En robust protokoll overvåke nevrale bestander av time-lapse video-mikroskopi etterfulgt av programvarebaserte etterbehandling er beskrevet. Denne metoden representerer et kraftig verktøy for å identifisere biologiske hendelser i en valgt befolkning under live bildebehandling eksperimenter.
Forstå mekanismene som styrer kritiske biologiske hendelser av nevrale celle populasjoner, som spredning, differensiering eller cellen skjebne beslutninger, vil være avgjørende for design strategier for mange sykdommer som påvirker nervesystemet. Gjeldende metoder for å spore celle populasjoner stole på sine endelige resultatene i stillbilder og de generelt klarer ikke å gi tilstrekkelig midlertidig løsning å identifisere atferdsmessige funksjoner i enkeltceller. Videre variasjoner i celledød, atferdsmessige heterogenitet i cellen innbyggere, fortynning, spre eller lav effektiviteten av markørene brukes til å analysere celler er alle viktige handicap som fører til ufullstendig eller feil read-outs av resultatene. Derimot representerer utfører live bildebehandling og enkelt celle sporing under riktige forhold et kraftig verktøy for å overvåke hver av disse hendelsene. Her er en time-lapse video-mikroskopi protokoll, etterfulgt av etterbehandling, beskrevet spore nevrale populasjoner med enkeltcelle oppløsning, ansette bestemt programvare. Metodene beskrevet aktiverer forskere å ta opp viktige spørsmål om cellen biologi og avstamning progresjon av forskjellige nevrale populasjoner.
For å utvikle nye og mer effektive strategier for å generere neural bestander, må vi først forstå grunnleggende mekanismer som har celler med en regenererende nevrale potensial. Forfølge dette målet krever en omfattende kunnskap om faktorene som regulerer balansen mellom gågaten, spredning/differensiering, modus og tidspunktet for divisjon, celle syklus lengde, vandrende kapasiteter, levedyktighet, etc. Selv om det er en teknisk tilnærming som har vært ansatt mange år1, live bildebehandling og direkte observasjon fortsatt det beste alternativet til å overvåke hendelser ovenfor. I motsetning til mange andre tilnærminger sentrert på sluttpunktet readouts, live bildebehandling og enkelt celle sporing gir informasjon over hele lengden av et eksperiment2,3,4,5, 6. dermed tillegg av midlertidig løsning tillater celledød, heterogene celle atferd eller cellen skjebne beslutninger, samt mange andre kritiske hendelser identifiseres som ellers kunne passere ubemerket. Ideelt disse funksjonene celleområde bør beste overvåket på den enkeltcelle nivå i vivo, der både iboende (celle autonome) og ytre (celle nisje) signaler er tatt hensyn.
Men selv i i vitro situasjonen hendelser skjer i et miljø som ikke gjengir det naturlige miljøet, lav kultur forholdene vanligvis brukes i disse protokollene er mer egnet til å avsløre innebygde karakteristikkene av celler. Dessuten kan en mer enkle kontroll av det omliggende miljøet, ved å endre vekstmediet, utgjøre et verdifullt verktøy for å undersøke personlige rollen hver extrinsic faktor som definerer nevrale nisje, så vel som miljøfaktorer som kan bli indusert i patologisk scenarier7,8,9,10,11,12,13. Derfor, når konfigurert, som protokollen foreslått her, live bildebehandling gir en mulig i vitro løsning for å løse de fleste spørsmålene tidligere nummerert.
I korthet, beskriver denne protokollen maskinvare, programvare, oppdrettsforholdene og de viktigste trinnene som kreves for å utføre en live bildebehandling eksperiment etterfulgt av enkeltcelle sporing. Denne tilnærmingen gir verdifull informasjon som hjelper for å avdekke grunnleggende aspekter av biologi og avstamning progresjon, flere nevrale befolkninger.
En av de viktigste verdiene av live bildebehandling er muligheten til å utføre nøyaktig avstamning sporing, Klargjørende kritiske aspekter av slekten progresjon i en neural befolkning. Avstamning sporing defineres som identifikasjon og overvåkning av alle avkom av en enkelt stamfar, fra grunnleggeren av klone til etterfølgende klonen dannet21. Bemerkelsesverdig, alternative metoder ansatt avstamning sporing (f.eks, viral signaltransduksjon eller flerfarget reporter konstruksjoner21) har en viktig ulempe, der sluttresultatet er basert på stillbilder og det gjør ikke nødvendigvis utgjør hele sekvensen. Dette betyr at celledød, heterogenitet i atferden til celle befolkningen, fortynning, spre eller dårlig effektiviteten av markører, sammen med andre viktige handicap, føre til ufullstendig eller feil read-outs av resultater2. Videre gjør live bildebehandling forskeren analysere viktige funksjoner i biologi nevrale befolkninger, som modus og timing av cellen divisjon, cellevekst, migrasjon, spredning versus differensiering, celle syklus lengde, neurite formasjon, kompleksitet og lengde, celle skjebne utvalget (differensiering) eller konvertering (omprogrammering).
I tillegg live bildebehandling kan suppleres lett med andre analyse skal hente data fra enkeltceller som for eksempel RNA sekvensering. For å oppnå kombinert nytte både live bildebehandling og andre teknikker krever imidlertid at disse cellene tidligere overvåket i filmene re identifisert og individuelt samlet for sekundære analysen. Dette kan oppnås ved bruk av mikroskop med posisjonelle koordinater, ved å bruke fluorescerende journalister for bestemte celler eller analysere fordelingen av grupper av celler som referanser. Faktisk, kombinasjonen av transcriptome profilen og virkemåten til enkeltceller kan representere en kraftig rute å belyse nye molekylær stikkordene involvert i biologi av celler.
En av de viktigste problemene som kan kompromittere en live bildebehandling eksperiment er en utilstrekkelig celle kultur tetthet. Som indikert tidligere, på høy tetthet kan overskytende av rusk eller dårlig dissosiasjon (klump formasjon) påvirke kvaliteten og romlig oppløsning på bilder, gjør enkeltcelle sporing unfeasible. Derfor skal vilkårene i ulike celle populasjoner under studien justeres til det laveste antallet celler mulig kompromiss levedyktigheten til cellekultur.
Hyppigheten av bildeopptak er også avgjørende og skal være nøye tilpasset, spesielt når fluorescens belysning brukes. Overeksponering sendt og spesielt fluorescens lys kan kompromittere celle levedyktighet. Lang ventetid mellom fangst av bildene kan eventuelt forstyrre timelige oppløsningen til analysen.
En annen avgjørende skritt under live bildebehandling eksperimentet er periodiske justering av fokus. Feil i den riktige innstillingen/re-setting av fokus avstand kan hindre enkeltcelle sporing. Videre er det nødvendig å nøye sjekke at inkubasjon kammeret beholder tilstrekkelig temperatur, fuktighet og CO2 nivåer, endring uønskede varianter som kan indusere celledød.
Til slutt, når PICC er utført, er det viktig å hente riktig xyz null posisjon før den siste runden av bildeopptak. Feil re-setting av xyz nullstilling vil gjøre det vanskelig å matche fase kontrast og immunofluorescence bilder, hindrer identifikasjon av cellen avkommet.
Selv om denne tilnærmingen har mange positive fasetter, hardnakkethet noen begrensninger på live bildebehandling av nevrale befolkninger fremdeles. For eksempel gjør lav celle tetthet kreves for å utføre vellykkede enkeltcelle sporing av aNSCs det umulig å ansette biokjemiske analyser, for eksempel Western blotting14. I tillegg, overvåking raskt dele populasjoner som lillehjernen astrocyttene eller N2a celler er timelig begrenset som det er for vanskelig å spore celler som kulturer nær samløpet. Videre kompromiss mange kultur metoder, i tillegg til de iboende biologiske begrensningene knyttet til isolering av celler, ofte celle levedyktighet over lengre perioder, begrense varigheten av live bildebehandling eksperimenter. Til slutt, isolere celler fra naturen har både positive og negative effekter. Cellene isolert fra sine fysiologiske nisje kan ikke motta viktige signaler som modulerer deres atferd, mens på samme tid, den representerer en kraftig måte å teste effekten av disse signalene individuelt i avstamning utviklingen av nevrale bestander.
Gitt begrensningene beskrevet ovenfor, er det klart at det perfekte metodologiske scenarioet vil være å utføre live bildebehandling og enkelt celle sporing eksperimenter under normale fysiologiske forhold i vivo. Gjeldende teknikker er imidlertid ikke følge enkeltceller i lange perioder i dype områder av hjernen2. Derfor bør fremtidens live bildebehandling fokusere på å overvinne denne begrensningen, satsing å fullt analysere cellebiologi på enkeltceller i vivo med mest mindre interferens mulig av fysiologiske miljø3.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Beatriz Gascon for hennes assistanse og kunst arbeid i figur 1. Vi takker også Dr. C. Norris for hans hjelp. Arbeidet presentert her ble støttet av forskningsmidler, “røde de excelencia consolidar-Ingenio spansk Ion kanal initiativ” (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE CM (S2013/is-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) og Fundación Ramon Areces Grant program (PR2018/16-02). Felipe Ortega erkjenner Ramon y Cajal Program av det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne (MEC: RYC-2013-13290).
Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
24 wells plate | Falcon | 352047 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |