utilizamos um laser de díodo 532 nm para danificar a retina do zebrafish. Desse modo, nosso modelo oferece várias vantagens. Por exemplo, rapidamente criamos uma área bem definida de lesões localizadas na retina exterior, especificamente na camada de fotorreceptores. Além disso, esta montagem experimental pode ser modificada para produzir maiores áreas de dano para estudar outros processos biológicos, por exemplo, por danificar a membrana de Bruch para induzir a neovascularização de coroide. Não há danos colaterais mínimos e o timing da resposta regenerativa pode ser modulado reproducibly e precisão.
Para acompanhar as mudanças fenotípica ao longo do tempo, utilizamos o sistema Spectralis Heidelberg e o software Explorer do olho de Heidelberg. Assim, a imagem de fundo IR foi encontrada para ser especialmente útil no zebrafish. Ao contrário de autofluorescência do fundo (AF), que mostra o baixo contraste entre o ponto do laser e da área circundante, os locais danificados são mais fáceis de localizar por imagem IR. Isso nos permite detectar alterações e de monitorar regeneração na vivo, que não seria possível com o modo AF. Como relatado anteriormente,25, OCT pode ser usado para monitorar processos degenerativas/regenerativa na retina de zebrafish. Em nosso modelo, lesão da retina do laser foi detectado como uma banda hiper-reflexivo o ONL (Figura 3), que é semelhante ao que tem sido relatado em mamíferos26. Durante a regeneração, o hiper-reflexivo sinal diminuiu até que desapareceu totalmente no dia 14.
As imagens de OCT foram correlacionadas com alterações morfológicas vistas dentro as lesões do laser (Figura 4). O sinal de hiper-reflexivo difuso em imagens OCT (dia 0) representa as alterações de pós-laser vistas no INL de zebrafish eutanásia dentro de 1 hora após o tratamento com laser. O sinal de hiper-reflexivo sutil e bem delineado, detectado no dia 3 corresponde à formação de cavidade na Oni devido à perda de haste. A partir de dia 14, ambos OCT e análise histológica confirma que a retina exterior re-tinha estabelecido sua morfologia normal.
No presente estudo, avaliamos também a resposta de MC durante a regeneração da retina (Figura 5). Muitos grupos já investigaram a ativação de células gliais, particularmente de MCs, como uma primeira resposta regenerativa para danificar. Mais especificamente, eles sugeriram que fisiopatológicos MC ativação pode induzir MCs adotar características de células-tronco, fornecendo uma fonte endógena de novos tipos de célula funcional que pode ser integrado em áreas danificadas da retina27. Como esperado, encontramos que a lesão da retina do laser estimulada MC ativação conforme indicado pelo upregulation de GFAP. De fato, expressão de GFAP aumentada notavelmente foi detectada no pós-lesão de 3 dias e estava restrita à área de danos. A partir do dia 14, a regeneração foi em grande parte completa e o sinal GFAP foi o ativador para o nível de linha de base na área de danos. Assim, temos demonstrado que MCs desempenham um papel activo na reorganização da retina e, potencialmente, regeneração, após lesão.
Em conclusão, o modelo induzida por laser da retina degeneração/regeneração é uma ferramenta versátil para produzir rápido e focal danos na retina de zebrafish e regeneração a seguir pode ser visualizada por não-invasivos de imagem da OCT. Além disso, fomos capazes de mostrar que a degeneração retiniana do laser é acompanhada de ativação MC e que o que se seguiu gliosis é invertida sobre regeneração. No entanto, uma investigação detalhada dos tipos de células envolvidas (por exemplo, microglia, macrófagos) e vias precisa ser executada. Críticas modificações podem ser necessárias, especialmente ao vivo rastreamento dos MCs para melhor compreender como eles se comportam durante o processo regenerativo (por exemplo, migração de seu local original no INL na retina exterior, especialmente na camada de fotorreceptores) e sua diferenciação para células PR. Alternativamente, paradigmas de luz dano poderiam ser usadas para induzir perda generalizada e consistente da haste e cone de PRs28. No entanto, a vantagem do modelo descrito é uma área de lesão mais definida, onde é possível estudar interações locais entre fotorreceptores degeneram e MCs ativados.
Em geral, acreditamos que o modelo vai ajudar a entender melhor os processos degenerativas/regenerativa na retina sensorial e pode permitir a comparação destes desenvolvimentos com sistema dos mamíferos. Ele também pode ser usado para estudar a influência do sistema imune inato e efeitos das substâncias neuroativos. No futuro, um pode ser capaz de usar esses resultados para modificar o sistema visual humano degeneram.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD pela sua entrada de científica no que estabelece o modelo e Federica Bisignani pela sua excelente assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
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