Amyloid avsettelse er et kjennetegn på ulike sykdommer og rammer mange ulike organer. Dette dokumentet beskriver anvendelsen av selvlysende konjugert oligothiophene fluorescens flekker i kombinasjon med fluorescens mikroskopi teknikker. Denne flekker metoden representerer et kraftig verktøy for deteksjon og utforsking av protein mengdefunksjoner i både kliniske og vitenskapelige oppsett.
Proteiner som depositum som amyloid i vev i kroppen kan være årsak eller konsekvens av en rekke sykdommer. Blant disse finner vi nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers og Parkinsons sykdom afflicting primært sentralnervesystemet, og systemiske amyloidose der serum amyloid A, transthyretin og IgG lys kjeder innskudd som amyloid i leveren, hakke tunnelen, milt, nyre, hjerte og andre perifere vev. Amyloid har blitt kjent og studert i mer enn et århundre, ofte ved hjelp av amyloid bestemt fargestoffer som Kongo rød og Thioflavin T (ThT) eller Thioflavin (ThS). I dette papiret presentere vi heptamer-formyl tiofen eddiksyre (hFTAA) som et eksempel på nylig utviklet supplementer til disse fargestoffer kalt selvlysende konjugert oligothiophenes (LCOs). hFTAA er enkel å bruke og er kompatibel med co farging i immunofluorescence eller andre cellulære markører. Omfattende forskning har vist at hFTAA oppdager et bredere spekter av sykdom forbundet protein aggregater enn konvensjonelle amyloid fargestoffer. I tillegg kan hFTAA også brukes for optisk tildeling av forskjellige aggregert morphotypes å tillate studier av amyloid fibril polymorfisme. Mens tenkelig metodikken brukt er valgfritt, vi her viser hyperspektral avbildning (hans), skanning AC confocal mikroskopi og fluorescens levetid imaging (FLIM). Disse eksemplene viser noen av Bildeteknikker hvor LCOs kan brukes som verktøy for å få mer detaljert kunnskap om dannelsen og strukturelle egenskapene for amyloids. En viktig begrensning med teknikken er som for alle vanlige optiske mikroskopi teknikker, behovet for mikroskopisk størrelse av aggregater tillate gjenkjenning. Videre, samlet bør omfatte en repeterende β arks struktur å tillate hFTAA binding. Overdreven fiksering og/eller epitope eksponering som endrer samlede strukturen eller konformasjon kan gjengi dårlig hFTAA bindende og dermed utgjør begrensninger nøyaktig bildebehandling.
Avsettelse av amyloid i vev er en patologisk kjennetegn i et antall sykdommer som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, systemisk amyloidose og prionsykdommer. Til tross for utbredelsen av amyloid-relaterte sykdommer, og det faktum at nær 40 ulike proteiner hittil er klassifisert som amyloid forløpere i menneskelig1, er lite kjent om forholdet mellom amyloid avsettelse og sykdom fenotypen. Histology med prøver fra menneskelige pasienter har vært brukes både diagnostiske og vitenskapelige formål. Et stort antall dyremodeller er etablert for å undersøke sammenhengen mellom amyloid byrden og atferd, levetid og en rekke andre fenotypiske lese outs sykdom progresjon2,3. Store arbeidet blir også gjort i stoffet funnet og design for å kjempe mot noen av våre mest fryktede utbredte sykdommer. Men er evalueringen av forbindelsen mellom genotype, fenotype, amyloid plakk belastning og Bedøve Administrasjon ikke rett frem. Verktøy for flekker og tenkelig av amyloid i vev er ofte sløv og gir lav oppløsning informasjon amyloid dannelse og struktur.
Kongo røde birefringence og ThT ThS fluorescens er eksempler på klassisk metoder for oppdager og analyserer amyloid byrden i vevsprøver pasienten biopsier, post mortem prøver og dyr modeller av sykdom4. Disse teknikkene har blitt brukt i flere tiår (Kongo red siden 1920-årene og ThT og derivater siden 1960), og selv om instrumentering har blitt forbedret og gir detaljert analyse, farging prosedyrer og analyse utføres fremdeles på samme måte som nesten et århundre siden.
I dette papir beskriver vi utnyttelsen av en svært følsom romanen amyloid fargestoff, hFTAA5, som tillater påvisning av små umodne protein innskudd med høy nøyaktighet, samt gjenkjenning av eldre amyloid. Sammenlignet med konvensjonelle fargestoffer, har hFTAA vist å oppdage en rekke sykdom forbundet protein aggregater5,6,7. I tillegg kan hFTAA også brukes for optisk tildeling av forskjellige aggregert morphotypes8. Her beskriver vi hFTAA flekker og analyse av etablerte dyremodeller prion sykdom og Amyloid-β forløper Protein (APP) transgene mus designet for å etterligne plakk utvikling i Alzheimers9,10 . Vi viser også analyse av diagnose og post mortem eksempler fra pasienter som lider av systemisk amyloidose. LCOs har iboende egenskaper som gjør dem til å rapportere på conformational forskjeller innenfor en plakett; og ved å kombinere to LCOs med ulike egenskaper om binding og fluorescens, forskjellen er enda mer uttalt11. En epifluorescence mikroskop utstyrt med lange pass filter og hyperspektral kameraet hode brukes til å aktivere objektive klassifisering av spektrale egenskapene og opptak av micrographs for spektral analyse. AC confocal fluorescens mikroskopi med en tunable laser excitation kilde brukes til å evaluere tredimensjonale egenskapene til en amyloid plakk i større detalj. Tunable laser kan samling av eksitasjon spektrum og litt mindre utvalg av utslipp bølgelengder på mikroskopet gjør co imaging LCO fluorescens og immunofluorescence å fastslå co lokalisering av målet protein og amyloid. FLIM tilbyr enestående følsomhet for conformational forskjeller pålagt LCOs og avdekker avvik som ikke blir oppdaget på fluorescens utslipp spectra.
Hovedmålene med metoden beskrevet flekker er å lette følsom påvisning av liten amyloid innskudd og å karakterisere conformational polymorfisme innen amyloid innskudd. Denne kunnskapen er viktig for den grunnleggende forståelsen av protein aggregering sykdommer.
Deponering av aberrantly foldet proteiner i amyloid er en viktig begivenhet for mange sykdommer prosesser. Ekstracellulære amyloid plaques består av Aβ peptider og intracellulær neurofibrillary ledninger dannet av hyperphosphorylated tau finnes i hjernen av Alzheimers pasienter. En rekke ulike proteiner, f.eks, transthyretin (TTR), Serum Amyloid A komponent (SAA) og IgG lys kjeden misfold og manifestere som amyloid innskudd i vev utenfor CNS. Selv om amyloid innskudd har blitt kjent og studert i mer enn et århundre, vi fremdeles mangler detaljert kunnskap om hvordan amyloid er deponi igangsatt på molekylært nivå og hva kan gjøres for å unngå denne prosessen. For Alzheimers sykdom er det nødvendig å bekrefte hvordan prosessen med amyloidose er forbundet med neurodegeneration. En nøkkel quest på oppdraget å behandle amyloidose er å utvikle romanen finjustert verktøy for å overvåke amyloid innvielsen, progresjon og regresjon; Derfor er målrettet amyloid oppdagelsen nøkkelen. I det lange løp, fordelen klinisk diagnostikk av øke følsomhet og selektivitet av amyloid flekker metoder7,15. Dagens utfordringer i denne forbindelse er enorm og er et svært aktivt forskningsfelt. En Hovedproblemet for klinisk utvikling og forsøk er prognostiske diagnose. Disse sykdommene trolig begynne før symptomer, men med behandling der må være identifikasjon av sykdommen. Her, er følsomheten et viktig aspekt for romanen metoder. Videre, problemet er enda mer komplisert fordi noen protein aggregater er giftige, noen er beskyttende, og noen er nøytral. Derav er muligheten til å overvåke bestemte aggregert morphotypes viktig siden eksistensen av forskjellige aggregert arter har blitt foreslått for å forklare heterogene fenotypen rapportert for et mangfold av nevrodegenerative protein aggregering sykdommer. For eksempel er prion protein et klassisk eksempel på hvordan en identiske primære sekvens av aminosyrer kan misfold i forskjellige samlet morphotypes, som gir opphav til bestemte prion stammer. Lignende polymorfisme har også blitt rapportert for Aβ peptid, α-synuclein og tau. I denne forbindelse vist LCOs seg å være enestående verktøy for optisk tildeling av forskjellige aggregert morphotypes. Prion-belastning-spesifikk protein samler, protein innskudd i flere typer systemisk amyloidose, i tillegg til sammensatte Aβ og tau aggregater har vært utmerket på grunn av conformationally indusert optisk fenomenet fra LCOs.
Amyloid deponering er en begivenhet som finner sted i vev som er vanskelig å trenge biokjemiske eller Biofysiske metoder for molekylær presisjon. Muligheten til å granske hendelser ex vivo, vivoog i vitro bruker de samme LCO molekylene setter scenen for unraveling hendelser som oppstår i vivo bruke teknikker som bare er mulig å søke på ex vivo eller i vitro prøver11,17. En nylig rapportert høyoppløselig strukturelle modellen viser at LCO pentameric FTAA (pFTAA) binder i et hulrom formet av justert side kjeder parallelt med fibril aksen spanning 6 i registreringen parallelle beta-tråder18, viser at det er mulig å få atomic oppløsning kunnskap om enhetene i LCO målet. I hovedsak ligner bindende hulrom og bindende modus pFTAA på Kongo red19, diktert av en groove med repeterende positivt ladet Lys side-kjeder. Affinitet til LCOs synes å være bedre i forhold til Kongo red sannsyligvis kjeden fleksibilitet og sterk van der Waals vekselsvirkningene av svovel atomer av tiofen ringene mot hydrofobe hulrommet. Deteksjon av prefibrillar arter (før ThT svarer)5,20 vises avhengig av repeterende β ark, består av-registrere parallell-beta-tråder, som for hFTAA blir to tiofen enheter lenger enn pFTAA span krysset av opptil 8 beta-tråder.
Fargeprotokoll krever betaler oppmerksomhet til feilsøking på følgende: (i) fiksering: omfattende fiksering av vevsprøver kan forstyrre amyloid strukturen og begrense muligheten til å oppdage variasjon i fluorescens spektra av conformational forvrengning av hFTAA molekyl. Mild fiksering av cryosections fra ferske-frosne materiale er foretrukket å oppnå optimal spectral oppløsning. HFTAA vil imidlertid flekken og fluoresce amyloid fast vev, men med redusert effekt og mindre spectral variasjon. (ii) Epitope eksponering: pre-behandling av vev å oppnå epitope eksponering for antistoff binding kan noen ganger redusere muligheten for hFTAA å binde grunn av forstyrret amyloid struktur. Hvis dette er et problem, og epitope eksponering er et viktig skritt i antistoffer flekk protokollen, bruker etterfølgende avsnittene for antistoffer og hFTAA, kan henholdsvis betraktes. (iii) overstaining: hFTAA er svært følsom. Arbeider løsninger bør holdes på lav nM konsentrasjon. Redusere konsentrasjonen av hFTAA hvis bakgrunnen flekker er et problem. Hvis elementene som binder hFTAA er sparsomme i vevet, kan et overskudd av hFTAA samlet og akkumuleres i montering medium. Dette er anerkjent som fluorescens som ikke er i fokus flyet av vev selv. Hvis dette vises, fordype montert lysbildet i PBS før cover slip kan skyves avsnitt, vask med PBS og Monter med fersk montering medium og en ny cover slip. (iv) filter basert bildebehandling: Dette dokumentet beskriver det meste spectrally løst fluorescens bildevisning lang pass filter eller flere oppdagelsen kanalene. hFTAA kan også monitoreres med kort-pass-filtre. Vær oppmerksom på at dette vil redusere kontrasten og avskaffe det mulig å oppdage flere farger.
De siste årene har det blitt tydelig at som forskning verktøy, fluorescerende LCOs og spesielt hFTAA viser svært lovende egenskaper. Resultater har blitt vist for et stort utvalg av proteiner og sykdomstilstander, alt fra hFTAA oppdagelsen av aggregater i cellene (tau, inkludering kroppen myositt) systemisk amyloid serum amyloid A, transthyretin, immunglobulin lys kjeder (kappa og lambda) seminogelin 1, prion protein (inkludert klinisk prøver)21, Holme amyloid polypeptid og insulin7,15. En begrensende faktor for implementering av hFTAA som et diagnostisk verktøy er at fluorescens mikroskopi ikke brukes mye i rutinemessig amyloid patologi labs. Videre er hans ikke tilgjengelige i klinikken. Men hFTAA amyloid flekker og fluorescens mikroskopi er brukt i kliniske laboratorier i et filter basert fluorescens mikroskop og børbetraktes som en gratis diagnostisk metode. Dette ble nylig demonstrert på carpal tunnel biopsier med transthyretin amyloidose bruke grunnleggende innstillinger for fluorescens i et automatisert mote22.
Videre, i tillegg til ulike proteiner, hFTAA fluorescens gjenkjenner en rekke fibril typer og pre fibrillar amyloid aggregat, f.eks, veien fibrillar arter er funnet og karakterisert. I denne publikasjonen har vi vist en LCO på ulike utvalg typer med tre mikroskopi teknikker. Bruk av kontrollerte syntese er også tillatt for utviklingen av LCOs allsidig deteksjon av biomolecular mål, f.eksinnspilling av interaksjoner av overflaten plasmon resonans (SPR)23 og radiolabeling for fantes et positron utslipp tomografi (PET)24.
Hittil har over 25 forskjellige LCOs med publisert. Økt bruk av LCOs for bildebehandling av amyloid innskudd vil øke kunnskapen om og forståelsen av hvordan disse sykdomsassosierte aggregater montere, demontere og forstyrre organer og enkeltpersoner der de ligger.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Mikael Lindgren og Chanan Sluzny for råd om fluorescens mikroskopi, og Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark og Kurt Zatloukal for å bidra vev deler eller micrographs vises i denne publikasjonen. Samlingen av presentert data her er finansiert av bidrag fra svenske hjernen Foundation (Hjärnfonden), svenske Alzheimers association (Alzheimerfonden), svensk forskningsråd (VR), den Göran Gustafsson association, Georg & Astrid Olsson, EU FP7 helse prosjektet LUPAS og Linköping universitet.
hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
LeicaDM6000 | Leica | ||
Lumen 200 | Prior | ||
Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
LSM780 | Zeiss | ||
Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
FLIM system | Becker & Hickl | ||
Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
Tunable Laser In Tune | Zeiss |