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Medicine

Échantillonnage de Biofilm oral Microbiome analyse chez les enfants en bonne santé

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

Changements dans le microbiome oral tout au long de l’enfance sont de plus en plus d’intérêt. Comparaison des études différentes microbiome révèle une absence de protocoles d’échantillonnage standardisé. Espace limité fait d’échantillonnage du sulcus sous-gingivale sonore des enfants difficiles. Échantillonnage de papiers point est présentée ici en détail comme la méthode de choix pour ce domaine.

Abstract

Biofilm oral et son analyse moléculaire constituent une base pour enquêter sur les diverses recherches dentaires et les questions cliniques. Connaissance du biofilm composition aboutit à une meilleure compréhension des mécanismes cariogènes et periopathogenic. Microbiennes changements qui se produisent dans la cavité buccale au cours de l’enfance sont d’intérêt pour plusieurs raisons. L’évolution de l’enfant microflore orale et les changements dans sa composition doivent être analysées plus loin afin de comprendre et éventuellement prévenir l’apparition de la maladie. Dans le même temps, une connaissance approfondie de la composition naturelle du biofilm par voie orale est nécessaire. Premiers stades de la dentition permanente exempt de caries avec des gencives saines fournissent un habitat sous-gingivale largement inchangée qui peut servir comme une base sur place pour étudier les caractéristiques de santé orale et la maladie. Analyse du biofilm oral de l’enfant au cours des différentes étapes de vie est donc un thème important dans le domaine. Méthodes d’analyse moléculaire modernes peuvent fournir des informations complètes sur la diversité bactérienne de ces biofilms. Pour activer le microbiote Comparaison de données, il est important de normaliser chaque étape de la procédure de génération de données moléculaires. Cette procédure s’étend du traitement des données cliniques d’échantillonnage, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatique, interprétation taxonomique. Un des facteurs plus critiques ici est l’échantillonnage de biofilm. Prélèvement d’échantillons chez les enfants est encore plus difficile en particulier en raison de l’espace limité dans les zones sous-gingival. Ainsi, nous nous concentrons sur l’utilisation de pointes de papier pour l’échantillonnage sous-gingival. Cet article fournit un protocole détaillé pour l’échantillonnage de biofilm oral du sillon sous-gingival, la muqueuse et la salive chez les enfants.

Introduction

Biofilm oral humain comprend une vaste communauté comprenant surtout des commensaux et microorganismes bénéfiques1,2,3. Espèces présentes ici colonisent toutes les niches que la cavité buccale offre4,5,6. Composition de biofilm dans ces niches varie aussi largement que les habitats. Par exemple, salive affiche différents profils bactériennes que les échantillons de plaque. Dans des échantillons de plaque d’adultes en bonne santé, l’abondance relative des Actinobacteria dépasse 20 %, alors que moins de 7 % se trouve dans la salive. Bacteroidetes et Firmicutes apparaissent en revanche en nombre beaucoup plus élevé dans la salive7. Ainsi, il est important d’échantillon à différents endroits dans la bouche afin d’obtenir l’image entière. En outre, divers facteurs comme les différences géographiques et ethniques, âge, sexe et bien d’autres facteurs rendent difficile d’identifier les modalités générales de biofilm développement et maladie début8,9. Pendant de nombreuses années, l’enquête du biofilm periopathogenic et cariogènes a été une préoccupation centrale8,10,11,12,13.

Ces dernières années, des recherches sur des sujets sains a gagné en importance, non seulement pour une meilleure compréhension de la maladie, mais aussi pour la mise en œuvre de mesures préventives,14. Nouvelles technologies et des analyses moléculaires plus élucider la formation de biofilm oral et fonction15,16et activer le profilage complet de la diversité microbienne17,18. Cela devrait aussi conduire à une nouvelle compréhension des changements microbiennes au cours d’un traitement orthodontique,19. Un impact sur le développement des biomatériaux orthodontique est prévisible. La perspective améliorée sera un éclairage nouveau sur les complications du traitement orthodontique associé à biofilm, tels que la déminéralisation de l’émail et les maladies parodontales12,20,21. Afin de permettre des comparaisons des données dans le monde entier, il est crucial de normaliser toutes les étapes de génération de données. Des changements mineurs dans les procédures de laboratoire peuvent fortement influencer les résultats. En outre, l’utilisation de différentes plates-formes de calculs en informatique peut conduire à des ensembles de données non comparables. Enfin, le choix des tests statistiques et les corrections a une influence sur les résultats. Cependant, échantillonnage de partialité peut se produire déjà bien avant les travaux de laboratoire ou bio-informatique commence. Méthodes d’échantillonnage non normalisés conduisent à une étude biaisée par nature. Compte tenu de la faible à modérée de la normalisation dans les études pertinentes, peu de preuves existe sur la relation entre orthodontie et microbiomes19. Par conséquent, le développement de méthodes normalisées faciliterait qualifié la comparaison des données sur le terrain.

Cet article présente biofilm oral standardisée des procédures d’échantillonnage. Le protocole vise à contribuer à générer globalement comparables collections de données de séquence microbienne. Un protocole étape par étape pour l’échantillonnage de biofilm oral chez les enfants en bonne santé est présenté. Comme la méthode de choix, pointes de papier sont atraumatically inséré dans son sillon sous-gingival. Pour faciliter les comparaisons de l’habitat, la muqueuse de la joue est échantillonnée selon le même protocole. Par ailleurs, cet article montre d’échantillonnage parallèle et mis en commun. En outre, le prélèvement de salive est montré. Un simple code couleur transport et système de stockage est également présenté, en facilitant la gestion de l’échantillon pour un traitement ultérieur. Le choix des activités du secteur aval concernant le support de stockage, analyse métagénomique et bioinformatique dépend de questions cliniques soulevées par les différents champs de recherche orale. Dans ce manuscrit, prélèvement d’ADN pour NGS a été choisi à titre d’exemple d’une application possible pour la recherche orthodontique.

Protocol

Protocole et tournage vidéo ont été approuvées par la Commission de révision institutionnelle de l’Université médicale de Graz (Votum 126ex14/27-15). Consentement écrit à cette publication vidéo proviennent de l’enfant et son parent.

1. instruments et matériaux

  1. Coupe calibré (ISO 015/02) et des pointes de papier stérile, habituellement utilisés dans le traitement endodontique, à la première marque de l’anneau afin d’uniformiser leur longueur (Figure 1).
  2. Appliquer l’irradiation de lumière UV à 260 nm pendant 30 min pour éviter toute contamination de l’ADN et l’ARN des pointes de papier (Figure 2).
  3. Autoclave les tubes pour le stockage à 120 ° C et 1,2 bar pendant 20 min et UV-irradier eux aussi bien ou service prêt-à-utiliser gamma irradiation tubes.

2. Elaboration des sujets

Remarque : Le consentement éclairé a été obtenu de l’enfant et son parent avant l’inscription.

  1. Appliquer le beurre de cacao aux lèvres.
  2. Monter les joues et la langue enrouleur pour un accès complet pour les deux arcades dentaires.
  3. Tache de la plaque dentaire avec la divulgation de la plaque.
  4. Retirez l’appareil de terrain sec.
  5. Rincer la bouche avec de l’eau jusqu'à ce que l’eau est incolore.
  6. Brosser soigneusement les dents avec une brosse à dents électrique à angulation 45 °. Appliquer de l’eau seulement, mais pas de dentifrice, car cela modifierait le biofilm oral.
  7. Monter l’appareil de terrain sec, y compris la garde de la langue pour garder la bouche ouverte et sèche.
  8. Propre et sec les dents indice avec des coton-tiges stériles pour éviter l’absorption de liquide supra-gingivale pendant papier point d’échantillonnage.

3. échantillonnage de Biofilm

  1. Point d’échantillonnage du sillon sous-gingivale de papier
    1. Saisir les points de papier avec des pincettes dentaire stérile.
    2. Insérer les pointes de papier tangentiellement jusqu'à une longueur définie de 4 mm. Faire particulièrement attention ne pas à traumatiser l’épithélium jonctionnel (Figure 3).
    3. Supprimer des pointes de papier après 20 s.
    4. Cumulez des points de papier directement dans les tubes préparés : introduire le bout de point de papier directement dans un flacon stérile et sans ADN et coupez-le à la marque de la troisième à une longueur standard de 4 mm (Figure 4).
    5. Si il est indiqué par les protocoles d’étude, insérer les deux pointes de papier parallèles et simultanément sur le même site (Figure 5 a).
    6. Vous pouvez également collecter des points de papier provenant de plusieurs endroits si le protocole de l’étude nécessite « échantillons groupés » (Figure 5 b).
    7. Retirez l’appareil de terrain sec pour les muqueuses et prélèvement de salive.
  2. Muqueuse papier point d’échantillonnage
    1. Appliquer les pointes de papier au pli vestibulaire de la joue supérieure (Figure 6).
    2. Fermez la joue et massez-le brièvement.
    3. Ouvrir la joue et enlever les points de papier après 20 s.
    4. Couper les pointes de papier à la troisième marque et les placer dans un tube stérile comme il est indiqué pour l’échantillonnage sous-gingival.
  3. Prélèvement de salive
    1. Laissez l’enfant cracher la salive non stimulée dans un récipient stérilisé (Figure 7).

4. transfert et stockage

  1. Cumulez des points de papier comme échantillons simples, regroupées ou parallèles selon le plan d’étude (Figure 8).
  2. Appliquer un système de stockage codés par couleur pour faciliter davantage la gestion de l’échantillon (Figure 9).
  3. Enfin, stocker les échantillons à −80 ° C dans l’attente de l’analyse sur le microbiome.

Representative Results

Dans la présente publication, prélèvement d’ADN pour NGS est démontrée comme exemple d’une application possible pour la recherche orthodontique. ADN bactérien est extraite directement les échantillons de point de papier. Cet ADN peut ensuite être utilisé dans l’étude de la composition microbienne pour les cliniques ou les questions de recherche (tels que résumés dans la Figure 10).

Méthodes d’analyse moléculaire modernes tels que la méthode End 454-pyrosequencing donnent un aperçu de la microflore totale d’un échantillon. L’ADN de milliers de bactéries est identifié simultanément à différents niveaux de la phylogenèse, sur les 16 s différences séquence ARNr. Plates-formes bioinformatique doivent être générés comme un moyen de structuration en clusters, l’information provient des grands ensembles de données. Analyse statistique peut ensuite être appliqué aux ensembles de données microbiote.

L’abondance globale relative de certaines espèces bactériennes peut être analysé comme changements dans la microflore en raison de l’évolution des conditions de l’habitat. Graphiques à barres (Figure 11) et heatmaps (Figure 12) affichent la composition bactérienne sous-gingivale au niveau de l’embranchement ou au niveau de l’ordre. Diverses personnes et les traitements peuvent être comparées par la statistique descriptive et inférentielle. La figure 13 présente une comparaison de l’histogramme des deux modes de point de papier sous-gingivale d’échantillonnage à différents niveaux taxonomiques. Le tableau 1 indique le décalage dans la composition de biofilm au cours d’une étude in vitro en comparant deux points dans le temps (T1 et T3). Des changements statistiquement significatifs ont été calculées avec le test de Wilcoxon signé-rang et correction de Bonferroni suivante des données 454-pyrosequencing.

Enfin, analyse en coordonnées principales (PCoA) permet une comparaison directe 3D au niveau de l’unité taxonomique opérationnelle (UTO) tels qu’identifiés dans les différents échantillons. Les parcelles du PCoA Figure 14 présentent des différences intra - et inter - individual, du microbiome sous-gingivale dans une série de cas de cinq enfants. La figure 15 montre les résultats d’une étude cas-témoins orthodontique : roses à points rouges sont les cas, les points bleus clair à foncé sont les contrôles, tout échantillons à plusieurs reprises sur une période de quatre mois. Un regroupement clair des cas après l’intervention orthodontique (points rouges) représente un changement dans le microbiome. Les points bleus, représentant le groupe de contrôle, sont réparties uniformément.

Figure 1
Figure 1 : Préparer des pointes de papier de longueur normalisée. Pointes de papier calibré stériles sont coupés à la première marque de l’anneau pour normaliser leur longueur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Stériliser et pointes de papier libre de l’ADN. Pointes de papier standardisés sont stérilisés et UV irradiées dans un banc propre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Insertion point papier sous-gingivale. Pointes de papier calibré stériles sont insérées tangentiellement dans le sulcus sous-gingivale jusqu'à ce que la marque d’anneau de 4 mm pour 20 s.

Figure 4
Figure 4 : Papier de coupe dans tube. Directement après l’échantillonnage, les pointes de papier sont coupés à la troisième marque de bague (4 mm) dans une solution stérile et sans ADN flacon de 1,5 mL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Échantillonnage mis en commun et parallèle. Deux pointes de papier sont insérées en même temps dans le sulcus sous-gingivale d’une dent (A) ou plusieurs pointes de papier dans les sillons sous-gingivale de plusieurs dents (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Échantillonnage muqueux. Pointes de papier calibré stériles sont portées dans la muqueuse du pli vestibulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Prélèvement de salive. Salive non stimulée est cracher dans un bécher stérile. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Échantillonnage. Les échantillons peuvent être collectées comme unique (à gauche, une dent de chaque), mis en commun (plusieurs pour les rayures en un flacon) ou des échantillons de parallèle (bandes bleues, deux pointes de papier à une dent). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Couleur stockage. Un renvoi code couleur pour feuilles et flacons facilite davantage exemple de manipulation.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Analyse de biofilm sous-gingival. Présentation schématique du biofilm clinique d’échantillonnage (A), l’extraction d’ADN (B) et des technologies différentes de NGS (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : Histogramme. Affichage de l’abondance relative des bactéries au niveau de l’embranchement analysés à l’aide de 454-pyrosequencing. Image modifiée de Santigli et al. 22 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12 : Heatmap. Affichage des abondances relatives des ordres bactéries analysées à l’aide de 454-pyrosequencing. Rouge foncé représente une forte abondance relative (> 10 %). Bleu foncé représente un très faible à aucune abondance relative de l’ordre bactérienne respectifs. Image modifiée de Santigli et al. 22 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 13
Figure 13 : Histogramme. Comparaison des deux modes de papier point d’échantillonnage (modes A et B) à différents niveaux taxonomiques. Données générées avec 454-pyrosequencing. Image modifiée de Santigli et al. 22 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 14
Figure 14 : 2D parcelle PCoA. Une série de cas (n = 5) montrant des différences intra-individuelle et inter-individuelle, à la suite de deux méthodes d’échantillonnage sous-gingival (1 couleur est 1 sous réserve). Données générées avec 454-pyrosequencing. Image modifiée de Santigli et al. 22 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 15
Figure 15 : Instantané d’une animation 3D de terrain PCoA. Microbiome sous-gingivale montrant se déplace dans une étude cas-témoins orthodontique (n = 16 ; chaque groupe, 3 points dans le temps ; cas : rose à rouges, contrôles : clair au bleu foncé). Données générées avec 454-pyrosequencing.Données non publiées du groupe de travail Santigli. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Taxon : phytopathologiques Point dans le temps 1 [%] Point de temps 3 [%] Test de Wilcoxon signé-rangs
Phylum/genre 25e Médiane 75e 25e Médiane 75e p-valeur p-valeur ajustée #
Autres
Autres 0,70 1.07 1.28 1.32 1.63 1.93 .000 .005
Actinobacteria
Actinomyces 0.00 0,04 0,13 0,06 0.30 0,97 .001 .021
Dentocariosa 0.00 0.00 0.05 0.00 0,13 0,32 .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0.00 0,01 0,22 0,15 1.02 2.44 .000 .006
Firmicutes
Autre (bacilles) 0.00 0,01 0,06 0.00 0,04 0,10 .706 1.000
Staphylococcus 0.00 0,01 0,12 0.00 0,07 0,17 .548 1.000
(Gemellaceae) 0.00 0.00 0,07 0,12 0,77 1.24 .005 .091
(Bacilles) 0.00 0.00 0,04 0.00 0,12 1,50 .004 .073
Granulicatella 0,09 0,23 0,37 0,64 1,59 2.28 .000 disponibles.003
Lactobacillus 0.00 0.00 0,18 0.00 0.00 0,04 .700 1.000
Autre (Streptococcaceae) 0.00 0,04 0,13 0.00 0,10 0,19 .768 1.000
(Streptococcaceae) 0,04 0,10 0,23 0,12 0,37 0,69 .005 .083
Streptocoque 53,42 61,96 88,38 48.44 60,83 73,97 .055 .930
Autres (Lachnospiraceae) 0.00 0.00 0,01 0.00 0.00 0,11 disponibles.003 0,58
Dialister 0.00 0.00 0,04 0.00 0.00 0,04 .240 1.000
Veillonella 3.43 27.15 42,78 6.69 13.38 27.05 .157 1.000
Proteobacteria
Haemophilus 0.00 0.00 0,03 0,31 0,84 2.38 .000 .008
test #p-valeur Wilcoxon signé-grade ajustés selon correction de Bonferroni
Un p < 0,0026 était considérée comme significative

Tableau 1 : Analyse statistique. Différences dans le microbiome oral des enfants sains à deux moments dans le temps. Données générées avec 454-pyrosequencing. Image modifiée de Klug et al. 23

Discussion

Les bactéries sont trouvent sur tous les sites au sein de la cavité buccale24,25,26. De nombreuses études ont porté sur l’utilisation de la salive comme milieu d’échantillonnage pour mapper colonisation orale, il peut facilement être échantillonnés par cracher27,28,29,30,31, 32. Cependant, biofilm salivaire ne reflète pas la composition de biofilm sous-gingival. Ainsi, l’utilisation d’autres méthodes d’échantillonnage est cruciale pour la création de l’ensemble du tableau et suscitera de nouvelles discussions en recherche dentaire. Plusieurs articles comparent l’utilisation des curettes et pointes de papier pour l’échantillonnage sous-gingivale de sujets malades venant de33,8,34. Encore aucun groupe de recherche n’est connu avoir porté sur l’application des dispositifs d’échantillonnage standardisé pour différents groupes d’âge, surtout pour les enfants,19.

Dans cette vidéo, échantillonnage de biofilm oral de trois habitats par voie orale chez les enfants en bonne santé est présenté.

Modifications et dépannage :

Le but du manuscrit se concentre sur le protocole clinique pour l’échantillonnage de biofilm sous-gingival des enfants sains. La méthode de choix fait référence à son sulci sous-gingivale où espace limité rend particulièrement difficile l’échantillonnage. Dans cette vidéo la méthode a été appliquée à la dentition permanente au début. Il peut également être appliqué à la dentition mixte ou mature et pour les enfants et/ou les adultes. Notre méthode d’échantillonnage permet des modifications telles que des échantillons simples ou groupés. Ce dernier pourrait devenir un facteur crucial pour les analyses moléculaires en raison de la faible quantité d’ADN collectable de sillon sous-gingivale sain. Le choix des dents indice peut être modifié sur demande ; en particulier, une autre dent peut-être être échantillonnés en guise d’alternative lorsque l’épithélium est traumatisée et saignantes, rendant ainsi le point de papier inutilisables. L’échantillonnage parallèle à l’aide de deux pointes de papier en même temps au même endroit rend échantillon réplique en une seule étape, en plus de raccourcir le temps de la chaise pour enfants.

Vous pourrez déguster des poches parodontales malades avec de légères modifications. Ici les pointes de papier devra insérer toute la longueur de la poche, qui peut atteindre jusqu'à 10 mm. La longueur et le conus de pointes de papier ainsi que la profondeur d’insertion doit être adaptée à l’habitat intra-buccale d’intérêt, mais devraient toujours être normalisés par le matériel et les dimensions. Peuvent également être des prélèvements de la muqueuse à l’aide de pointes de papier. Protocoles identiques permettent des comparaisons de différents habitats orale et divers matériaux dentaires. Préparation du patient et la conservation de l’échantillon peuvent être effectuées comme indiqué dans cette vidéo. Metatranscriptome recherche, RNA pourrait être échantillonné avec la même méthode. Ainsi, après le prélèvement, les pointes de papier doivent être insérés directement dans la solution de stabilisation RNA.

Limites de la Technique :

Indépendamment des modifications, la méthode de prélèvement d’échantillons cliniques que nous décrivons est limitée à son sillon sous-gingival. Autres sites d’échantillonnage, en ce qui concerne les poches malades venant d’exemple, ne faisaient pas partie de notre conception de l’étude. Comme l’échantillonnage jusqu'à la profondeur totale de ces poches est nécessaire, pointes de papier n’est peut-être pas assez grands pour prélever des échantillons suffisamment. Si le but expérimental est de comparer les données prélevées dans son sulci sous-gingivale et poches venant de malades, il est important d’être conscient de la partialité inhérente associée aux méthodes d’échantillonnage cliniques différentes. Il n’est donc pas conseillé de comparer ces données.

Une limitation de la méthode présentée ici est l’échantillonnage sans l’utilisation subséquente de propidium monoazide. L’ajout de cet agent directement après l’échantillonnage permet pour une analyse spécifique des seules cellules vivantes dans le biofilm analysés. La méthode décrite ici reflète le nombre de cellules mortes et vivantes. Pour la recherche de la parodontite sévère, pointes de papier devrez probablement remplacé par curettes, comme la formation de biofilm dans des poches profondes est forte. Point de papier échantillonnage ne reflète ne peut-être pas tout le spectre microbien dans ces cas, que leur surface peut-être être saturé trop rapidement.

Importance en ce qui concerne les méthodes existantes :

Le manuscrit proposé est le premier du genre à normaliser sous-gingivale d’échantillonnage dans le sulcus sain avec des pointes de papier. Autres rapports ont évoqué l’utilisation de métal curettes35,36 ou papier points 37,38,39, mais n’a pas décrit les processus qui ont lieu avant l’échantillonnage, telle contrôle de plaque, nettoyage des dents, dent isolement et séchage, ainsi que les processus qui résultent de spécifications insuffisantes sur les lignes d’échantillonnage de technique et de temps.

Dans deux articles précédents, nous montrons que l’utilisation de pointes de papier est une méthode reproductible pour l’échantillonnage de biofilm sous-gingival enfants22,40. En raison de leur conception, curettes sont trop volumineux pour le sillon peu profond avec un espace limité et trop pointue pour l’épithélium jonctionnel d’appel d’offres. Il est crucial d’accéder le sillon sous-gingivale sans traumatiser l’épithélium. De cette façon, partialité découlant de saignement est évitée. Ainsi, l’utilisation des points de papier mince et tendre est préférée pour ce domaine. Pointes de papier sont fonctionnelles pour surveiller les changements dans la composition de biofilm pendant le traitement orthodontique21,41. Ils sont minces et suffisamment souple pour s’adapter entre les éléments d’appareils orthodontiques fixes. Il s’agit d’un avantage majeur à d’autres méthodes d’échantillonnage comme curettes. L’échantillonnage atraumatique est simplifiée et échantillonnage de petites quantités d’ADN est possible.

Applications futures :

Dans cette vidéo, nous avons démontré la méthode sur la dentition non malades, précoce, permanente. Il peut également être appliqué à la dentition mixte ou mature. Avec quelques adaptations, il est possible d’échantillonner des sites venant de malades comme les dents ou implants et autres niches en raison des matériaux dentaires en suivant le même protocole. Recherche de caries pourrait bénéficier de ce protocole normalisé, dans des études particulières sur les caries radiculaires. La plus importante conférence de notre échantillonnage vidéo est la normalisation des protocoles pour rendre les données comparables, n’importe quoi et comment les échantillons sont mesurés.Démonstrations vidéo futures pourraient améliorer le domaine de la clinique d’échantillonnage en général.

Biofilm oral obtenu comme montré dans la vidéo est utilisée dans des cliniques et des recherches scientifiques. Cette approche en vivo représente un bon ajout à in vitro des techniques moléculaires tels que la fluorescence in situ hybridation et confocal laser scanning microscopy15. NGS méthodes, comme le pyrosequencing illustré ici, appliqué pour le biofilm collecté, permettent l’analyse de la microflore complète. Calcul de l’abondance relative de certaines espèces de bactéries peut être utilisé pour soutenir les traitements ou pour comparer différents patients ou des traitements différents. Avec un workflow d’analyse normalisées séquençage protocole et de la séquence que nous avons déjà décrit40, cette méthode d’échantillonnage permet l’analyse de la séquence jusqu’au niveau du genre. En outre « meta »-études telles que les études metatranscriptomic ou métabolomique sont possibles basées sur le protocole d’échantillonnage présenté dans cette vidéo.

Étapes essentielles :

Évitant la contamination est une étape essentielle : instruments stériles doivent être appliquées dans un environnement non stérile en vivo . Le transfert de la bouche vers le banc doit être effectué rapidement et en toute sécurité par un examinateur expérimenté de garder l’heure de la chaire pour les participants à l’étude aussi courts que possible. L’étape la plus critique dans le protocole est l’insertion atraumatique de la pointe de papier dans le sulcus sous-gingival. Perturbation de l’épithélium jonctionnel et saignements absolument doivent être évités. Aucune autre précaution doit être prise pour ne pas contaminer des pointes de papier et les flacons de stockage avec l’ADN ou d’ARN exogène. Puis, le stockage à elle-même est aussi une étape cruciale. Échantillons doivent être congelés directement, au mieux à −80 ° C. Cela évite des changements dans la composition bactérienne post prélèvement d’échantillons, qui pourrait falsifier les résultats du séquençage.

Disclosures

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêt associés à cette production vidéo scientifique.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants à Joachim Theussl (Centre de recherche médicale, Université médicale de Graz), pour son aide technique dans la production vidéo et de Monica Farrell (gestion de la recherche, Université médicale de Graz) comme talent vocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183, (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73, (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9, (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18, (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65, (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19, (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32, (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6, (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73, (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221, (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84, (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19, (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19, (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18, (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27, (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5, (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27, (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18, (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391, (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57, (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122, (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51, (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7, (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6, (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7, (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1, (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17, (4), 1209-1218 (2013).
Échantillonnage de Biofilm oral Microbiome analyse chez les enfants en bonne santé
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Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

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