Ett robust protokoll att övervaka neurala populationer av time-lapse video-mikroskopi följt av mjukvaran-baserat efterbehandling beskrivs. Denna metod utgör ett kraftfullt verktyg för att identifiera biologiska händelser i en vald population under levande imaging experiment.
Förstå de mekanismer som styr viktiga biologiska händelser av neurala cellpopulationer, såsom proliferation, differentiering eller cell öde beslut, kommer att vara avgörande för design terapeutiska strategier för många sjukdomar som påverkar nervsystemet. Nuvarande metoder för att spåra cellpopulationer lita på deras slutliga utfallen i stillbilder och de i allmänhet misslyckas att ge tillräcklig temporal upplösning att identifiera beteendemässiga dragen i enstaka celler. Dessutom variationer i celldöd, beteendemässiga heterogenitet inom en cell befolkningen, utspädning, sprida eller låga effektivitet av de markörer som används för att analysera celler är alla viktiga nackdelar som leder till ofullständig eller felaktig Läs-outs av resultaten. Däremot utgör utför live imaging och enda cell spårning under lämpliga förhållanden ett kraftfullt verktyg för att övervaka alla dessa händelser. Här beskrivs en time-lapse video-mikroskopi protokollet, följt av efterbearbetning, för att spåra neurala populationer med enstaka cell upplösning, anställa särskild programvara. De metoder som beskrivs ge forskarna möjlighet att ta itu med viktiga frågor angående cell biologi och härstamning progressionen av distinkta neurala populationer.
För att utveckla nya och mer effektiva behandlingsstrategier för att regenerera neurala populationer, måste vi först förstå de grundläggande mekanismer som upprätthåller celler med regenerativ neurala potential. Detta mål kräver omfattande kunskap av de faktorer som reglerar balansen mellan rofylld, spridning/differentiering, läge och timing av cellcykelns längd, livskraft, flyttande kapacitet, division, etc. Även om det är en teknisk metod som har använts i många år1, live imaging och rikta observationen fortfarande det bästa alternativet för att övervaka händelser som anges ovan. I motsats till många andra metoder centrerad på slutpunkten utläsningar, live imaging och enda cell tracking informera hela längd av ett experiment2,3,4,5, 6. således tillägg av temporal upplösning tillåter celldöd, heterogena cell beteende eller cell öde beslut, liksom många andra kritiska händelser identifieras som annars skulle passera obemärkt. Dessa egenskaper hos celler monitoreras helst bäst vid den enda cell nivå in vivo där båda inneboende (cell autonoma) och yttre (cell nisch) signaler beaktas.
Dock även om in vitro- situationen händelser inträffar i en miljö som inte reproducera den naturliga miljön, de låg densitet odlingsbetingelser som normalt används i dessa protokoll är mer lämpade att avslöja inneboende egenskaper hos de celler. Dessutom kan en mer förenklad kontroll av den omgivande miljön, genom att helt enkelt ändra odlingsmedium, utgöra ett värdefullt verktyg för att undersöka individuella roll varje exogena faktor som definierar den neurala nischen, samt miljöfaktorer som kan induceras i patologiska scenarier7,8,9,10,11,12,13. Därför, när korrekt konfigurerade, som i protokollet föreslås här, levande imaging ger en genomförbar in vitro- lösning för att hantera de flesta av de frågor som tidigare räknats upp.
Det här protokollet beskriver i korthet, maskinvara, programvara, odlingsbetingelser och de viktigaste stegen som krävs för att framgångsrikt utföra ett levande imaging experiment följt av enstaka cell tracking. Detta tillvägagångssätt ger värdefull information som hjälper till att avslöja grundläggande aspekter av biologi och härstamning progressionstakt, av flera neurala populationer.
En av de viktigaste värdena för levande imaging är möjligheten att utföra korrekta lineage tracing, belysa kritiska aspekter av härstamning progression i en neurala befolkning. Lineage tracing definieras som identifiering och övervakning av alla avkomman av en enda progenitor, från grundaren av klonen till efterföljande klonen bildade21. Anmärkningsvärt, alternativa metoder som används för lineage tracing (t.ex., viral transduktion eller multicolor reporter konstruktioner21) har en kritisk nackdel, whereby det slutliga resultatet bygger på stillbilder och det inte nödvändigtvis utgör hela sekvensen. Detta innebär att celldöd, heterogenitet i beteendet hos cell befolkningen, utspädning, sprida eller dålig effektivitet av markörer, tillsammans med andra viktiga nackdelar, leda till ofullständig eller felaktig Läs-outs av resultat2. Dessutom live imaging gör det möjligt för forskaren att analysera viktiga funktioner i biologin av neurala populationer, till exempel mode och tidpunkten för cell division, celltillväxt, migration, proliferation kontra differentiering, cellcykelns längd, neurite bildning, komplexitet och längd, cell öde urval (differentiering) eller konvertering (omprogrammering).
Dessutom live imaging enkelt kan kompletteras med andra analys avsedda att få uppgifter från enstaka celler såsom exempelvis RNA-sekvensering. För att uppnå kombinerade nytta både levande imaging och andra tekniker kräver dock att de celler som tidigare övervakas i filmer senare åter identifieras och individuellt samlat för sekundär analys. Detta kan uppnås med hjälp av Mikroskop som inkluderar positionella koordinater, genom att tillämpa fluorescerande reportrar för specifika celler eller analysera fördelningen av grupper av celler som referenser. Faktiskt, kombinationen av transkriptom profilen och uppförande av enskilda celler kan utgöra en kraftfull rutt att belysa nya molekylära signaler inblandade i biologin av celler.
En av de huvudsakliga problem som kan äventyra ett levande imaging experiment är en otillräcklig celldensitet kultur. Som nämnts tidigare, på hög densitet kan överskottet av skräp eller dålig dissociation (dunge bildande) påverka kvalitet och rumslig upplösning på bilderna, vilket gör enstaka cell tracking omöjligt. Villkoren för de olika cellpopulationer under utredning bör därför, justeras till lägsta antalet celler som möjligt utan att äventyra lönsamheten för cellkulturen.
Frekvensen av bild förvärv är också avgörande och bör justeras noggrant, särskilt när fluorescens belysning används. Överexponering för överförda och särskilt fluorescens ljus kan äventyra cellernas viabilitet. Alternativt kan en överdriven fördröjning mellan att fånga bilder störa den temporal upplösningen av analysen.
En annan avgörande steg under levande imaging experimentet är periodiska justering av fokus. Fel i den rätta inställningen/re-setting av av brännvidd kan hindra enda cell tracking. Dessutom är det nödvändigt att noggrant kontrollera att inkubation kammaren bevarar tillräcklig temperatur, luftfuktighet och CO2 nivåer, om ändring av oönskade variationer som kan inducera celldöd.
Slutligen, när PICC har utförts, är det viktigt att korrekt Hämta xyz noll positionen före den sista omgången av bild förvärv. Felaktiga vittjning av xyz utgångsläget blir det svårt att matcha faskontrast och immunofluorescens bilderna, hindrar identifieringen av cell avkomman.
Även om detta tillvägagångssätt har många positiva aspekter, kvarstår vissa begränsningar för den levande imaging av neurala populationer. Exempelvis gör låg cell densiteten krävs för att utföra framgångsrika enda cell spårning av aNSCs det omöjligt att anställa biokemiska analyser, såsom Western blotting14. Dessutom övervaka att snabbt dela populationer som cerebellär astrocyterna eller N2a celler är temporally begränsad eftersom det är ofta svårt att spåra celler som kulturerna nära sammanflödet. Dessutom kompromissa många kultur metoder, liksom de inneboende biologiska begränsningar som är associerad med isolering av celler, ofta cellviabilitet över långa perioder, begränsning av de levande imaging experiment. Slutligen, isolera cellerna från deras naturliga miljö har både positiva och negativa effekter. Celler som isolerats från sin fysiologiska nisch kan misslyckas att ta emot viktiga signaler som modulera deras beteende, medan på samma gång, det utgör ett kraftfullt medel för att testa effekten av dessa signaler individuellt i härstamning förloppet av specifika neurala populationer.
Begränsningarna ovan är, det klart att den perfekta metodologiska scenariot skulle vara att utföra live imaging och enda cell tracking experiment under normala fysiologiska förhållanden i vivo. Aktuella tekniker är dock oförmögen att följa enstaka celler för långa perioder i djupa regioner av hjärnan2. Framtiden för levande imaging bör därför fokusera på att övervinna denna begränsning, som syftar till att fullt ut analysera cellbiologi enstaka celler i vivo med mest mindre störningar möjliga av fysiologisk miljö3.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Beatriz Gascon för hennes hjälp och konst arbete i figur 1. Vi tackar också Dr C. Norris för hans hjälp. Arbetet presenteras här stöddes av forskningsanslag, ”röda de excelencia Consolider-Ingenio spanska jonkanal initiativet” (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/ICE-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) och Fundación Ramon Areces Grant program (PR2018/16-02). Felipe Ortega bekräftar Ramon y Cajal Program av spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (MEC: RYC-2013-13290).
Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
24 wells plate | Falcon | 352047 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |