Förändringar i den muntliga mikrobiomet under hela barndomen är av växande intresse. Jämförelse mellan olika mikrobiomet studier visar en brist på standardiserade provtagning protokoll. Begränsat utrymme gör provtagning den sunda subgingival sulcus av barn utmanande. Papper punkt provtagning presenteras här i detalj som metod för val för detta område.
Oral biofilm och dess molekylära analys underlag för att undersöka olika odontologisk forskning och kliniska frågor. Kunskap om biofilm sammansättning leder till en bättre förståelse av mekanismerna för cariogenic och periopathogenic. Mikrobiell förändringar som sker i munhålan under barndomen är av intresse för flera skäl. Utvecklingen av barn oral bakterieflora och förskjutningar i dess sammansättning behöver analyseras ytterligare för att förstå och möjligen förebygga uppkomsten av sjukdom. På samma gång behövs fördjupade kunskaper om den naturliga sammansättningen av oral biofilm. Tidiga stadier av karies-gratis permanent tanduppsättning med friskt tandkött ger en allmänt opåverkad subgingival livsmiljö som kan fungera som en i situ baslinjen för att studera funktionerna i oral hälsa och sjukdom. Analys av barns orala biofilmen under olika skeden i livet är således ett viktigt tema i fältet. Moderna molekylära analysmetoder kan ge omfattande information om bakteriella mångfalden av sådan biofilm. För att aktivera bakterieflora data jämförelse, är det viktigt att standardisera varje steg i förfarandet för molekylära data generation. Detta förfarande spänner från klinisk provtagning, Nästa Generation Sequencing (NGS), bioinformatiska databehandling, till taxonomiska tolkning. En av de mest kritiska faktorerna här är biofilm provtagning. Provtagning på barn är ännu mer utmanande i synnerhet på grund av begränsat utrymme i subgingival områden. Således fokuserar vi på användning av papper punkter för subgingival provtagning. Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för oral biofilm provtagning av den subgingivala sulcus, slemhinna och saliv hos barn.
Mänskliga oral biofilm består av en bred gemenskap som består mestadels av förknippas och nyttiga mikroorganismer1,2,3. Arter finns här kolonisera alla nischer att munhålan erbjuder4,5,6. Biofilm sammansättning i dessa nischer varierar så mycket som livsmiljöer. Saliv visar till exempel olika bakteriella profiler än plack prover. I plack prover av friska vuxna är det relativa överflödet av Actinobacteria över 20%, medan mindre än 7% återfinns i saliv. Bacteroidetes och Firmicutes visas däremot i mycket högre siffror i saliv7. Det är därför viktigt att prov på olika platser i munnen för att få hela bilden. Dessutom kan gör olika faktorer såsom geografiska och etniska skillnader, ålder, kön och många andra faktorer det svårt att identifiera allmänna regler för biofilm utveckling och sjukdom debut8,9. Utredning av periopathogenic och cariogenic biofilm har under många år varit en central fråga8,10,11,12,13.
Under de senaste åren har forskning på friska försökspersoner fått betydelse inte bara för en bredare förståelse för sjukdomen, men också för genomförandet av förebyggande åtgärder14. Ny teknik och molekylära analyser ytterligare belysa oral biofilm bildning och funktion15,16, och möjliggöra komplett profilering av mikrobiell mångfald17,18. Detta förväntas också leda till en ny förståelse av mikrobiell förändringar under ortodontisk behandling19. En inverkan på utveckling tandreglering biomaterial är förutsebara. Det förbättrade perspektivet kommer att kasta nytt ljus på komplikationer av ortodontisk behandling är associerad med biofilm, såsom emalj demineralization och parodontala sjukdomar12,20,21. För att tillåta worldwide data jämförelser, är det viktigt att standardisera alla steg i data generation. Mindre ändringar i laboratorierutiner kan starkt påverka resultaten. Dessutom, kan användning av varierande computational plattformar i databehandling leda till icke jämförbara datamängder. Slutligen, valet av statistiska tester och korrigeringar har en inverkan på resultaten. Dock provtagning bias kan uppstå redan långt innan några laborationer eller bio-computing påbörjas. Icke-standardiserade provtagningsmetoder leda till en inneboende partisk studie. Med tanke på låga till måttliga halter av standardisering i relevanta studier, det finns lite bevis på förhållandet mellan Ortodonti och microbiomes19. Utvecklingen av standardiserade metoder skulle därför underlätta kvalificerad jämförelse av data i fältet.
Denna artikel presenterar standardiserade oral biofilm provtagningsförfaranden. Protokollet är avsett att bidra till att generera globalt jämförbara samlingar av mikrobiell sekvensdata. Ett steg för steg protokoll för oral biofilm provtagning hos friska barn presenteras. Som metod för val är papper punkter infogade atraumatiskt i den sunda subgingival sulcus. För att underlätta livsmiljö jämförelser, samplas kinden slemhinna enligt samma protokoll. Denna artikel visar dessutom parallellt och poolade provtagning. Dessutom visas saliv provtagning. En enkel färgkodade transport och lagringssystem presenteras också, att underlätta preparatet förvaltning för vidare bearbetning. Valet av downstreamverksamhet avseende lagringsmedium, gjorts analyser och bioinformatik är beroende av de kliniska frågor som olika fält i muntliga forskning. I detta manuskript valts DNA-provtagning för NGS som ett exempel på en eventuell tillämpning för tandreglering forskning.
Bakterier finns på alla platser inom munhålan24,25,26. Många studier har fokuserat på användningen av saliv som provtagning medium att mappa muntliga kolonisering som det enkelt kan avsmakas genom spotta27,28,29,30,31, 32. Saliv biofilm återspeglar dock inte subgingival biofilm sammansättning. Således, användningen av andra provtagningsmetoder är avgörande för att skapa hela bilden, och kommer att framkalla nya diskussioner i odontologisk forskning. Flera artiklar jämföra användningen av Skrapningarna och paper points för subgingival provtagning av periodontally sjuka försökspersoner8,33,34. Ännu är ingen forskargrupp känt för att ha fokuserat på tillämpningen av standardiserad provtagning enheter för olika åldersgrupper, särskilt för barn19.
I det här videoklippet presenteras oral biofilm provtagning av tre muntliga livsmiljöer i friska barn.
Modifieringar och felsökning:
Syftet med manuskriptet fokuserar på det kliniska protokollet för subgingival biofilm provtagning av friska barn. Metoden för val avser ljud subgingival sulci där begränsat utrymme gör provtagning särskilt utmanande. I denna video var metoden tillämpas tidiga permanent tanduppsättning. Det kan också användas till blandade eller mogen tanduppsättning och till barn eller vuxna. Våra urvalsmetoden möjliggör ändringar, till exempel enkel eller poolade prover. Denne kan bli en avgörande faktor för molekylära analyser på grund av den lilla mängden DNA indrivningsbar från den friska subgingival sulcus. Valet av index tänderna kan ändras på begäran; i synnerhet, kanske en annan tand urvalet som ett alternativ när epitelet är traumatiserade och blödande, vilket gör papperspoint oanvändbar. Parallella provtagning med två papper pekar samtidigt på en plats gör provet replikat i ett steg, förutom förkorta tiden stol för barn.
Diseased parodontala fickor kan provtas med smärre ändringar. Här kommer papper punkter måste införas till fickan, som kan nå upp till 10 mm full längd. Längd och conus papper punkter samt djupet av införande måste anpassas till den intraorala livsmiljöen av intresse, men bör alltid standardiseras av material och dimensioner. Prover kan också tas från slemhinnan med hjälp av papper punkter. Identiska protokoll tillåter jämförelser av olika muntliga livsmiljöer och olika dentala material. Patientförberedelse och förvaringen kan utföras som beskrivs i den här videon. För metatranscriptome forskning, kunde RNA provtas med samma metod. Efter provtagningen, bör således papper punkter införas direkt i RNA stabilisering lösning.
Begränsningar av tekniken:
Oavsett ändringar är kliniska urvalsmetoden beskriver vi begränsad till sund subgingival sulcus. Inte ingick andra provtagningspunkterna, som för anföra som exempel periodontally sjuka fickor, i vår studiedesign. Som provtagning på hela djupet av sådan fickor behövs, kanske papper punkter inte tillräckligt stor för att samla in prover tillräckligt. Om den experimentella mål är att jämföra data från sund subgingival sulci och periodontally sjuka fickor, är det viktigt att vara medveten om den inneboende bias som associeras med olika kliniska provtagningsmetoder. Det är därför inte lämpligt att jämföra sådana uppgifter.
En begränsning av den metod som presenteras här provtagning utan efterföljande användning av propidium monoazide. Lägga till denna agent direkt efter provtagningen möjliggör specifik analys av endast levande celler i den biofilm som analyseras. Urvalsmetoden beskrivas här återspeglar antalet levande och döda celler. För forskning av allvarlig parodontit, kommer papper punkter förmodligen behöva ersättas med skrapningarna, som biofilm bildning i djupa fickor är stark. Papperspoint provtagning inte kanske återspeglar hela mikrobiell spektrumet i dessa fall som deras yta kan vara mättad för snabbt.
Betydelse med avseende på befintliga metoder:
Föreslagna manuskriptet är först i sitt slag att standardisera subgingival provtagning i den friska sulcus med papper poäng. Andra rapporter har avses användning av metall skrapningarna35,36 eller papper pekar 37,38,39, men inte beskriva de processer som äger rum före provtagningen, sådana plack kontroll, rengöring av tand, tand isolering och torkning, samt processerna som följd av otillräckliga specifikationer på provtagningsledningarna teknik och tid.
I två tidigare artiklar visar vi att användningen av papper punkter är en reproducerbar metod för subgingival biofilm provtagning i barn22,40. På grund av deras design är skrapningarna för stor för den grunda sulcus med begränsat utrymme och för skarp för anbud Junktional epitel. Det är viktigt att komma åt den subgingivala sulcus utan traumatizing epitel. På detta sätt undviks bias uppkommer blödningar. Användning av slim och anbud papper pekar alltså föredra för detta område. Papper är funktionell för att övervaka förändringar i biofilm sammansättning under tandreglering21,41. De är smal och tillräckligt flexibel för att passa mellan elementen i fasta ortodontiska hjälpmedel. Detta är en stor fördel till andra provtagningsmetoder som skrapningarna. Atraumatiska provtagning är förenklad och provtagning av små mängder DNA är möjligt.
Framtida tillämpningar:
I denna video visat vi metoden på icke-sjuka, tidig, permanent tanduppsättning. Det kan också tillämpas på blandade eller mogen tandbildning. Med vissa anpassningar är det möjligt att prova periodontally sjuka sajter som tänder eller implantat och andra nischer på grund av dentala material genom att följa samma protokoll. Karies forskning kunde dra nytta av detta standardiserade protokoll, särskilt undersökningar på roten karies. Den viktigaste föreläsningen från vår provtagning video är standardisering av protokollen att göra uppgifterna jämförbara, oavsett vad och hur prover mäts.Framtida videodemonstrationer kunde förbättra fältet klinisk provtagning i allmänhet.
Oral biofilm framställs som visas i videon används på kliniker och för vetenskapliga undersökningar. Detta in vivo -Metod utgör ett bra komplement till in vitro- molekylära tekniker såsom fluorescens i situ hybridisering och confocal microscopy15för laserscanning. NGS metoder, möjliggör som de pyrosekvensering som visas här, tillämpas på de insamlade biofilmen, analys av den fullständiga bakterieflora. Beräkning av de relativa förekomsten av vissa bakteriearter kan användas för att stödja behandlingar eller att jämföra olika patienter eller olika behandlingar. Tillsammans med en standardiserad sekvensering protokoll och sekvens analys arbetsflöde att vi tidigare har beskrivit40, här urvalsmetoden tillåter sekvensanalys slutmottagarnivå släkte. Ytterligare ”meta”-studier såsom metatranscriptomic eller metabolomiska studier är möjligt baserat på protokollet provtagning som presenteras i denna video.
Kritiska steg:
Att undvika kontaminering är ett kritiskt steg: sterila instrument måste tillämpas i en icke-sterila i vivo -miljö. Överföringen från munnen till bänken måste utföras snabbt och säkert av en erfaren examinator att hålla stol tiden för studiedeltagare så kort som möjligt. Det mest kritiska steget i protokollet är atraumatiska införandet av papper pekar in i den subgingivala sulcus. Störningar av Junktional epitelet och blödning absolut måste undvikas. Ytterligare försiktighet måste vidtas för att inte förorena papperet punkter och förvaring flaskor med exogent DNA eller RNA. Själva lagringen sedan är också ett viktigt steg. Prover måste frysas direkt, i bästa −80 ° C. Detta undviker förändringar i bakteriell sammansättning post stickprovsundersökningar, som skulle förfalska sekvensering resultat.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma att Joachim Theussl (Center för medicinsk forskning, medicinska universitetar av Graz) för utmärkta tekniska bistånd i video produktionen och Monica Farrell (forskning Management, medicinsk universitetar av Graz) som röst.
Paper Points Taper .02, sterilised | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
Rondells blue | DIRECTA AB | Rondell Tablets | http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 |
Great Lakes Nola Dry Field System | Great Lakes Ortho | 300-401 | http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 |
tooth brush | Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | |
micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml | Lactan | CH77.1 to CH81.1 | www.lactan |
cotton swabs | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |