एक मजबूत प्रोटोकॉल समय के द्वारा तंत्रिका आबादी पर नजर रखने के लिए चूक वीडियो-सूक्ष्म सॉफ्टवेयर के बाद आधारित प्रसंस्करण के बाद वर्णित है । यह विधि लाइव इमेजिंग प्रयोगों के दौरान एक चयनित जनसंख्या में जैविक घटनाओं की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।
तंत्र है कि नियंत्रण महत्वपूर्ण तंत्रिका कोशिका आबादी के जैविक घटनाओं, जैसे प्रसार, भेदभाव, या सेल भाग्य निर्णयों को समझना, कई तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने के लिए चिकित्सकीय रणनीतियों डिजाइन महत्वपूर्ण हो जाएगा । वर्तमान तरीके सेल आबादी ट्रैक करने के लिए अभी भी छवियों में अपने अंतिम परिणाम पर भरोसा करते है और वे आम तौर पर पर्याप्त लौकिक संकल्प प्रदान करने के लिए एकल कोशिकाओं में व्यवहार सुविधाओं की पहचान करने में विफल । इसके अलावा, कोशिका मृत्यु में बदलाव, एक सेल जनसंख्या के भीतर व्यवहार विविधता, कमजोर पड़ने, प्रसार, या कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया मार्करों की कम दक्षता सभी महत्वपूर्ण बाधाओं कि परिणाम के अधूरे या गलत पढ़ें-बहिष्कार करने के लिए नेतृत्व करेंगे कर रहे हैं. इसके विपरीत, उपयुक्त परिस्थितियों के तहत लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग प्रदर्शन एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है इन घटनाओं में से प्रत्येक की निगरानी । यहां, एक समय चूक वीडियो-माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल, बाद प्रसंस्करण के बाद, एक सेल संकल्प के साथ तंत्रिका आबादी को ट्रैक करने के लिए वर्णित है, विशिष्ट सॉफ्टवेयर को रोजगार । तरीके वर्णित करने के लिए आवश्यक प्रश्नों के बारे में पता करने के लिए शोधकर्ताओं ने कोशिका जीवविज्ञान और विशिष्ट तंत्रिका आबादी के वंश प्रगति.
आदेश में नए और अधिक प्रभावी चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने के लिए तंत्रिका आबादी पुनर्जंम, हम पहले बुनियादी तंत्र है कि एक अपक्षयी तंत्रिका क्षमता के साथ कोशिकाओं को बनाए रखने समझना चाहिए । इस लक्ष्य को आगे बढ़ाने के कारकों की एक व्यापक ज्ञान की आवश्यकता है कि weak, प्रसार/विभेद, मोड और विभाजन के समय के बीच संतुलन को विनियमित, सेल चक्र की लंबाई, प्रवासी क्षमताओं, व्यवहार्यता, आदि हालांकि यह एक तकनीकी दृष्टिकोण है कि कई वर्षों के लिए नियोजित किया गया है1, लाइव इमेजिंग और प्रत्यक्ष अवलोकन अभी भी सबसे अच्छा करने के लिए ऊपर सूचीबद्ध घटनाओं की निगरानी का विकल्प रहेगा । के रूप में कई अंय अंत बिंदु readouts पर केंद्रित दृष्टिकोण का विरोध किया, लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग एक प्रयोग की लंबाई भर में जानकारी प्रदान करते है2,3,4,5, 6. इस प्रकार, लौकिक संकल्प के अलावा सेल मौत, विषम सेल व्यवहार, या सेल भाग्य निर्णय की अनुमति देता है, साथ ही साथ कई अंय महत्वपूर्ण घटनाओं की पहचान की है कि अंयथा किसी का ध्यान नहीं पारित हो सकता है । आदर्श रूप में, कोशिकाओं की इन सुविधाओं को सबसे अच्छा vivo में सिंगल सेल स्तर पर नजर रखी जानी चाहिए, जहां दोनों आंतरिक (कोशिका स्वायत्त) और बाह्य (सेल आला) cues खाते में ले रहे हैं ।
हालांकि, हालांकि इन विट्रो में स्थिति की घटनाओं एक वातावरण है कि प्राकृतिक वातावरण प्रतिलिपि नहीं है में होते हैं, कम घनत्व संस्कृति आमतौर पर इन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की स्थिति के आंतरिक विशेषताओं को प्रकट करने के लिए उपयुक्त है कोशिकाओं. इसके अलावा, आसपास के वातावरण का एक और अधिक सरलीकृत नियंत्रण, बस विकास माध्यम को संशोधित करके, एक महत्वपूर्ण उपकरण का गठन कर सकते है प्रत्येक बाह्य कारक है कि तंत्रिका आला परिभाषित करता है, साथ ही साथ पर्यावरणीय कारकों की व्यक्तिगत भूमिका की जांच कर सकते है कि रोग परिदृश्य में प्रेरित किया जा7,8,9,10,11,12,13। इसलिए, जब सही ढंग से कॉंफ़िगर, यहां प्रस्तावित प्रोटोकॉल के रूप में, लाइव इमेजिंग इन विट्रो समाधान में एक संभव प्रदान करता है पहले से ज्यादातर प्रश्नों का पता है ।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल हार्डवेयर, सॉफ्टवेयर, संस्कृति शर्तों, और एक सेल ट्रैकिंग के बाद सफलतापूर्वक एक लाइव इमेजिंग प्रयोग करने के लिए आवश्यक मुख्य कदम का वर्णन करता है । इस दृष्टिकोण बहुमूल्य जानकारी है कि जीव विज्ञान के मौलिक पहलुओं को प्रकट करने में मदद करता है, और वंश प्रगति के, एकाधिक तंत्रिका आबादी की पेशकश ।
लाइव इमेजिंग का सबसे महत्वपूर्ण मूल्यों में से एक संभावना को सटीक वंश अनुरेखण प्रदर्शन, elucidating वंश प्रगति के एक तंत्रिका आबादी में महत्वपूर्ण पहलुओं है । वंश अनुरेखण पहचान और एक एकल जनक के सभी संतान की निगरानी के रूप में परिभाषित किया गया है, क्लोन के संस्थापक से बाद में क्लोन21का गठन किया । उल्लेखनीय है, वैकल्पिक वंश अनुरेखण के लिए कार्यरत तरीके (जैसे, वायरल transduction या बहुरंगा रिपोर्टर का निर्माण21) एक महत्वपूर्ण खामी है, जिससे अंतिम परिणाम अभी भी चित्रों पर आधारित है और यह जरूरी नहीं है पूरे अनुक्रम का गठन । इसका मतलब यह है कि कोशिका मृत्यु, कोशिका की आबादी के व्यवहार में विविधता, कमजोर पड़ने, प्रसार या मार्करों की खराब दक्षता, अन्य महत्वपूर्ण बाधाओं के साथ-साथ परिणाम2के अपूर्ण या गलत पठन-बहिष्कार का कारण बन जाते हैं । इसके अलावा, लाइव इमेजिंग शोधकर्ता तंत्रिका आबादी के जीव विज्ञान की महत्वपूर्ण सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है, इस तरह के मोड और सेल प्रभाग, सेल विकास, प्रवास, प्रसार बनाम भेदभाव, कोशिका चक्र लंबाई, neurite के समय के रूप में गठन, जटिलता और लंबाई, सेल भाग्य चयन (भेदभाव), या रूपांतरण (reprogramming) ।
इसके अलावा, लाइव इमेजिंग आसानी से अन्य विश्लेषण जैसे एकल कोशिकाओं से डेटा प्राप्त करने के लिए इरादा के साथ पूरित किया जा सकता, उदाहरण के लिए, आरएनए अनुक्रमण. हालांकि, दोनों लाइव इमेजिंग और अंय तकनीकों से संयुक्त लाभ प्राप्त करने की आवश्यकता है कि उन कोशिकाओं को पहले फिल्मों में नजर रखी बाद में फिर से पहचान की और व्यक्तिगत रूप से माध्यमिक विश्लेषण के लिए एकत्र कर रहे हैं । इस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है कि स्थानीय निर्देशांक शामिल, विशिष्ट कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट पत्रकारों को लागू करने या संदर्भ के रूप में कोशिकाओं के समूहों के वितरण का विश्लेषण करके. दरअसल, transcriptome प्रोफ़ाइल और व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार का संयोजन नई आणविक कोशिकाओं के जीव विज्ञान में शामिल cues स्पष्ट के लिए एक शक्तिशाली मार्ग का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।
मुख्य समस्याओं में से एक है कि एक जीवित इमेजिंग प्रयोग समझौता कर सकते है एक अपर्याप्त कोशिका संस्कृति घनत्व है । के रूप में पहले से संकेत दिया, उच्च घनत्व पर मलबे या गरीब पृथक्करण (झुरमुट गठन) की अधिक गुणवत्ता और छवियों के स्थानिक संकल्प को प्रभावित कर सकते हैं, एक सेल व्यवहार्य ट्रैकिंग बना । इसलिए, अध्ययन के तहत विशिष्ट कोशिका आबादी की शर्तों सेल संस्कृति की व्यवहार्यता समझौता किए बिना संभव कोशिकाओं की सबसे कम संख्या के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
छवि अधिग्रहण की आवृत्ति भी महत्वपूर्ण है और ध्यान से समायोजित किया जाना चाहिए, खासकर जब प्रतिदीप्ति रोशनी का प्रयोग किया जाता है । पर अधिक जोखिम संचारित और विशेष रूप से प्रतिदीप्ति प्रकाश सेल व्यवहार्यता समझौता हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, छवियों का कब्जा के बीच एक अत्यधिक देरी विश्लेषण के लौकिक समाधान के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
लाइव इमेजिंग प्रयोग के दौरान एक और महत्वपूर्ण कदम ध्यान केंद्रित की आवधिक समायोजन है । सही सेटिंग/पुन: केंद्र दूरी की सेटिंग में विफलता एकल सेल ट्रैकिंग बाधा हो सकती है । इसके अलावा, यह ध्यान से जांच करने के लिए आवश्यक है कि मशीन चैंबर पर्याप्त तापमान, आर्द्रता, और सह2 स्तरों को बरकरार रखता है, अवांछित विविधताओं है कि कोशिका मौत पैदा कर सकता है में संशोधन ।
अंत में, एक बार PICC प्रदर्शन किया गया है, यह महत्वपूर्ण है के लिए ठीक से xyz शूंय स्थिति छवि अधिग्रहण के अंतिम दौर से पहले पुनः प्राप्त । गलत पुन: स्थापित xyz शूंय स्थिति के चरण-कंट्रास्ट और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से मेल करने के लिए मुश्किल कर देगा, कोशिका संतति की पहचान में बाधा ।
हालांकि इस दृष्टिकोण कई सकारात्मक पहलुओं है, तंत्रिका आबादी का जीना इमेजिंग करने के लिए कुछ सीमाएं अभी भी जारी रहती है । उदाहरण के लिए, कम कोशिका aNSCs के सफल एकल सेल ट्रैकिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक घनत्व यह असंभव पश्चिमी सोख्ता14के रूप में इस तरह के जैव रासायनिक परख, रोजगार बनाता है । इसके अतिरिक्त, अनुमस्तिष्क astrocytes या N2a कोशिकाओं की तरह तेजी से विभाजित आबादी की निगरानी अस्थाई रूप में यह अक्सर भी संगम के पास संस्कृतियों के रूप में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मुश्किल है प्रतिबंधित है । इसके अलावा, कई संस्कृति तरीके, साथ ही अंतर्निहित जैविक कोशिकाओं के अलगाव के साथ जुड़े प्रतिबंध, अक्सर लंबी अवधि में सेल व्यवहार्यता समझौता, लाइव इमेजिंग प्रयोगों की अवधि सीमित । अंत में, उनके प्राकृतिक वातावरण से अलग कोशिकाओं दोनों सकारात्मक और नकारात्मक प्रभाव है । अपने शारीरिक जगह से अलग कोशिकाओं को महत्वपूर्ण संकेत है कि उनके व्यवहार मिलाना विफल हो सकता है, जबकि एक ही समय में, यह एक शक्तिशाली का प्रतिनिधित्व करता है उन संकेतों के प्रभाव का परीक्षण व्यक्तिगत रूप से विशिष्ट तंत्रिका की वंश प्रगति में आबादी.
उपर्युक्त सीमाओं को देखते हुए, यह स्पष्ट है कि सही methodological परिदृश्य को vivo मेंसामांय शारीरिक स्थितियों के तहत लाइव इमेजिंग और एकल सेल ट्रैकिंग प्रयोग करने होंगे । हालांकि, वर्तमान तकनीक मस्तिष्क के गहरे क्षेत्रों में समय की लंबी अवधि के लिए एकल कोशिकाओं का पालन करने में असमर्थ हैं2. इसलिए, लाइव इमेजिंग के भविष्य इस सीमा पर काबू पाने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए, पूरी तरह से शारीरिक पर्यावरण3के सबसे मामूली हस्तक्षेप संभव के साथ vivo में एकल कोशिकाओं के सेल जीव विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य.
The authors have nothing to disclose.
हम चित्रा 1में उसकी सहायता और कला के काम के लिए Beatriz Gascon धंयवाद । हम उनकी सहायता के लिए डॉ॰ सी. Norris का भी धन्यवाद करते हैं । यहां प्रस्तुत काम अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, “रेड डे excelencia-Ingenio स्पेनिश आयन चैनल पहल” (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), ब्रैड-सेमी (S2013/ICE-2958), यूसीएम-Santander (PR26/16-18B-3) और Fundación रेमन Areces अनुदान कार्यक्रम (PR2018 १६-०२). फेलिप ओर्टेगा स्पेनिश अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धात्मकता मंत्रालय के रेमन y Cajal कार्यक्रम स्वीकार करता है (MEC: RYC-2013-13290) ।
Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
24 wells plate | Falcon | 352047 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |