Amyloid nedfall är ett kännetecken för olika sjukdomar och drabbar många olika organ. Detta dokument beskriver tillämpningen av självlysande konjugerade oligothiophene fluorescens färgning i kombination med fluorescence mikroskopi tekniker. Denna färgningsmetod representerar ett kraftfullt verktyg för upptäckt och utforskning av protein aggregat i både kliniska och vetenskapliga uppställningar.
Proteiner som insättning som amyloid i vävnader i hela kroppen kan vara orsak eller följd av ett stort antal sjukdomar. Bland dessa finner vi neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdom drabbar främst centrala nervsystemet, och systemisk amyloidos där serum amyloid A, transthyretin och IgG lätta kedjor deponera som amyloid i levern, framknä tunnel, mjälte, njure, hjärta och andra perifera vävnader. Amyloid har varit känd och studerade för mer än ett århundrade, ofta med hjälp av amyloid specifika färgämnen som kongorött och Tioflavin T (ThT) eller Tioflavin (ThS). I detta papper presentera vi heptamer-formyl tiopen ättiksyra (hFTAA) som ett exempel på nyligen utvecklade komplement till dessa färgämnen som kallas självlysande konjugerade oligothiophenes (LCOs). hFTAA är lätt att använda och är kompatibel med samtidig färgning i immunofluorescens eller andra cellulära markörer. Omfattande forskning har visat att hFTAA upptäcker ett större antal sjukdomsassocierade protein aggregat än konventionella amyloid färgämnen. Dessutom kan hFTAA också tillämpas för optisk tilldelning av distinkta aggregerade morphotypes att tillåta studier av amyloid fibrill polymorfism. Medan den bildgivande metod som tillämpas är valfritt, vi här Visa Hyperspektrala imaging (HIS), laser scanning konfokalmikroskopi och fluorescens livstid imaging (FLIM). Dessa exempel visar några av de imaging teknikerna där LCOs kan användas som verktyg för att få mer detaljerad kunskap om bildandet och strukturella egenskaper av amyloid. En viktig begränsning till tekniken är, när det gäller alla konventionella optisk mikroskopi tekniker, kravet på mikroskopisk storlek av aggregat att möjliggöra upptäckt. Sammanlagt bör dessutom omfatta en repetitiva β-ark-struktur som möjliggör hFTAA bindande. Överdriven fixering och/eller epitop exponering som ändrar den sammanlagda struktur eller konformation kan återge fattiga hFTAA bindande och därmed utgöra begränsningar till korrekt imaging.
Nedfall av amyloid i vävnad är en patologisk kännetecken i ett antal sjukdomar som Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, systemisk amyloidos och prionsjukdomar. Trots förekomsten av amyloid-relaterade sjukdomar, och det faktum att nära 40 olika proteiner hittills har klassificerats som amyloid prekursorer i mänskliga1, är lite känt om relationen mellan amyloid nedfall och sjukdom fenotyp. Histologi av prover från mänskliga patienter har varit används både för diagnostik och vetenskapliga syften. Ett stort antal djurmodeller har fastställts för att undersöka sambandet mellan amyloid börda och beteende, livslängd och ett antal andra fenotypiska Läs outs av sjukdomsprogression2,3. Stora satsningar görs också i läkemedelsutveckling och design att slåss några av våra mest fruktade utbredda sjukdomar. Utvärdering av sambandet mellan genotyp, fenotyp, amyloida plack belastning och drug administration är dock inte rakt fram. Verktyg för färgning och imaging av amyloid i vävnad är ofta trubbiga och med låg upplösning information om amyloid bildas och struktur.
Kongorött Dubbelbrytning, ThT och ThS fluorescens är exempel på klassiska metoder för att upptäcka och analysera amyloid börda i vävnadsprover från patientens biopsier och post mortem prover och djurmodeller av sjukdom4. Dessa tekniker har använts i flera årtionden (kongorött sedan 1920-talet och ThT och derivat sedan 1960-talet), och även om instrumentering har förfinats och möjliggör detaljerad analys, färgning förfaranden och analys fortfarande utförs på samma sätt som nästan ett sekel sedan.
I detta papper beskriver vi utnyttjandet av ett mycket känsliga roman amyloid färgämne, hFTAA5, som gör att de upptäckt av små omogna protein insättningar med hög noggrannhet, samt detektion av mogen amyloid. Jämfört med konventionella färgämnen, har hFTAA visat att upptäcka ett bredare utbud av sjukdomen associerade protein aggregat5,6,7. Dessutom kan hFTAA också tillämpas för optisk tilldelning av distinkta aggregerade morphotypes8. Häri, beskriver vi hFTAA färgning och analys av vävnad från etablerade djurmodeller av prion sjukdom och β-Amyloid prekursor Protein (APP) transgena möss utformade för att efterlikna plack utveckling i Alzheimers sjukdom9,10 . Vi visar också analys av diagnostiska och post mortem prover från patienter som lider av systemisk amyloidos. LCOs har inneboende egenskaper som gör det möjligt för dem att rapportera om konfirmerande skillnader inom en plakett; och genom att kombinera två LCOs med olika egenskaper när det gäller bindande och fluorescens, skillnaden är ännu mer uttalad11. Ett epifluorescensmikroskop utrustade med långa pass filter och ett Hyperspektrala kamerahuvud används för att aktivera objektiva klassificering av spektrala egenskaper och inspelning av micrographs för spektralanalys. Confocal fluorescensmikroskopi med avstämbara laser som magnetisering källa används för att utvärdera en amyloidplack i större detalj tredimensionella egenskaper. Avstämbara lasern möjliggör insamling av magnetiseringen spektrum och ett steg mindre urval av utsläpp våglängder på mikroskopet möjliggör samtidig avbildning av LCO fluorescens och immunofluorescens att bestämma samtidig lokalisering av målprotein och amyloid. FLIM erbjuder oöverträffad känslighet för konfirmerande skillnader ålagts LCOs och avslöjar skillnader som inte kanske upptäcks på fluorescens utsläpp spektra.
De viktigaste målen med den beskrivna färgningsmetod är att underlätta känslig detektion av små amyloid insättningar och karakterisera conformational polymorphism inom amyloid insättningar. Denna kunskap är viktig för den grundläggande förståelsen av protein aggregering sjukdomar.
Nedfall av aberrantly vikta proteiner till amyloid är en viktig händelse i många sjukdomsprocesser. Extracellulära amyloida plack består av Aβ peptider och intracellulära neurofibrillära tovor bildas av hyperphosphorylated tau återfinns i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom. En rad olika proteiner, t.ex., transthyretin (TTR), Serum Amyloid A komponent (SAA), och IgG ljusslinga misfold och manifest som amyloid insättningar i vävnader utanför CNS. Även om amyloid insättningar har varit känd och studerade för mer än ett århundrade, vi fortfarande saknar detaljerad kunskap om hur amyloid initieras nedfall på molekylär nivå och vad kan göras för att hindra denna process. För Alzheimers sjukdom är det nödvändigt att bekräfta hur processen för amyloidos är associerade med neurodegeneration. En viktig strävan på uppdraget att behandla amyloidos är att utveckla roman finjusteras verktyg för övervakning av amyloid initiering och progression regression; Därför är riktade amyloid upptäckt nyckeln. I det långa loppet, nytta klinisk diagnostik öka känslighet och selektivitet av amyloid färgning metoder7,15. Aktuella utmaningar i detta avseende är enorm och är ett mycket aktivt forskningsområde. En huvudfråga för klinisk utveckling och prövningar är prognostiska diagnos. Dessa sjukdomar sannolikt börja väl innan symptom uppstår, men att börja med behandling där behöver vara identifikation av sjukdomen. Häri, är känsligheten en viktig aspekt för nya metoder. Dessutom är problemet ännu mer komplicerad eftersom vissa protein aggregat är giftiga, några är skyddande och några är neutral. Därmed är möjlighet att övervaka specifika aggregerade morphotypes viktigt eftersom förekomsten av skilda aggregerade arter har föreslagits för att förklara den heterogena fenotypen rapporterade för en mångfald av neurodegenerativa protein aggregering. Exempelvis är prionproteinet ett klassiskt exempel på hur en identiska primära sekvens av aminosyror kan misfold in i distinkta sammanlagda morphotypes, som ger upphov till specifika prion stammar. Liknande polymorfism har också rapporterats för Aβ peptid, α-synuclein och tau. I detta avseende har LCOs visat sig vara enastående verktyg för optisk tilldelning av distinkta aggregerade morphotypes. Prion-stam-specifika protein aggregat, protein insättningar finns i flera typer av systemisk amyloidos, liksom polymorfa Aβ och tau aggregat har varit framstående på grund av den conformationally inducerade optiska fenomen observeras från LCOs.
Amyloid nedfall är ett evenemang som äger rum i vävnader som är svåra att penetrera med biokemiska eller biofysikaliska metoder för molekylär precision. Möjligheten att söka evenemang ex vivo, vivooch in vitro- använder samma LCO molekyler sätter scenen för reda ut händelser som inträffar i vivo med tekniker som är endast möjliga att tillämpa på ex vivo eller i vitro prover11,17. En nyligen rapporterade hög upplösning strukturella modellen visar att det LCO pentameriskt FTAA (pFTAA) binder i en hålighet som bildas av justerad sida kedjor parallellt med fibrill axeln spanning 6 i-register parallella beta-strängar18, visar att det är möjligt att få atomär upplösning kunskap om organen i målet LCO. I huvudsak liknar bindande hålighet och bindande funktionsläget av pFTAA kongorött19, dikteras av en groove fodrad med repetitiva positivt laddade Lys sidokedjor. Frändskapet av LCOs verkar vara bättre jämfört med kongorött sannolikt på kedjan flexibilitet och starka van der Waals interaktioner av svavel atomer av tiopen ringer mot hydrofoba hålrummet. Påvisande av prefibrillar arter (före ThT svarar)5,20 visas beroende av repetitiva β ark, består av i-registrera parallell-beta-slingor, som för hFTAA är två tiopen enheter längre än pFTAA skulle span korsning av upp till 8 beta-strängar.
Färgning protokollet kräver att uppmärksamma felsökning på följande: (i) fixering: omfattande fixering av vävnadsprover kan störa amyloid struktur och begränsa möjligheten att upptäcka variationen i fluorescens spectra induceras av konfirmerande snedvridning av hFTAA molekylen. Mild fixering av kryosnitt av färskfryst material är att föredra att uppnå optimal spektral upplösning. Dock kommer hFTAA fläcken och fluorescerar amyloid i fasta vävnad men med reducerad effekt och mindre spektrala variation. (ii) epitop exponering: förbehandling av vävnad att uppnå epitop exponering för antikropp bindande kan ibland minska möjligheten för hFTAA att binda på grund av störd amyloid struktur. Om detta är en fråga och epitop exponering är ett avgörande steg i antikroppen färgning protokoll, med på varandra följande sektioner för antikroppar och hFTAA, kan respektive betraktas. (iii) overstaining: hFTAA är extremt känsliga. Fungerande lösningar bör hållas vid låg nM koncentration. Sänka koncentrationen av hFTAA om bakgrundsfärgning är ett problem. Om element som binder hFTAA är gles i vävnaden, kan ett överskott av hFTAA aggregera och ackumuleras i monteringsmedium. Detta är erkänd som fluorescens som inte är i fokus planet av vävnaden själv. Om detta visas, fördjupa den monterade bilden i PBS tills täckglaset kan skjutas av avsnittet, tvätta med PBS och montera med färska monteringsmedium och en ny täckglas. (iv) filter baserat imaging: denna uppsats beskriver mestadels spektralt löst fluorescens imaging med långa pass filter eller flera upptäckt kanaler. hFTAA kan också övervakas med hjälp av korta pass filter. Tänk dock på att detta kommer att minska kontrasten och avskaffa möjligheterna att upptäcka flera färger.
De senaste åren har det blivit uppenbart att som forskningsverktyg, fluorescerande LCOs och i synnerhet hFTAA visar mycket lovande egenskaper. Resultat har visats för en mängd olika proteiner och sjukdomstillstånd, alltifrån hFTAA upptäckt av aggregat inne i celler (tau, inkludering kroppen myosit), systemisk amyloid serum amyloid A, transthyretin, immunglobulin lätta kedjor (kappa och lambda) seminogelin 1, prion protein (inklusive kliniska prover)21, holme amyloid polypeptid och insulin7,15. En begränsande faktor för genomförandet av hFTAA som ett diagnostiskt verktyg är att fluorescensmikroskopi inte används i stor utsträckning i rutinmässiga amyloid patologi labs. Dessutom är hans inte lätt tillgängliga i kliniken. Dock hFTAA amyloid färgning och fluorescensmikroskopi har använts i kliniska laboratorier i ett filter baserade fluorescens Mikroskop och börbetraktas som en kostnadsfri diagnostisk metod. Detta visades nyligen på karpaltunneln biopsier med transtyretinamyloidos med grundläggande inställningar för fluorescens i ett automatiserat sätt22.
Dessutom utöver olika proteiner, hFTAA fluorescens erkänner ett stort utbud av fibrillcellulosa typer och pre fibrillar amyloid aggregat, t.ex., väg fibrillar arter har upptäckts och karakteriseras. I den här publikationen har vi visat en LCO på olika typer av prov med tre mikroskopi tekniker. Användning av kontrollerade syntes har också möjliggjort utvecklingen av LCOs för mångsidig detektion av Biomolekylär mål, t.ex., inspelning av interaktioner av ytan plasmon resonans (SPR)23 och radiolabeling för positron emission tomografi (PET)24.
Hittills har har över 25 olika LCOs med publicerats. En ökad användning av LCOs för avbildning av amyloid insättningar kommer att öka kunskapen och förståelsen av hur dessa sjukdomsassocierade aggregat montera, demontera och störa de organ och individer där de är bosatta.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Mikael Lindgren och Chanan Sluzny för råd om fluorescensmikroskopi, och Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias juckar, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark och Kurt Zatloukal för bidragande vävnadssnitt eller micrographs som visas i denna publikation. Insamling av presenterade uppgifter häri har finansierats med bidrag från stiftelsen hjärnan (Hjärnfonden), föreningen Svenska Alzheimers (Alzheimerfonden), Vetenskapsrådet (VR), föreningen Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, EU FP7 hälsa projektet LUPAS och Linköpings universitet.
hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
LeicaDM6000 | Leica | ||
Lumen 200 | Prior | ||
Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
LSM780 | Zeiss | ||
Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
FLIM system | Becker & Hickl | ||
Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
Tunable Laser In Tune | Zeiss |