Summary
Amiloid birikimi farklı hastalıklar özelliğidir ve birçok farklı organları afflicts. Bu kağıt Işıksaçan konjuge oligothiophene floresan Floresans mikroskobu teknikleri ile birlikte boyama uygulaması açıklanır. Bu boyama yöntemi algılama ve klinik ve bilimsel kurulumları protein toplamları keşfi için güçlü bir araç temsil eder.
Abstract
Olarak vücut boyunca dokularda amiloid mevduat proteinler neden veya çok sayıda hastalıklar sonucu olabilir. Bunların arasında biz bulmak nörodejeneratif hastalıklar öncelikle merkezi sinir sistemi ve sistemik Amiloidoz etkileyen Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nerede mevduat serum amiloid A, transthyretin ve IgG hafif zincirleri karaciğerde, karpal amiloid olarak tünel, dalak, böbrek, kalp ve diğer periferik dokulara. Amiloid bilinen ve genellikle amiloid özel boyalar Kongo kırmızısı ve Thioflavin T (ThT) veya Thioflavin (ThS) gibi kullanarak bir yüzyıl için okudu. Bu yazıda, biz son zamanlarda geliştirilen tamamlar Işıksaçan konjuge oligothiophenes (LCOs) olarak adlandırılan bu boyalar için örnek olarak heptamer-formyl tiyofen Asetik asit (hFTAA) mevcut. hFTAA kullanımı kolaydır ve ayirt içinde co boyama veya diğer hücresel işaretleri ile uyumludur. Kapsamlı bir araştırma bu hFTAA geleneksel amiloid boyalar daha geniş hastalık ilişkili protein toplamları algılar kanıtlamıştır. Buna ek olarak, hFTAA da amiloid Fibriller polimorfizm çalışmaları izin vermek için ayrı toplanan morphotypes optik atama için uygulanabilir. Uygulanan görüntüleme yöntemi isteğe bağlı olsa da, biz burada hyperspectral görüntüleme (HIS) göstermek, lazer tarama confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu (FLIM) görüntüleme. Bu örnekler bazı görüntüleme teknikleri nerede LCOs araçları olarak daha ayrıntılı bilgi oluşumu ve amyloids yapısal özelliklerini elde etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bir önemli teknik, tüm geleneksel optik mikroskobu teknikleri, algılama izin vermek şartı mikroskobik boyutu için toplamları gelince kısıtlamadır. Ayrıca, toplamak için hFTAA bağlantısına izin için yinelenen bir β-sayfa yapısı oluşmalıdır. Toplu yapısı veya biçimi değiştirmek aşırı fiksasyon ve/veya epitope pozlama zavallı hFTAA bağlama işlemek ve bu nedenle doğru görüntüleme için kısıtlamaları oluşturmaktadır.
Introduction
Amiloid doku birikimi Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, sistemik Amiloidoz ve prion hastalıkları gibi bir numara hastalıklarda patolojik bir özelliğidir. Amiloid bağlı hastalıklar ve gerçeğini bugüne 40 farklı proteinler yakın amiloid insan1hareketlenme öncesi ilk belirtiler olarak sınıflandırılmış yaygınlığı rağmen az amiloid birikimi ve hastalık fenotip ilişkisi hakkında bilinir. Histoloji örnekleri insan hastalardan olmuştur hem tanı ve bilimsel amaçlar için kullanılabilir. Amiloid yük ve davranış, yaşam süresi ve diğer fenotipik okuma sayısı arasındaki ilişkiyi araştırmak için kurulan hayvan modelleri çok sayıda çıkışları hastalık ilerleme2,3. Büyük çabaları da ilaç keşif ve bazı bizim en çok korkulan yaygın hastalıkların savaşa tasarım yapılıyor. Ancak, genotip fenotip, amiloid plak yükü ve İlaç İdaresi arasındaki bağlantıyı değerlendirilmesi yalındır değildir. Boyama ve amiloid doku ve görüntüleme araçları çoğu kez künt ve Amiloid Dil oluşumu ve yapısı üzerinde düşük çözünürlüklü bilgi sağlamak.
Kongo kırmızısı birefringence, ThT ve ThS Floresans tespit ve doku örneklerinde hasta biyopsi ve post mortem örnekleri ve hastalık4hayvan modelleri amiloid yükünü analiz için klasik yöntemlerle örnekleridir. Birkaç on yıl (Kongo kırmızısı 1920'lerde beri ve ThT ve türevleri, 1960'lardan beri) için bu teknikler kullanılmış ve araçları rafine edilmiş ve ayrıntılı bir analiz için izin verir, ancak boyama ve yordamlar analiz hala gerçekleştiriliyor Neredeyse bir yüzyıl önce aynı şekilde.
Bu yazıda, son derece hassas bir roman amiloid boya, olgun amiloid tespiti yanı sıra yüksek doğruluk ile küçük olgunlaşmamış protein mevduat olarak algılanmasını sağlayan hFTAA5, kullanımı açıklanmaktadır. Geleneksel boyalar için karşılaştırıldığında, hFTAA daha geniş bir hastalık yelpazesinde algılamak için protein toplamları5,6,7ilişkili kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, hFTAA da ayrı toplanan morphotypes8optik atama için uygulanabilir. Burada, hFTAA boyama ve deli dana hastalığı ve amiloid-β Precursor Protein (APP) transgenik fareler plak geliştirme Alzheimer hastalığı9,10 taklit etmek için tasarlanmış kurulan hayvan modelleri dokudan analizini açıklar . Biz de teşhis analizini ve post mortem örnekleri hastalarda sistemik Amiloidoz göstermektedir. LCOs konformasyon farklılıklar bir plak içinde rapor etmelerini sağlayan içsel özelliklere sahip; ve iki teknolojiden bağlama ve floresan ile ilgili farklı özellikleri ile birleştirerek, farkı daha da11telaffuz edilir. Bir epifluorescence mikroskobu uzun pas filtreleri ile donatılmış ve bir hyperspectral kamera kafası spektral özellikleri objektif sınıflandırılması ve kayıt Filmler spektral analiz için etkinleştirmek için kullanılır. Confocal floresan mikroskopi uyarma kaynağı olarak ayarlanabilir bir lazer ile daha ayrıntılı bir amiloid plak üç boyutlu özellikleri değerlendirmek için kullanılır. Akort lazer uyarma spektrum topluluğu sağlar ve bir adım daha az emisyon dalga boyu seçimi mikroskop lce Floresans ve hedef protein ve amiloid co yerelleştirme belirlemek için ayirt ortak görüntüleme sağlar. FLIM konformasyon farklılıklarına LCOs üzerinde empoze benzeri görülmemiş hassasiyet sunar ve floresan emisyon spectra üzerinde algılanmayabilir farklılıklar ortaya koymaktadır.
Ana hedefleri açıklanan boyama yöntemi ile küçük amiloid mevduat hassas algılama kolaylaştırmak için ve amiloid mevduat içinde konformasyon çok biçimlilik karakterize etmek için vardır. Bu bilgiyi protein toplama hastalıkları temel anlamak için önemlidir.
Protocol
Not: lce sentezi için on yıldan fazla bizim laboratuvarlarda gerçekleştirilen. Aslında electrophilic aromatik substitution, katalize Paladyum çapraz-bağlantı, Amid kaplin ve ester hidroliz için iletişim kuralları uygulayarak, sentetik probları farklı amaçlar 5 , için özelleştirme 12. sentezi, karakterizasyonu ve arıtma sonra lce ürün liyofilize ve oda sıcaklığında saklanan. Sondalar bazıları (aralarında hFTAA) piyasada bulunan (bakınız Tablo reçetesi) oldular.
1. lce boyama çözüm
Not: hFTAA ticari bir satıcıdan satın aldıysanız, satıcı lütfen izleyin ' s talimatları yerine bölüm 1.
- Resuspend liyofilize hFTAA 2 mm NaOH 1 mg/mL stok çözeltisi hazırlamak için. Hisse senedi cam şişede 4 ° C'de tutmak. Hisse senedi için bir yıl saklanabilir.
- Gün boyama, çalışan bir çözüm fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hisse senedi 1:10,000 sulandrarak hazırlayın.
2. Doku örnekleri hazırlanması
Not: birçok doku türü hFTAA amiloid bir işareti olarak kullanarak yansıma. Örnekler için bkz. şekil 1. hFTAA toplam uyum için hassas bir konu. Boyama dolayısıyla tercihen yok epitope pozlama ile undisrupted toplamları gerçekleştirilmesi. Eğer doku fiksasyon minimumda tutulur en uygun spektral kalite elde edilir. Bu nedenle taze donmuş malzeme, yavaşça etanol boyama, zamanında sabit tercih edilir. Ancak, amiloid mevduat da örneğin ile formalin sabit bir doku tespit etmek mümkündür. hFTAA genellikle iyi dokuya nüfuz eder. Teknik görüntüleme amaçlanan ile uyumlu bir numune kalınlığı seçin.
- Formalin düzelttiyse, bölümler kullanılır, parafinembedded deparafinize gece boyunca Ksilen içinde
- . Bölümlerde ardışık hamamlar % 99 etanol, % 70 etanol, dH 2 O ve PBS, her 10 min daldırma. Ortam koşulları altında kurumasını doku bölümler de olanak sağlar.
Dikkat: Ksilen her zaman bir kimyasal duman mahallede ele alınır. Ksilen ve diğer organik solventler zararlıdır.- Tezcan cryosections oda sıcaklığında. % 10 formalin doku bölümlerde gecede düzeltmek ve onları üst üste hamamları % 99 etanol, % 70 etanol, dH 2 O ve PBS, her 10 dk içinde daldırma suyla temasa. Ortam koşulları altında kurumasını doku bölümler de olanak sağlar.
- HFTAA çalışma çözüm (yaklaşık 200 µL) damlacıkları örtbas için doku bölümlerine ekleyin. Damlacık yüzey gerilimi tarafından yerinde kalmalı. Boyama için oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Durulama kapalı boyama çözüm 500 µL PBS bir pipet kullanarak ve sonra slayt 10 dk. izin ver ortam koşulları altında kuru için bölümü için PBS banyoda bırakın.
- Floresan montaj orta kullanarak takma. Gecede yerleşmek için montaj orta izin.
Not: hFTAA boyama birlikte ayirt, hücre veya organel belirli işaretleri, vb gibi diğer boyama yöntemleri ile gerçekleştirilebilir. Co boyama gerçekleştirmek için seçim senin boyama iletişim çalıştırmak ve 2.2 adımından başlayarak sonunda boyama hFTAA ekleyin. Örnekler için bkz: Şekil 2. Ayirt için tercihen 640 heyecanlı bir ikincil antikor seçin nm veya daha yüksek. Bu dalga boyu aralığında hFTAA absorbe değil ve bu nedenle heyecanlı tutulamaz ve değil belli. Bu hiçbir taşma payı ile hFTAA ve antikor arasında görülüyor sağlar.
3. Mikroskopi
Not: uzun pas filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanın. Tüm ayarları aşağıdaki şekil 4 ' te görüntüleri oluşturmak için kullanılan. Ayarlamalar amiloid türü ve doku örneği bağlı olarak yapılması gerekebilir. Amiloid için bağlı hFTAA ağartma doğru istikrarlı olmasına rağmen bu örnek muayene veya yansıma zaman ışık kaynağı açmak için tavsiye edilir.
- HIS
Not: deneme bir epifluorescence mikroskop uzun geçiş emisyon filtreleri ve bir kamera kafası ile onun (bkz. Tablo reçetesi) kullanarak gerçekleştirildi.- Kullanımı Standart floresan mikroskop uzun pas filtreleri ve hyperspectral fotoğraf makinesi ile donatılmıştır. Spektral kamera kalibre edilmiş olduğundan emin olun.
- Yazılım, proje adı, seçin " spektral görüntü " ve satın alma başlar.
- 436 nm uyarma filtresini kullanarak göz aracılığıyla ilgi nesnesi seçin ve kameraya ışık yolu kaydır.
- İçinde Case veri Yöneticisi (CDM), örnek türü tayf, etiket örneği seçin ve basın elde etmek. Satın alma pencere-ecek açık.
- Edinme penceresinde " spektral görüntüleme ", Ayarları menüsünü açın, edinme özellikleri seçin ve maksimum hızda hız kalite ve ölçüm gaz/lazer/dar filtreler yazın 460-700 için spektral aralığı ayarlayın. İletişim kutusunu kapatmak.
- Resim menüsündeki Seç tam yaşamak. Simgeler barda saçaklar devre dışı bırakmak. Seçin veya bir bölgeye en yüksek bellek değeri 800 MB görüntü boyutu. Çekim hızı 1000 ile 3000 arasındaki toplam görüntü parlaklık verir bir değere ayarlayın. Simgeler barda renkli kamera tuşuna basın. Edinme başlayacak. Resim alma tamamlandığında, kayıt tuşuna basın " edinme spektral görüntü " iletişim kutusunu ve " yeni hücre " büyük veri Yöneticisi iletişim kutusundaki.
- From CDM, açık başlangıç analysis düğmesini kullanarak toplanan görüntü. Veri analizi pencere-ecek açık.
- Tayf bilgi her piksel görüntü spektral ekran iletişim kutusunu kullanarak ROIs seçerek toplanabilir. Seçin " tanımlamak " ve görüntünün alanlarını ilgili ROIs seçin.
- Spektral verileri Lib düğmesini kullanarak bir metin dosyası olarak kaydedin. Kaydedilmiş .txt dosya seçim herhangi bir analiz yazılımı için alınabilir. .Slb dosyası veri analiz yazılımı içinde analiz için kullanılabilir. Tüm görüntü hyperspectral Küp verilerinden de raw dosya olarak, olarak verilebilir " katmanları TIF olarak ", ya da " katmanlar metin biçiminde " dış yazılım kullanarak veri ve görüntü analiz uygulamaları için.
- Confocal mikroskopi
Not: confocal mikroskop uyarma kaynağı olarak ayarlanabilir bir lazer ile donatılmıştır. Tüm Floresans emisyon deneyler için lazer yoğunluğu %0,2 (3 µW ortalama bir güç için karşılık gelen), ayarlarsanız 1 havadar adet iğne deliği ve sondaj, çerçeve boyutu 1.024 için px x 1,024 px, inceden inceye gözden geçirmek hız 7 ve üzerinde 16 inceden inceye gözden geçirmek ve bit derinliği 8 bit olarak ortalama olarak (bkz: < s Trong > malzemeler tablo). Bu ayarlar her bireysel confocal sistemi, lazer kaynağı ve örnek türü için ayarlanması gerekir.- Emisyon spektrum için toplamak Lambda modu ve argon kullanarak uyarma kullanarak veri kümesine 488 lazer nm. 32 kanal GASP dedektörü 22 kanallarını kullanarak 503 ve 687 nm arasında emisyon toplamak. 755 kazanç ayarla. Tek kanallı görüntüler elde etmek için
- kullanın küme seçeneği kadar akıllı. 750 için kazanç FITC (yeşil filtre), ayarla için ve Alexa 535 (kırmızı filtre) kazanç için 845 kümesi için.
- Uyarma spektrum tunable lazer ile toplamak için uyarma 551 ve 586 nm arasında emisyon toplarken 490 ve 545 nm arasında 1 nm adımları kullanın. %2 (ortalama 30 µW gücüne karşılık gelen) ve 774 için kazanç için lazer yoğunluğu ayarlayın. Z-yığın spektral modunda toplamak için
- adımda bölümünü 0,96 µm derinliği ile inceden inceye gözden geçirmek. Kullanılan ama kazanç 730 için ayarla aynı uyarma ve emisyon ayarları olduğu gibi adım 3.2.1.
- FLIM
Not: confocal mikroskop bir FLIM ünitesi ile donatılmış (Tablo malzemeleri görmek).- Confocal mikroskop için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: iğne deliği, 20; uyarma dalga boyu, 490 nm; lazer yoğunluğu, % 0,5 (ortalama 7.5 µW gücüne karşılık gelir). Darbeli lazer 40 MHz kullanır.
- İçinde FLIM yazılım, küme üzerinde 550 sayma foton kadar nm. Görüntü parametreleri penceresinde kadar Max sayısı yaklaşık 4.000 foton sayıları sayma foton izleyin.
- Dosyayı kaydedin ve SPC resim D²■aVer.
- FLIM yazılım veri 2-bileşen üstel çürümesi için uygun. χ 2 verir bir uyum < 2 iyidir. Y ekseni üzerinde değer verilen ömür boyu sayar sayısıdır.
- Eklemek, örneğin, 100 sayıları için bir eşik seçin. Renk kodu tarafından T1 ve ömür boyu aralığı seçin. Çürüme nereye hFTAA bağlı Amiloid Dil yapısına bağlıdır. Floresans yaşam süreleri arasında 300 ve 1000 ps gözlenmiştir. Dosyayı kaydedin.
- Ham veri dışa aktarma seçenekleri kullanarak vermek ve istenen verileri yeni bir klasöre kaydedin.
Representative Results
Amiloid mevduat üzerinden birçok farklı doku türlerinden insan hasta ve deneysel hayvan proteinleri, çok sayıda hassas ve seçici boyama olduğu gibi bilimsel araştırma Klinik teşhis için de hayati önem taşımaktadır. Bu yazıda, biz nasıl bu-ebilmek var olmak göstermek LCOs, boyama ve amiloid doku türlerinin bir seçimden multimodal görüntüleme için hFTAA tarafından örneği kullanarak elde. Amiloid ligandlar tiyofen tabanlı on yıl önce ilk yayınlanması beri13, amiloid proteinler doku çeşitli bir yelpazede oluşan mevduat-var görüntüsü LCOs6,7,11, kullanarak 14,15,16 (şekil 1). Antikorlar veya diğer histolojik işaretleri ile birlikte, teknolojiden tanılama ve bilimsel amaçlı (Şekil 1a, Şekil 2) mükemmel araçlar sağlar. Floresan işaretleri uygun bir seçim ile birkaç fluorophores aynı bölümünde (Şekil 1a, hFTAA ve DAPI, şekil 2a hFTAA ayirt Kur) yansıması. Aydınlık alan ve floresan (2b rakam, hFTAA ve DAB antikor boyama) kullanarak boyama için ardışık bölümlerde kullanmak mümkündür. Son zamanlarda, hFTAA Kongo kırmızısı Klinik teşhis7,15 ' te (şekil 3) Boyama tamamlayacak bir çok umut verici olmak kanıtlanmış oldu.
Görüntüleme teknikleri geliştirme son on yıl boyunca dakika arasında ama amiloid mevduat aynı zaman derin farklılıkları niceliksel bir şekilde ayırt edebilirsiniz amiloid boya ihtiyacı artmıştır. LCE konjuge sisteminde bu bağlama modu olarak raporlamak için eşsiz bir yeteneği sağlar. Molekülünün büküm konjuge sistemdeki bağlama açıları bozulma yol ve ulaşım elektron (şekil 4a) engel. Bu sırayla lce uyarma ve emisyon dalga boyu ve emisyon ömür boyu floresan özelliklerindeki yansıtır. Biz onun için emisyon uzun pas filtreleri ile donatılmış bir dik Floresans mikroskobu kullanın. Uyarma ve emisyon spectra confocal mikroskobu ve FLIM için lazer ile bir LSM780 kullanıyoruz. Farklı teknikler örneklemek için biz bir nesne (bir APP transgenik Mouse beta amiloid (Aβ) plak) görüntüsü (şekil 4b-e). Hyperspectral floresan spectra (şekil 4b) spektral vardiya ve plak yoğunluğu değişkenlik farklı bölgeler içinde değerlendirme için sağlar. Uyarma spektrumunda confocal mikroskobu (şekil 4 c) en uygun uyarma dalga boyu aşağı akım deneyler, örneğin, birkaç fluorophores ile boyama kombinasyonu için belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda lce bağlama modu konformasyon farklılıkları algılanması için yararlı olabilir. Emisyon spektrum içinde confocal tarz hFTAA veya colocalization birlikte deneylerde çeşitli LCOs veya lce ve ayirt değerlendirmek için birkaç fluorophores bir arada Floresans emisyon özelliklerini belirlemek için kullanılabilir kombinasyonları. Floresans ömür boyu hFTAA çok hFTAA bağlama modu küçük değişimler etkilenmiştir. Bu nedenle FLIM hFTAA üzerinde bağlama hedefi (şekil 4 d) tarafından dayatılan farklılıklar arasında ayrımcılık içinde güçlü bir araçtır. Bu örneğin farklı prion suşları8arasında ayrımcılık kullanılabilir. Confocal görüntüleme ve Z yığınlarının üç boyutlu görüntü işleme amiloid toplamak (şekil 4e) genel şekli keşfetmek için yararlı bir araçtır. Yine, ek fluorophores kullanımı bir depozito bileşimi anlamada yardımcı olabilir.
Resim 1: h-FTAA, boyama gösterilen çeşitli doku tipleri ve proteinler toplamları: oluşan keratin toplamları bir karaciğer (DAPI ile counterstained), (b) p62-pozitif r kapanımlar sporadik olarak (bir) Mallory-Denk organları dahil-vücut miyozit (s-IBM) kas dokusunun, (c) Amiloid adacık amiloid polipeptid insan pankreas, (d) immünglobulin amiloid hafif zincir insan bağırsak, (e) koyun büyük (Prionlar) Mouse içinde beyin, (f ) Kronik hastalığı (Prionlar) fare beyin, (g) Aβ plaklar APP23 fare beynindeki boşa transthyretin amiloid insan hastalarda tanı örnekleri üzerinden (h) Aβ patoloji APP/PS1 fare beyin ve (ben) yağ biyopsi smear Standart Kongo kırmızısı (CR) puanlama göre 1-4 kademeli. Sarı bölgeler hFTAA amiloid mevduat lekeli ve autofluorescence Yağ dokusundan mavidir gösterir. Ölçek çubuğu uzunluğu her Masası'nda belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: antikorlar ile birlikte boyama örnekleri. (bir) anti-serum amiloid protein A (AA) ayirt ve aynı bölümünde insan AA amiloid hFTAA ile birlikte boyama. Sol üst: AA antikor emisyon 640 nm; üst sağ hFTAA 488, nm; Alt paneli görüntü gösteren colocalization sarı kaplama. (b) antikor Floresans birbirini izleyen bölümlerinde boyama ve hFTAA. Üst panel: AA DAB antikor boyama, alt panel: longpass emisyon filtre ile görüntülü hFTAA. Ölçek çubuğu: 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Floresan transthyretin amiloid Mayer'ın Hematoksilen/Kongo kırmızı (bir-d) ve Mayer'ın Hematoksilen/hFTAA (e) ile lekeli insan kalbinde kısa pas filtreleri ile karşılaştırma. (bir) aydınlık alan resim, (b) aydınlık alan + Floresan, (c) aydınlık alan + çapraz polarize, (d) aydınlık alan Floresans + çapraz polarize, (e) hFTAA floresan 405NM + 480 nm uyarma (ardışık bölümlerine bir-d). Ölçek çubuğu: 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: hFTAA ile lekeli ve çeşitli teknikler ile görüntüsü aynı nesne bir Aβ plak yaşlı bir APP23 fare kullanarak gösterdi. hFTAA (bir) floresan özelliklerini konformasyon durumuna tarafından dikte. Yapı, Düzlemsel ve bükülmüş durumda hFTAA gösterilir. (b) Hyperspectral görüntüleme için sürekli emisyon spektrum değerlendirilmesi. Spectra alt panelinde renk görüntü ilgi kutulu bölgeler göre kodlarına sahiptir. (c) (i) Confocal görüntüleme için uyarma görüntüleme ve (II ve III) spektrum ve emisyon görüntüleme (filtre modu) veya (iv) spektral modu. (d) floresan ömür boyu görüntüleme nerede daha kısa ömürleri Aβ plak çevre içinde bulunur ve hayat kez plak merkezinde uzun amiloid konformasyon farklılıkları tespiti için. Çubuk grafik alt panelinde tüm plak için hayat zamanlarının dağılımı gösterir. Görüntünün histogram altındaki ölçeğine göre renklidir. (e) Confocal Z-yığın nesneleri üç boyutlu yapısını görüntülemek için filtre modunda toplanan. Ölçek çubuğu uzunluğu her Masası'nda belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Aberrantly katlanmış proteinlerin birikimi amiloid içine birçok hastalığı süreçlerinin önemli bir olaydır. Aβ peptidler hücre dışı amiloid plaklar oluşur ve hücre içi neurofibrillary tangles hyperphosphorylated tau tarafından kurulan Alzheimer hastalığı hastaların beyinde bulunur. Bir dizi farklı proteinler, örneğin, transthyretin (TTR), Serum amiloid A bileşeni (SAA) ve IgG hafif zincir misfold ve bildirimlerini MSS dışında dokularda amiloid mevduat olarak. Her ne kadar mevduat bilinen ve fazla bir yüzyıl için biz hala okudu amiloid eksikliği nasıl amiloid detaylı bilgi birikimi moleküler düzeyde ve ne bu işlemi önlemek için neler yapılabilir başlatılır. Alzheimer hastalığı için nasıl Amiloidoz işlemi ateş ile ilişkilendirilir teyit gereklidir. Amiloidoz tedavi etmek için görevi bir anahtar macera romanı geliştirmeyi amiloid başlatma, ilerleme ve gerileme izleme araçları ince ayar olduğunu; Bu nedenle hedeflenen Amiloid Dil Algılama anahtarıdır. Uzun vadede, klinik tanı duyarlılık ve seçicilik amiloid boyama yöntemleri7,15artan yararlanacaktır. Bu konuda mevcut sorunları çok büyük ve çok aktif bir araştırma alanıdır. Klinik geliştirme ve deneme sürümleri için bir ana konu prognostik tanıdır. Bu hastalıkların büyük olasılıkla belirtiler ortaya, ama orada tedavi hastalığının teşhisi ile başlamak gerekir önce başlayın. Burada, duyarlılık roman yöntemleri için önemli bir yönüdür. Ayrıca, bu sorun bazı protein toplamları zehirli olduğu için bazı koruyucu ve tarafsız bazıları daha karmaşıktır. Dolayısıyla ayrı toplanan tür varlığını nörodejeneratif protein toplama hastalıklar bir çeşitlilik için bildirilen heterojen fenotip açıklamak için önerilen bu yana belirli toplanan morphotypes izleme olanağı esastır. Örneğin, prion protein nasıl aynı birincil dizisi amino asitlerin ortaya çıkmasına neden belirli prion suşları için ayrı toplama morphotypes içine misfold, klasik bir örnektir. Benzer çok biçimlilik Aβ peptid, α-synuclein ve tau için bildirilmiştir. Bu bağlamda, teknolojiden ayrı toplanan morphotypes optik tayini için bekleyen araçlar için gösterilmiştir. Deli dana zorlanma özel protein toplar, sistemik Amiloidoz, hem de çok biçimli Aβ çeşitli türleri bulunan protein mevduat ve tau toplamları LCOs gözlenen doğurmak indüklenen optik olgu nedeniyle ayırt.
Amiloid birikimi moleküler hassas biyokimyasal veya biyofiziksel yöntemleri ile nüfuz zordur dokulara yer alan bir olaydır. Olaylar ex vivo, in vivove aynı lce molekülleri kullanarak vitro sonda imkanı sadece ex vivo veya içinde uygulamak mümkün teknikleri kullanarak vivo içinde oluşan çözülen olaylarını hazırlıyor in vitro 11,17örnekleri. Son zamanlarda bildirilen yüksek çözünürlüklü yapısal modeli, lce pentameric FTAA (pFTAA) hizalanmış yan zincirleri tarafından 6 paralel beta lifler-kayıt18, kapsayan Fibriller eksen ile paralel oluşan bir boşluğunda olduğunu gösteren bağlar olduğunu gösterir LCE hedef varlığı hakkında atomik çözünürlükte bilgi elde etmek için mümkün. Özünde pFTAA bağlama kavite ve bağlama modu Kongo kırmızısı19tekrarlayan olumlu şarj edilmiş Lys yan-zincirler ile kaplı bir oluk tarafından dikte edildiği, benzer. LCOs benzeşme görünür daha iyi Kongo kırmızısı zinciri esneklik ve kükürt atomlara hidrofobik boşluğuna doğru tiyofen Yüzüklerin Efendisi güçlü van der Waals etkileşimler nedeniyle büyük olasılıkla karşılaştırılmak üzere. Prefibrillar türler (önce ThT YanıtANKARA)5,20 tespiti bağımlı kayıt paralel-beta-hFTAA iki tiyofen ünite pFTAA uzun olmak için hangi-cekti ipliklerini, oluşur tekrarlayan β sayfalarında görünür geçiş 8 beta iplikçiklerinin span.
Sorun giderme aşağıdaki adımlara dikkat boyama protokol gerektirir: (i) fiksasyon: geniş doku örnekleri fiksasyonu Amiloid Dil yapısını bozabilecek ve floresan spectra tarafından indüklenen varyasyon tespit imkanı sınırı hFTAA molekül konformasyon bozulma. Cryosections taze donmuş malzeme hafif fiksasyonu en iyi spektral çözünürlük elde etmek için tercih edilir. Ancak, hFTAA leke ve amiloid sabit doku ama düşük etkinlik ile ve daha az spektral varyasyon bulabilsem. (ii) Epitope pozlama: antikor bağlama bazen hFTAA nedeniyle bağlamak için yetenek azaltmak için epitope pozlama elde etmek için ön arıtma doku Amiloid Dil yapısı bozulur. Bu bir sorundur ve epitope pozlama antikor Protokolü boyama, ardışık bölümlerde antikor ve hFTAA için kullanma içinde önemli bir adımdır, anılan sıraya göre kabul edilebilir. (III) overstaining: hFTAA son derece hassas. Çalışma çözümleri düşük nM konsantrasyonu tutulmalıdır. Arka plan boyama sorun olacaksa hFTAA konsantrasyonu azaltın. HFTAA bağlama öğeleri doku seyrek ise, hFTAA aşırı toplamak ve montaj ortamda birikir. Bu doku kendisi odak düzlemde değil Floresans kabul edilmektedir. Bu görüntülenirse, kapak notu bölümünü kaydırdı, PBS ile yıkayın ve taze montaj orta ve yeni bir kapak kayma ile takın kadar PBS takılı slayt bırakın. (iv) filtre temel görüntüleme: Bu kağıt çoğunlukla hayalice çözülmüş Floresans görüntüleme uzun pas filtreleri veya birden çok algılama kanallarını kullanarak açıklar. hFTAA da kısa geçiş filtreleri kullanarak izlenebilir. Lütfen bu kontrastı azaltmak ve çok sayıda renk algılamak için olanakları ortadan kaldırmak unutmayın.
Son yıl içinde bu gibi araçlar, floresan LCOs araştırma ve özellikle hFTAA çok umut verici özellikleri göster açıkça haline gelmiştir. Proteinler ve hastalık durumlarında, serum amiloid A, transthyretin, immünglobulin hafif zincirleri sistemik amiloid hFTAA algılama hücreleri (tau, dahil vücut miyozit), içinde toplamları kadar değişen geniş bir çeşitlilik için sonuçlar gösterdi (kappa ve Lambda) seminogelin 1, prion protein (klinik örnekler de dahil olmak üzere)21, adacık amiloid polipeptid ve insülin7,15. HFTAA bir tanı aracı olarak uygulanması için kısıtlayıcı bir faktör bu Floresans mikroskobu yoğun rutin amiloid patoloji laboratuvarlarında kullanılan değil mi. Ayrıca, onun klinikte hazır değil. Ancak, hFTAA amiloid boyama ve floresan mikroskopi filtre tabanlı floresan mikroskop klinik laboratuarlarda kullanılan ve gerekirÜcretsiz bir tanı yöntemi olarak düşünülebilir. Bu son zamanlarda bir otomatik moda22floresan için temel ayarları kullanarak transthyretin Amiloidoz ile Karpal Tünel biyopsi üzerinde gösterilmiştir.
Ayrıca, ek olarak çeşitli proteinler, hFTAA floresan Fibriller türleri ve önceden fibriler amiloid toplamları, örneğingeniş bir çeşitlilik tanır, yolu fibriler tür tespit ve karakterize. Bu yayında üç mikroskobu teknikleri kullanarak çeşitli örnek türleri üzerinde bir lce göstermiştir. Kontrollü sentezi kullanımı da LCOs geliştirme etkileşimlerin yüzey plasmon rezonans (SPR)23 tarafından kayıt ve Pozitron emisyon için radiolabeling örneğin, biyomoleküler hedefleri, çok yönlü tespiti için izin verdi Tomografi (PET)24.
Bugüne kadar 25 farklı LCOs ile yayınlanmıştır. LCOs artan bir kullanım Görüntüleme Amiloid mevduat için bilgi ve anlayış nasıl bu hastalık ilişkili toplamları montajı, sökmeye ve organları ve bireylerin içinde bulundukları ile müdahale artacak.
Disclosures
PH PN MB SN hFTAA markası altında Amytracker545 commercializes Ebba biyoteknoloji küçük hissedarlar var.
Acknowledgments
Yazarlar Mikael Lindgren ve Chanan Sluzny floresan mikroskopisi ve Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias çabalayan, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander tavsiye için teşekkür etmek istiyorum, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, başı Westermark ve Kurt doku bölümleri veya bu yayında görüntülenen filmler katkıda bulunmak için Zatloukal. Burada sunulan veri toplama katkıları İsveçli beyin Vakfı (Hjärnfonden), İsveçli Alzheimer Derneği (Alzheimerfonden), İsveçli Araştırma Konseyi (VR), Göran Gustafsson Derneği, Georg tarafından finanse & Astrid Olsson, AB FP7 sağlık projesi LUPAS ve Linköping Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
