Summary
아 밀 로이드 증 착 다른 질병의 특징은 고 고생 많은 다른 기관. 이 문서에서는 발광 활용된 oligothiophene 형광 형광 현미경 검사 법 기술 함께에서 얼룩의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 얼룩 메서드 검색 및 임상과 과학적인 설정에 단백질의 탐사를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.
Abstract
단백질 전신 조직에 아 밀 로이드로 입금 하는 원인이 나 질병의 큰 숫자의 결과 될 수 있습니다. 이 중 우리가 찾을 주로 중앙 신경 조직, 그리고 조직의 amyloidosis afflicting 알츠하이머병과 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환 혈 청 아 밀 로이드 A, transthyretin 그리고 IgG 경 쇄는 간, 손목에 아 밀 로이드로 입금 갱도, 비장, 신장, 심장, 그리고 다른 주변 조직. 아 밀 로이드 알려진 이었고 종종 콩고 빨강 및 Thioflavin T (ThT) 또는 Thioflavin (ThS) 같은 녹말 체 특정 염료를 사용 하 여 보다 더 한 세기에 대 한 공부. 이 문서에서 우리는 최근 개발된 보완 발광 활용된 oligothiophenes (LCOs) 라는이 염료에의 한 예로 heptamer formyl thiophene 초 산 (hFTAA)를 제시. hFTAA 사용 하기 쉬운 이며, 기타 세포 마커 또는 공동 면역 형광에 얼룩과 호환 됩니다. 광범위 한 연구는 기존의 녹말 체 염료 보다는 질병 관련 단백질의 광범위를 감지 하는 그 hFTAA을 입증 했다. 또한, hFTAA 또한 녹말 체 fibril 다형성의 연구 수 있도록 고유한 집계 morphotypes의 광학 할당에 적용할 수 있습니다. 이미징 방법론 적용은 선택 사항, 우리 여기 보여 hyperspectral 화상 진 찰 (HIS), 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 (FLIM) 이미징. 이 보기 LCOs 사용 될 수 있는 도구로 형성의 더 상세한 지식 및 amyloids의 구조적 속성을 얻기 위해 일부 이미징 기술을 보여준다. 모든 기존의 광학 현미경 검사 법 기술, 탐지를 허용 하려면 집계의 미세한 크기에 대 한 요구 사항에 대해서 기술 하는 중요 한 제한이입니다. 또한, 집계 hFTAA 바인딩 수 있도록 반복적인 β 장 구조를 구성 한다. 과도 한 고정 및/또는 epitope 노출 집계 구조 또는 구조를 수정 하는 가난한 hFTAA 바인딩 렌더링 하 고 따라서 정확한 이미징에 한계를 포즈 수 있습니다.
Introduction
조직에 아 밀 로이드의 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 전신 amyloidosis, 프리온 질병 등 숫자 질병에 pathologic 특징 이다. 사실 날짜 40 다른 단백질에 가까운 인간의1녹말 체 선구자로 분류 된 및 아 밀 로이드 관련 된 질병의 퍼짐에도 불구 하 고 약간 녹말 체 증 착 및 질병 표현 형 사이 관계에 대 한 알려져 있다. 인간 환자에서 샘플의 조직학 되었습니다 모두 진단 및 과학적 목적을 위해 사용. 동물 모델의 많은 녹말 체 부담 및 행동, 수명, 및 다른 phenotypic 읽기의 숫자 간의 상관 관계를 조사 하기 위해 설립 되어 질병 진행2,3의 사. 큰 노력은 또한 약물 발견 및 몇몇은의 우리의 가장 두려워 광범위 한 질병을 전투에 디자인에서 만들어지고 있습니다. 그러나, 유전자, 표현 형, 녹말 체 패 부하 및 약국 사이 연결의 평가 아니다 똑 바른 앞으로. 얼룩 및 조직에 아 밀 로이드의 이미징 도구 자주 무딘 고 녹말 체 형성 및 구조에 낮은 해상도 정보를 제공 한다.
콩고 빨강 복굴절, ThT, 그리고 ThS 형광 탐지 하 고 환자의 생 검 및 게시물 부검 샘플, 및 질병4의 동물 모델에서 조직 샘플에서 녹말 체 부담 분석에 대 한 고전적인 방법의 예입니다. 이 기술은 (1920 년대부터 콩고 레드와 ThT와 1960 년대 이후 파생 상품), 수 십년 동안 사용 되 고 계측 되어 상세한 분석에 대 한 수 있지만 착 절차 및 분석 여전히 수행 되 고 에 거의 세기 전에 같은 방식.
이 문서에서 우리는 매우 민감한 소설 녹말 체 염료, hFTAA5, 성숙 아 밀 로이드의 탐지 뿐만 아니라 높은 정확도로 작은 미 숙 단백질 예금의 수의 활용을 설명 합니다. 기존의 염료에 비해, hFTAA 입증 되었다 단백질 집계5,,67관련 질병의 넓은 범위를 검색 하려면. 또한, hFTAA 또한 고유 집계 morphotypes8의 광학 할당에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리 hFTAA 얼룩이 지 고 분석 조직 프리온 질병 및 아 밀 로이드 β 선구자 단백질 (APP) 유전자 변형 쥐 알 츠 하이 머 병9,10 패 개발을 모방 하도록 설립된 동물 모델에서의 설명 . 우리 또한 조직의 amyloidosis 고통 받아 환자에서 진단의 분석 및 게시물 부검 샘플 표시. LCOs는 한 패; 내 구조적 차이 대 한 보고서를 수 있도록 기본 속성 그리고 바인딩 및 형광에 대 한 다른 특성을 가진 두 LCOs를 결합 하 여 차이 훨씬 더 발음11. 긴 패스 필터 장착 epifluorescence 현미경 그리고 hyperspectral 카메라 머리 스펙트럼 속성의 객관적인 분류 및 스펙트럼 분석에 대 한 현미경의 녹음 수 있도록 사용 됩니다. 여기 소스로 가변 레이저 공초점 형광 현미경 검사 법 더 자세히 녹말 체 패의 3 차원 속성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 가변 레이저의 여기 스펙트럼 컬렉션 수 고 현미경에 덜 방출 파장의 선택 단계 LCO 형광 및 대상 단백질과 아 밀 로이드의 공동 지역화를 결정 하기 위해 면역 형광의 공동 영상. FLIM 구조적 차이 LCOs에 부과에 전례 없이 높은 감도 제공 하 고 형광 방출 스펙트럼에 감지 되지 않을 수 있습니다 차이 보여준다.
설명된 착 방법으로 주요 목표는 작은 녹말 체 예금의 민감한 탐지를 촉진 하 고 아 밀 로이드 예금 내의 구조적 다형성의 특성. 이 지식을 단백질 집계 질병의 기본적인 이해를 위해 중요 하다.
Protocol
참고: LCO 합성 10 년 이상에 대 한 우리의 실험실에서 수행 되었습니다. 위한 프로토콜 electrophilic 아로마 대체, 팔라듐 촉매 크로스 커플링, 아 미드 결합, 에스테 르가 수 분해를 기본적으로 적용 하 여 우리 종합적 프로브 다른 목적 5 ,에 대 한 사용자 지정 12. 합성, 특성, 그리고 정화, 후에 LCO는 동결 건조 된 제품과 실내 온도에 저장. 프로브 중 일부 (그들의 사이에서 hFTAA)은 지금 상업적으로 제공 (테이블의 자료 참조).
1. LCO 얼룩이 솔루션
참고: hFTAA 상업적인 공급 업체 로부터 구입한 경우 공급 업체 따라 ' 섹션 1 대신 s 지시.
2mm 1 mg/mL의 재고 솔루션을 준비 하는 NaOH에에서- resuspend는 동결 건조 된 hFTAA. 4 ° c.에 유리 유리병에 재고를 유지 재고는 1 년 동안 저장 될 수 있다.
- 얼룩이 지기의 날, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 주식 1:10,000를 diluting 하 여 작업 솔루션 준비.
2. 조직 샘플의 준비
참고: 많은 조직 유형 녹말 체 표식으로 hFTAA를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 예 그림 1을 참조 하십시오. hFTAA는 집계 구조에 민감합니다. 얼룩이 지는 따라서 선호 수행 되어야 한다 epitope 노출 없이 undisrupted 집계에. 최적의 스펙트럼 품질 조직 고정 최소한으로 유지 하는 경우 얻을 수 있다. 따라서 신선한 냉동된 소재, 부드럽게 얼룩의 시간에서 에탄올에 고정이 좋습니다. 그러나, 예를 들면, 포 르 말린으로 고정 된 조직에 아 밀 로이드 예금도 검출 가능 하다. hFTAA는 일반적으로 잘 조직 침투. 이미징 기술 의도와 호환 되는 시료 두께 선택 합니다.
- . 섹션 연속 온천에 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH 2 O, 그리고 PBS의 각각에서 10 분을 찍어. 조직 섹션 주위 조건 하에서 건조 허용.
- 실 온에서 해 동 cryosections
- 입니다. 하룻밤 10% 포 르 말린에 조직 단면도 수정 하 고 연속 탕 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH 2 O, 그리고 PBS의 각각에서 10 분에서에서 그들을 담거 서 rehydrate. 조직 섹션 주위 조건 하에서 건조 허용.
주의: 크 실 렌은 항상 화학 증기 두건에서 처리 됩니다. 크 실 렌 및 다른 유기 용 매에 유해 하다입니다.
참고: hFTAA 얼룩 수행할 수 있습니다 조합에서 면역 형광 검사, 세포 또는 세포 기관이 특정 마커, 등 다른 착 방법. 공동 얼룩을 수행 하려면 선택의 완전 한 얼룩 프로토콜을 실행 하 고 hFTAA 단계 2.2에서에서 출발 끝에 얼룩을 추가 합니다. 예를 들어 그림 2를 참조 하십시오. 면역 형광 검사, 선호 선택 640에 흥분은 이차 항 체 nm 또는 더 높은. 이 파장 범위에서 hFTAA는 형광 하지 것입니다 및 따라서 흥분 수 없습니다 흡수 하지 않습니다. 그러면 그 피가 통해 볼 hFTAA 항 체 사이.
3. 현미경
참고: 긴 패스 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 여. 모든 설정은 아래 그림 4에서 이미지를 생성 하기 위해 사용 되었다. 녹말 체 유형 및 조직 샘플에 따라 조정 해야 합니다. HFTAA 아 밀 로이드에 바인딩된 표백으로 안정적 이지만, 그것은 표본 검사 하거나 몇 군데 하지 광원을 해제 하는 것이 좋습니다.
- HIS
참고: 실험 그의 (재료의 표 참조)에 대 한 긴 패스 방출 필터와 카메라 헤드 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 수행 되었다.- 사용 표준 형광 현미경 긴 패스 필터 및 hyperspectral 카메라 장비. 스펙트럼 카메라 보정 됩니다 있는지 확인 하십시오.
- 소프트웨어에서 프로젝트 이름을, 선택 " 스펙트럼 이미지 " 수집을 시작 하 고.
- 436 nm 여기 필터를 사용 하 여 눈을 통해 관심의 개체를 선택 하 고 카메라에 빛을 이동.
- 에의 경우 데이터 관리자 (CDM), 샘플 유형 스펙트럼, 라벨 샘플을 선택 하 고 언론 취득. 수집 창이 열립니다.
- 수집 창에서 " 스펙트럼 영상 ", 설정 메뉴를 열고, 수집 속성을 선택한 설정 스펙트럼 범위 460-700, 최대 속도, 속도 품질 및 측정 가스/레이저/좁은 필터에 입력. 대화 상자를 닫습니다.
- 이미지 메뉴에서 선택 전체 라이브. 아이콘 바에서 해제 변두리. 선택 하거나 이미지를 800 MB 미만의 최대 메모리 값을 영역 크기. 1000과 3000 사이 총 이미지의 밝기를 제공 하는 값을 노출 시간을 설정 합니다. 아이콘 표시줄에 컬러 카메라를 누릅니다. 수집 시작 합니다. 이미지 수집 완료 되 면 저장을 눌러는 " 취득 스펙트럼 이미지 " 대화 상자 및 " 새로운 셀 " 사례 데이터 관리자 대화 상자에서.
- CDM에서 분석 시작 단추를 사용 하 여 수집 된 이미지를 엽니다. 데이터 분석 창이 열립니다.
- 스펙트럼 정보 ROIs 스펙트럼 표시 대화 상자를 사용 하 여 선택 하 여 이미지의 각 픽셀에서 수집할 수 있습니다. 선택 " 정의 " 이미지의 관련 분야에서 ROIs 선택.
- 는 Lib 단추를 사용 하 여 텍스트 파일로 스펙트럼 데이터를 저장 합니다. 선택의 어떤 분석 소프트웨어에 저장 된.txt 파일을 가져올 수 있습니다. .Slb 파일은 데이터 분석 소프트웨어 내에서 분석에 사용할 수 있습니다. 있으 나 전체 이미지에서 hyperspectral 큐브 데이터로 raw 파일로 내보낼 수 있습니다 " 레이어 tif로 ", 또는으로 " 텍스트 형식의 레이어 " 외부 소프트웨어를 사용 하 여 데이터와 이미지 분석 어플리케이션에 대 한.
- Confocal 현미경 검사 법
참고: confocal 현미경 여기 소스로 가변 레이저 장비 된다. 모든 형광 방출 실험, 0.2% (3 µW의 평균 전력에 해당), 레이저 강도 설정 1 공기 단위에 pinhole, 프레임 크기 1024 픽셀 x 1,024 픽셀, 7과 이상의 16 검사, 및 8 비트로 비트 깊이 평균으로 스캔 속도 (참조 < s 합니다 > 자료 표). 이러한 설정은 각 개별 공초점 레이저 시스템, 레이저 소스 및 샘플 형식에 대 한 조정 될 필요가 있다.- 방출 스펙트럼에 대 한 수집 람다 모드와 아르곤을 사용 하 여 여기를 사용 하 여 레이저 세트 488 nm. 22 채널을 사용 하 여 32 채널 모금 검출기에서 503와 687 nm 사이 방출을 수집 합니다. 755로 이득을 설정.
- 단일 채널 이미지를 달성 하기 위해 옵션을 설정 하는 스마트를 사용 합니다. FITC (녹색 필터), 750 이득을 설정 하 고 알 렉 사 535 (빨간 필터) 845에 이득을 설정.
- 가변 레이저 여기 스펙트럼을 수집 하는 551 및 586 nm 사이 방출 수집 하는 동안 490 및 545 nm 사이 1 nm 단계 여기를 사용 합니다. 2% (30 µW의 평균 전력에 해당) 및 774의 이득을 레이저 강도 설정.
- 스펙트럼 모드에서 Z-스택 수집 0.96 µ m의 단계에 섹션의 깊이 통해 검색 합니다. 동일한 여기 및 방출 설정 단계 3.2.1로 사용 될 수 있지만 730에 이득을 설정.
- FLIM
참고: confocal 현미경 FLIM 단위 장비 된다 (재료의 표 참조).- Confocal 현미경에 대 한 다음 매개 변수를 설정: Pinhole, 20; 여기 파장, 490 nm; 레이저 강도, 0.5% (해당 하는 평균 전력 7.5 µW의). 펄스 레이저를 사용 하 여 40 mhz.
- FLIM에 소프트웨어, 포 톤 이상 550 계산 설정 nm. 표시 매개 변수 창에 따라 최대 수는 약 4000 광자 카운트까지 세 광자.
- SPC 이미지로 내보내고 파일을 저장 합니다.
- 는 FLIM 소프트웨어 데이터 2-구성 요소 지 수 감퇴를 맞는. Χ 2를 제공 하는 맞춤 < 2는 좋은. Y 축에 값이 지정 된 수명에 대 한 카운트 수.
- 포함, 예를 들어, 100 카운트에 대 한 임계값을 선택 합니다. 컬러 코드 T1에 의해 고 수명 범위를 선택 합니다. 감퇴는 hFTAA 바인딩되어 녹말 체 구조에 따라 달라 집니다. 300 그리고 1000 ps 사이 형광 일생 관찰 되었습니다. 파일을 저장 합니다.
- 내보내기 옵션을 사용 하 여 원시 데이터를 내보내고 새 폴더에 원하는 데이터를 저장.
Representative Results
민감하고 선택적 인간의 환자와 실험 동물에서 많은 다른 조직 종류에 있는 단백질의 많은 수에서 아 밀 로이드 예금의 얼룩 하는 것은 과학적 연구에서 임상 진단도 중요 합니다. 이 수 있는 방법을 보여 줍니다이 종이, LCOs, 얼룩 및 조직의 종류의 선택에서 아 밀 로이드의 복합 이미징에 대 한 hFTAA에 의해 궁 행을 사용 하 여 달성. 10 년 전 이상 thiophene 기반 녹말 체 ligands의 첫 출간 이후13, 아 밀 로이드 예금 다양 한 조직의 다양 한 단백질의 구성 된 몇 군데 있다 LCOs6,7,11를 사용 하 여 14,,1516 (그림 1). 항 체 또는 다른 조직학 표시와 함께,는 LCOs (그림 1a, 그림 2) 진단 및 과학적 목적을 위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 형광 표식의 적절 한 선택, 여러 fluorophores (그림 1a, hFTAA 및 DAPI, 면역 형광 검사 설정에서 그림 2a hFTAA) 같은 섹션에 몇 군데 있습니다. 그것은 또한 명시 및 형광 (그림 2b, hFTAA 그리고 한 덩어리 얼룩이 지는 항 체)를 사용 하 여 얼룩에 대 한 연속 섹션을 사용 하 여. 최근, hFTAA 콩고 빨강 얼룩이 임상 진단7,15 (그림 3)에 매우 유망한 보완 될 입증 되었습니다.
지난 십년 동안 이미징 기술의 개발 양적 방식에서 사이 분, 하지만 아 밀 로이드 예금에서 같은 시간 심오한 차이에서 차별 수 녹말 체 염료의 필요를 증가 했다. LCO 내 활용된 시스템의 바인딩 모드에 변화에 보고 하는 독특한 능력으로 그것을 제공 한다. 분자의 왜곡 활용된 시스템에서 바인딩 각도에서 왜곡으로 이어질 수 있으며 전자 (그림 4a)의 수송을 방해 수 있습니다. 이 차례로 모두 여기 및 방출 파장에 방출 일생에 LCO의 형광 특성에 반영합니다. 그의 방출에 대 한 긴 통과 필터를 장착 한 직 립 형광 현미경에 사용 합니다. 여기 및 방출 스펙트럼 confocal 현미경 검사 법 그리고 FLIM에, 우리는 펄스 레이저는 LSM780를 사용합니다. 다양 한 기법을 예증 하 우리 한 개체 (베타 아 밀 로이드 (Aβ) 플 라크는 APP 유전자 변형 마우스에서)를 몇 군데 (그림 4b-e). Hyperspectral 형광 스펙트럼 (그림 4b) 스펙트럼 교대 및 플 라크의 다른 지역에서 강도 변화 평가 대 한 수 있습니다. 여기 스펙트럼 confocal 현미경 검사 법 (그림 4c)에서 다운스트림 실험, 예를 들어, 여러 fluorophores와 얼룩 조합에 대 한 최적의 여기 파장을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 구조적 차이 LCO의 바인딩 모드에서의 검색을 위한 유용한 증명할 수 있습니다. Confocal 모드에서 방출 스펙트럼 hFTAA에서 또는 여러 LCOs 또는 LCO 및 면역 형광 조합 실험에서 colocalization를 평가 하기 위해 여러 fluorophores의 조합에서 형광 방출 속성을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 조합입니다. HFTAA의 형광 수명 높은 hFTAA의 바인딩 모드에 있는 작은 변이 의해 영향을 받습니다. 따라서 FLIM 바인딩 대상 (그림 4 d)에 의해 hFTAA에 부과 된 차이 사이 차별에 강력한 도구입니다. 이 예를 들어 다른 프리온 긴장8사이 차별에 사용할 수 있습니다. Confocal 영상 및 3 차원 이미지에 Z-스택 처리 녹말 체 집계 (그림 4e)의 전반적인 형태를 탐험을 위한 유용한 도구입니다. 다시, 추가 fluorophores의 사용 보증금의 구성 이해에 도움이 됩니다.
그림 1: 다양 한 조직 유형 및 단백질 집계 h FTAA의 얼룩 보여주는: 각 질 집계 (DAPI와 counterstained), 간 (b) p62-긍정적인 r 포함 산발적에 구성 된 (한) Mallory Denk 시체 포함-몸 근육 (s-IBM) 근육 조직, (c) 아 밀 로이드 인간의 췌 장, (d) 인간의 내장, (e) 양 scrapie (prions) 마우스에서에서 아 밀 로이드의 면역 글로불린 경 쇄 뇌, (f에서 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티의 ) 만성 낭비 질병 (prions) 쥐의 뇌, APP23 마우스 뇌 플 라크 (g) Aβ (h) Aβ 병리학 APP/PS1 마우스 뇌, 그리고 (나) 지방 생 검에 transthyretin 인간 환자에서 아 밀 로이드의 진단 샘플에서 얼룩 표준 콩고 레드 (CR) 점수에 따라 1-4 등급. 노란색 영역 표시 hFTAA 녹말 체 예금 스테인드과 파란색은 지방 조직에서 autofluorescence. 스케일 바 길이 각 패널에 지정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 공동 항 체와 얼룩의 예. (a) 공동 얼룩 방지 혈 청 아 밀 로이드 단백질 A (AA) 면역 형광 검사와 같은 섹션에 인간의 AA 아 밀 로이드의 hFTAA. 왼쪽 위: AA 항 체 방출 640 nm; 488에서 상단 오른쪽 hFTAA nm; 하단 패널 오버레이 이미지 보여주는 colocalization 노란색. (b) 항 체 얼룩이 지 고 hFTAA 형광 연속 섹션에. 상단 패널: AA 항 체 DAB 얼룩, 하단 패널: hFTAA longpass 방출 필터 몇 군데. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 메이어의 되며/콩고 레드 (d는-)와 메이어의 되며/hFTAA (e) 얼룩진 인간의 마음에 transthyretin 아 밀 로이드에 짧은 패스 필터 형광을 비교 합니다. (한) 대물 이미지, (b) 대물 + 형광, (c) 대물 + 교차 편광판, (d) 대물 형광 + 교차 편광판, 405에서 (e) hFTAA 형광nm + 480 nm 여기 (연속 섹션d 는-). 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 동일한 개체를 hFTAA로 얼룩진 여러 기술로 몇 군데는 세 APP23 마우스에 한 Aβ 패를 사용 하 여 보여 줍니다. hFTAA의 (a) 형광 속성의 구조적 상태에 의해 결정 됩니다. 평면 및 꼬인 상태에서 hFTAA의 구조에 표시 됩니다. (b) Hyperspectral 연속 방출 스펙트럼의 평가 대 한 이미지입니다. 하단 패널에서 스펙트럼은 색상 이미지의 박스형된 지역에 따라. (c) (i) Confocal 영상 여기 이미징 및 (ii 및 iii) 스펙트럼에 대 한 고 필터 모드 또는 (iv) 스펙트럼 모드에서 방출 영상. 아 밀 로이드, 어디 Aβ 플 라크의 주변에서 발견 되는 더 짧은 수명 그리고 생활 번 더 플 라크의 센터에 있는 구조적 차이의 탐지를 위한 (d) 형광 일생 이미지입니다. 하단 패널에 히스토그램 전체 플 라크에 대 한 생활 시간의 분포를 보여줍니다. 이미지는 히스토그램 아래 규모에 따라 채색 된다. (e) Confocal Z-스택 개체의 3 차원 구조를 표시 하려면 필터 모드에서 수집. 스케일 바 길이 각 패널에 지정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
아 밀 로이드로 aberrantly 접힌된 단백질의 증 착은 많은 질병 프로세스의 키 이벤트입니다. Extracellular 녹말 체 패 Aβ 펩 티 드의 구성 및 세포내 neurofibrillary tangles hyperphosphorylated 타우에 의해 형성 된 알 츠 하이 머 병 환자의 뇌에서 찾을 수 있습니다. 다른 단백질, 예를 들면, transthyretin (TTR), 혈 청 아 밀 로이드 A 구성 요소 (SAA), IgG 빛 체인 misfold 및 CNS 외부 조직에 아 밀 로이드 예금으로 매니페스트는 다양 합니다. 아 밀 로이드 예금 알려져 되 고 한 세기 이상, 우리는 여전히에 대 한 공부 방법을 녹말 체의 상세한 지식이 부족 하지만 증 착 분자 수준 및이 프로세스를 방지 하기 위해 할 수 있는 무엇에서 시작 됩니다. Alzheimer의 질병에 대 한 그것은 어떻게 amyloidosis의 과정이 neurodegeneration 연관 확증 해야 합니다. Amyloidosis를 치료 하는 임무에 하나의 주요 모험은 소설 개발 하 끈 녹말 체 개시, 진행 및 회귀; 모니터링을 위한 도구 따라서 타겟된 녹말 체 감지 키입니다. 긴 안목으로 보면, 임상 진단 민감도 선택도 녹말 체 착 방법7,15의 증가에서 도움이 됩니다. 이 점에서 현재도 전에 엄청난 고 매우 활동적인 연구 분야. 임상 개발 및 실험에 대 한 하나의 주요 문제는 예 후 진단. 이러한 질병 가능성이 시작 전에 증상이 나타나지만 시작 거기 치료 해야 질병의 식별. 여기, 감도 소설 방법론에 대 한 핵심 측면 이다. 또한,이 문제는 일부 단백질 집계는 독성, 일부는 보호, 그리고 일부는 중립 때문에 훨씬 더 복잡 한입니다. 따라서 특정 집계 morphotypes를 모니터 하는 능력 때문에 고유한 집계 된 종의 존재 신경 단백질 집계 질병의 다양성에 대 한 보고 유형이 다른 표현 형을 설명 하기 위해 제안 되었습니다 필수적 이다. 예를 들어, 프리온 단백질은 아미노산의 동일한 기본 시퀀스 특정 프리온 긴장을 별개 집계 morphotypes에 misfold 수 있는 어떻게의 고전적인 예입니다. 유사한 다형성 Aβ 펩 티 드, α-synuclein, 및 타우 또한 보고 되었습니다. 이와 관련, LCOs 별개 집계 morphotypes의 광학 지정을 위한 뛰어난 도구를 되도록 표시 되었습니다. 프리온 변형 관련 단백질 집계, 단백질 예금 조직의 amyloidosis, 다형 Aβ의 여러 종류에서 발견 하 고 타우 집계는 LCOs에서 관찰 하는 conformationally 유도 광학 현상으로 인해 구별 되어 있다.
아 밀 로이드 증 착 분자 정밀도의 생화학 또는 생물 방법으로 침투 하기 어려운 조직에서 수행 되는 이벤트입니다. 이벤트 전 비보 vivo에서, 그리고 생체 외에서 동일한 LCO 분자를 사용 하 여 검색을 vivo에서 에서 비보 전 또는 에 적용 하는 기술을 사용 하 여 발생 하는 분열 이벤트 무대 세트 체 외 11,17를 샘플링. 최근 보고 된 고해상도 구조 모델 쇼는 LCO pentameric FTAA (pFTAA) 바인딩합니다 6 레지스터에 병렬 베타 가닥18, 스패닝 fibril 축과 평행 하 게 정렬 된 사이드 체인에 의해 형성 된 구멍에 다는 것을 보여주는 원자 해상도 LCO 대상의 항목에 대 한 지식을 얻기 위해 가능 합니다. 본질적으로 pFTAA의 바인딩 구멍 및 바인딩 모드가 비슷합니다 콩고 레드19, 반복적인 긍정적인 충전된 리스 사이드-체인 늘어서 groove에 의해 규정. LCOs의 선호도 콩고 레드 체인 유연성과 소수 성 구멍으로 thiophene 링의 황 원자의 강한 반 데르 발스 상호작용으로 인해에 비해 더 나은 것으로 나타납니다. (전에 ThT 응답) prefibrillar 종5,20 의 탐지 반복적인 β 시트, 레지스터에 병렬-베타-가닥, 두 thiophene 단위 pFTAA 이상 되 고 hFTAA에 대 한 어느 것이의 구성에 따라 표시 최대 8 베타 가닥의 교차점을 스팬.
얼룩 프로토콜 문제가 다음 단계에서 촬영에 주의 기울이고 필요 합니다: (i) 고정: 조직 샘플의 광범위 한 고정 녹말 체 구조 수 고에 의해 유도 된 형광 스펙트럼에서 변화를 감지 하는 가능성을 제한 hFTAA 분자의 구조적 왜곡입니다. 신선한 냉동 재료에서 cryosections의 가벼운 고정 최적의 스펙트럼 분해능을 달성 하기 위해 선호 된다. 그러나, hFTAA 얼룩 하 고 아 밀 로이드 고정된 조직에서 그러나 감소 효능으로 갈수록 스펙트럼 변화를 형광. (ii) Epitope 노출: epitope 노출 항 체 바인딩 때때로 때문에 바인딩할 hFTAA에 대 한 능력을 줄일 수 있습니다에 대 한 달성 하기 위해 조직의 사전 치료 중단 녹말 체 구조. 이 문제가 있다면 epitope 노출 얼룩 프로토콜, 항 체 및 hFTAA에 대 한 연속 섹션을 사용 하 여 항 체에 있는 중요 한 단계 이다, 각각 수 간주 됩니다. (iii) overstaining: hFTAA은 매우 민감 하다. 작업 솔루션 nM의 낮은 농도에서 유지 되어야 한다. 배경 얼룩 문제가 경우 hFTAA의 농도 줄입니다. HFTAA 바인딩 요소는 조직에 스파스, hFTAA의 초과 집계 하 고 설치 매체에 누적 될 수 있습니다. 이것은 조직 자체의 초점 평면에 있지 않은 형광으로 인식 됩니다. 이 나타나면, 담가 PBS에 탑재 된 슬라이드 때까지 커버 슬립 섹션의 미끄러져 질 수 있다, PBS, 세척 신선한 설치 매체와 새로운 커버 슬립 다시 탑재. (iv) 필터 기반 이미징: 긴 패스 필터 또는 여러 탐지 채널을 사용 하 여 주로 괴기 하 게 해결된 형광 이미징이이 종이 설명 합니다. hFTAA 또한 짧은 패스 필터를 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 이 대비 감소 되며 여러 색상 검출 하는 가능성을 폐지 유의 하시기 바랍니다.
지난 년 동안 그것은 분명로 연구 도구, 형광 LCOs와 특히 hFTAA 매우 유망한 속성 표시 되고있다. 결과 다양 한 단백질 및 질병 상태, 혈 청 아 밀 로이드 A, transthyretin, 면역 글로불린 경 쇄의 전신 아 밀 로이드 (타우, 포함 신체 근육), 셀 안에 hFTAA 감지에서 배열에 대 한 증명 되었습니다 (카파과 람다) seminogelin 1, 프리온 단백질 (를 포함 하 여 임상 샘플)21, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티, 그리고 인슐린7,15. 진단 도구로 hFTAA의 구현에 대 한 제한 요소는 그 형광 현미경 일상적인 녹말 체 병 리 실험실에서 광범위 하 게 사용 되지 않습니다. 또한, 그의 제공 되지 않습니다 쉽게 병원에. 그러나, hFTAA 녹말 체 얼룩 및 형광 현미경 필터 기반된 형광 현미경에서 임상 실험실에서 사용 되 고 한다무료 진단 방법으로 간주 됩니다. 이 최근 근 생 검에 transthyretin amyloidosis 자동된 패션22에 형광에 대 한 기본 설정을 사용 하 여 함께 시연 했다.
또한, 뿐만 아니라 다양 한 단백질, hFTAA 형광 fibril 형식과 미리 원 녹말 체 집계, 예를 들어다양 한 인식, 경로 원 종 감지 되 고 특징. 이 책에서 우리 3 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 다양 한 샘플 형식에 대 한 LCO를 증명 하고있다. 제어 합성의 사용 또한 바이오 대상의 다양 한 검색 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (SPR)23 에 의해 상호 작용의 기록 및 양전자 방출 radiolabeling LCOs의 개발에 대 한 수 있다 컴퓨터 단층 촬영 (PET)24.
날짜 하려면,과 25 다른 LCOs 출판 되었습니다. 어떻게 이러한 질병 관련 집계 조립, 분해, 및 기관과 개인 존재 하는 방해의 이해와 지식을 녹말 체 예금의 이미징 LCOs의 증가 사용을 증가할 것 이다.
Disclosures
PH PN MB SN는 브랜드 이름 Amytracker545 hFTAA가 Ebba 생명 공학에 작은 주주.
Acknowledgments
저자는 미카엘 린드그렌과 Chanan Sluzny 형광 현미경 검사 법, 그리고 아드리아누 Aguzzi, 요한 Bijzet, Bouke Hazenberg, 프랭크 Heppner, 마 티아 스 엄마가, 써 리 Klingstedt, 카린 Magnusson, 크리스티나 Sigurdson, 다니엘 Sjölander, 조언에 감사 하고자 크리스토프 Röcken, Gunilla Westermark, Westermark 당 그리고 커트 Zatloukal 기여 조직 단면도 또는 현미경이이 발행물에 표시 됩니다. 표시 데이터 계약의 컬렉션 스웨덴어 뇌 재단 (Hjärnfonden), 스웨덴 츠 협회 (Alzheimerfonden), 스웨덴 연구 위원회 (VR), 예란 Gustafsson 협회, 게오르그에서 기부금에 의해 융자 된 & Astrid Olsson, EU FP7 건강 프로젝트 LUPAS, 고 링 셰 핑 대학.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
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