Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Orale Biofilm prøveudtagning for Microbiome analyse i sunde børn

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

Ændringer i den mundtlige microbiome hele barndommen er af stigende interesse. Sammenligning af forskellige microbiome undersøgelser afslører en mangel på standardiserede prøveudtagning protokoller. Begrænset plads gør prøveudtagning den lyd subgingival sulcus børn udfordrende. Papir punkt prøveudtagning præsenteres her i detaljer som den foretrukne metode til dette område.

Abstract

Orale biofilm og dens molekylære analyser danne grundlag for at undersøge forskellige dental forskning og kliniske spørgsmål. Viden om biofilm sammensætning fører til en bedre forståelse i kariogene og periopathogenic mekanismer. Mikrobielle ændringer finder sted i mundhulen i barndommen er interessante af flere grunde. Udviklingen af børns mundtlige mikrobiota og ændringer i dets sammensætning skal være analyseret yderligere for at forstå og muligvis forhindre udbrud af sygdommen. På samme tid, er avanceret viden om den naturlige sammensætning af orale biofilm nødvendig. Tidlige stadier af caries-fri permanente tandsæt med sundt tandkød giver et bredt upåvirket subgingival levesteder, der kan tjene som en i situ baseline til at studere kendetegn ved oral sundhed og sygdom. Analyse af børns mundtlige biofilm på forskellige stadier i livet er således et vigtigt tema i feltet. Moderne molekylære analysemetoder kan give omfattende information om den bakterielle mangfoldighed af sådanne biofilm. Hvis du vil aktivere mikrobiota data sammenligning, er det vigtigt at standardisere hvert trin i proceduren for molekylære data generation. Denne procedure spænder fra kliniske prøveudtagning, næste Generation Sequencing (NGS), bioinformatic databehandling, taksonomisk fortolkning. En af de mest kritiske faktorer her er biofilm prøveudtagning. Prøvetagning i børn er endnu mere udfordrende navnlig på grund af begrænset plads i subgingival områder. Dermed fokuserer vi på brugen af papir Point til subgingival sampling. Denne artikel giver en detaljeret protokol for orale biofilm udsnit af den subgingival sulcus, slimhinder og spyt hos børn.

Introduction

Menneskelige orale biofilm består af et bredt fællesskab bestående hovedsagelig af latente og gavnlige mikroorganismer1,2,3. Arter, der findes her kolonisere alle nicher, mundhulen tilbyder4,5,6. Biofilm sammensætning i disse nicher varierer så bredt som levesteder. Spyt viser for eksempel forskellige bakterielle profiler end plaque prøver. I plaque prøver af raske voksne er den relative forekomst af Actinobacteria over 20%, mens mindre end 7% er fundet i spyt. Bacteroidetes og Firmicutes fremgå derimod meget højere numre i spyt7. Således, det er vigtigt at prøve forskellige steder i munden for at få hele billedet. Derudover gør forskellige faktorer såsom geografiske og etniske forskelle, alder, køn og mange andre faktorer det vanskeligt at identificere generelle regler for biofilm udvikling og sygdom udbrud8,9. Undersøgelse af periopathogenic og kariogene biofilm har i mange år været et centralt anliggende8,10,11,12,13.

I de seneste år, har forskning på raske forsøgspersoner fik betydning ikke blot for en bredere forståelse af sygdommen, men også for gennemførelsen af forebyggende foranstaltninger14. Nye teknologier og molekylære analyser yderligere belyse orale biofilm dannelsen og funktionen15,16, og aktiverer komplet profilering af mikrobiel diversitet17,18. Dette forventes at også føre til en ny forståelse af mikrobielle ændringer under Ortodontisk behandling19. Indvirkning på udviklingen af Ortodontisk biomaterialer er forudsigelige. Den forbedrede perspektiv vil kaste nyt lys over komplikationer af Ortodontisk behandling forbundet med biofilm, såsom emalje demineralisering og parodontale sygdomme12,20,21. For at tillade verdensomspændende data sammenligninger, er det afgørende at standardisere alle trin i data generation. Mindre ændringer i laboratorieprocedurer kan stærkt påvirke resultaterne. Desuden kan brug af varierende beregningsmæssige platforme i databehandling føre til ikke-sammenlignelige datasæt. Endelig har valg af statistiske test og korrektioner en indflydelse på resultaterne. Dog prøveudtagning bias kan allerede opstår længe før nogen laboratoriearbejde eller bio-computing påbegyndes. Ikke-standardiseret prøveudtagningsmetoder føre til en ifølge sagens natur partisk undersøgelse. På grund af lav til moderat niveauer af standardisering i de relevante undersøgelser findes lidt dokumentation på forholdet mellem ortodonti og microbiomes19. Derfor vil udviklingen af standardiserede metoder lette kvalificeret sammenligning af data i feltet.

Denne artikel præsenterer standardiseret orale biofilm prøveudtagningsprocedurer. Protokollen er beregnet til at bidrage til at generere globalt sammenlignelige samlinger af mikrobielle sekvens data. En trinvis protokol for orale biofilm prøveudtagning i sunde børn er præsenteret. Som den foretrukne metode er papir Point indsatte atraumatically ind i den lyd subgingival sulcus. For at lette habitat sammenligninger, er kinden slimhinde stikprøven efter samme protokol. Denne artikel viser desuden parallelle og poolet prøveudtagning. Derudover er spyt prøver vist. En simpel farve-kodet transport og opbevaringssystem er også præsenteret, lette modellen management til videreforarbejdning. Valg af downstream operationer vedrørende opbevaring medium, metagenomic analyser og bioinformatik afhænger de kliniske spørgsmål fra forskellige felter i mundtlig forskning. I dette manuskript, er DNA prøveudtagning for NGS blevet valgt som et eksempel på et muligt program for tandregulering forskning.

Protocol

Protokol og optagelse af video blev godkendt af institutionelle review board af den medicinske universitet i Graz (Friedrich 27-126ex14/15). Skriftligt samtykke til denne video offentliggørelse blev indhentet fra barnet og hendes forældre.

1. instrumenter og materialer

  1. Cut kalibreret (ISO 015/02) og sterile papir Point, normalt bruges i endo terapi, på den første ring mark for at standardisere deres længde (figur 1).
  2. Gælder UV lys bestråling på 260 nm for 30 min for at undgå DNA og RNA kontaminering af papir Point (figur 2).
  3. Autoklave rør til opbevaring ved 120 ° C og 1,2 bar for 20 min og UV-bestråle dem så godt, eller ansætte klar-til-brug gamma bestrålet rør.

2. forberedelse af fag

Bemærk: Skriftlig informeret samtykke blev opnået fra barnet og hendes forældre før tilmelding.

  1. Anvende kakaosmør på læberne.
  2. Montere kind og tunge retractor for fuld adgang til begge dental buer.
  3. Pletten plak med plaque offentliggørelse.
  4. Fjerne tør felt apparater.
  5. Skyl munden med vand, indtil vandet er farveløs.
  6. Børste tænderne grundigt med en elektrisk tandbørste på 45 ° vinkling. Anvende vand kun men ingen tandpasta, da dette ville ændre den orale biofilm.
  7. Montere tør felt apparatet igen, herunder tunge vagt til at holde munden åben og tør.
  8. Rene og tørre indeks tænder med steril vatsvabere at undgå absorption af supragingival væske under papir punkt prøveudtagning.

3. Biofilm prøveudtagning

  1. Papir punkt prøveudtagning af den subgingival sulcus
    1. Forstå papir punkter med steril dental pincet.
    2. Indsæt papir Point tangentielt op til definerede længde 4 mm. Vær særlig forsigtig ikke at traumatisere junctional epitel (figur 3).
    3. Fjern papir point efter 20 s.
    4. Indsamle papir Point direkte i rede rør: Placer papir punkt tip direkte i en steril og DNA-fri hætteglas, og bagfjerding den tredje mark til en standardiseret længde af 4 mm (figur 4).
    5. Hvis angivet af protokollerne undersøgelse, indsætte to papir Point parallelt og samtidigt på det samme websted (figur 5A).
    6. Alternativt, indsamle papir point fra flere steder hvis undersøgelse protokollen kræver "poolede prøver" (figur 5B).
    7. Fjerne tørre inden apparatet for slimhinder og spyt prøver.
  2. Slimhinde papir punkt prøveudtagning
    1. Anvende papir Point til den vestibulære fold af den øverste kind (figur 6).
    2. Luk kinden og massere det kort.
    3. Åbn kinden og fjern papir point efter 20 s.
    4. Klip papir Point på den tredje mark og placere dem i sterile rør, som er angivet for subgingival sampling.
  3. Spyt prøver
    1. Lad barnet spytte unstimulated spyt ind i en steriliseret indsamlingen fartøjets (figur 7).

4. overførsel og opbevaring

  1. Indsamle papir point som fælles, poolet eller parallel prøver afhængigt af forsøgsdesign (figur 8).
  2. Anvende et farvekodet storagesystem for at lette yderligere prøve management (figur 9).
  3. Endelig, opbevare prøver på −80 ° C indtil der foreligger microbiome analyse.

Representative Results

I den nuværende publikation, er DNA prøveudtagning for NGS demonstreret som et eksempel på et muligt program for tandregulering forskning. Bakteriel DNA er ekstraheret direkte fra papir punkt prøver. Dette DNA kan derefter bruges i studier af mikrobiel sammensætning for kliniske eller forskning spørgsmål (som sammenfattet i figur 10).

Moderne Molekylær analysemetoder såsom NGS metode 454-pyrosequencing giver en oversigt over den komplette mikrobiota af en stikprøve. DNA af tusindvis af bakterier er identificeret samtidig på forskellige fylogenetiske niveauer over 16s rRNA sekvens forskelle. Bioinformatic platforme skal oprettes som et middel til strukturering i klynger oplysninger, der hentes fra de store datasæt. Statistiske analyse kan derefter anvendes til mikrobiota datasæt.

Den samlede relative forekomst af visse bakteriearter kan analyseres som kan forskydninger i mikrobiota som følge af ændrede habitat betingelser. Søjlediagrammer (Figur 11) og heatmaps (figur 12) vise subgingival bakteriel sammensætning på phylum niveau eller Bestil niveau. Forskellige individer og behandlinger kan sammenlignes af beskrivende og inferential statistik. Figur 13 præsenterer et histogram sammenligning af to former for subgingival papir punkt prøveudtagning på forskellige taksonomiske niveauer. Tabel 1 viser skiftet i biofilm sammensætning under en in vitro- undersøgelse, der sammenligner to tidspunkter (T1- og T3). Statistisk signifikante ændringer blev beregnet med Wilcoxon underskrevet-rank test og følgende Bonferroni korrektion fra 454-pyrosequencing data.

Endelig, Principal Coordinate analyse (PCoA) muliggør direkte 3D sammenligning på operationelle taksonomisk enhed (OTU) niveau, som er identificeret i forskellige prøver. PCoA grunde i Figur 14 viser intra og Inter-Diesel individual forskelle i den subgingival microbiome i en case serie af fem børn. Figur 15 viser resultaterne af en tandregulering case-kontrol undersøgelse: pink til røde prikker er tilfældene, lys til mørk blå prikker er kontrolelementer, alle stikprøven gentagne gange over en periode på fire måneder. En klar klynger af sagerne efter Ortodontisk intervention (røde prikker) repræsenterer et skift i microbiome. Blå prikker, der repræsenterer kontrolgruppen, er jævnt fordelt.

Figure 1
Figur 1 : Forberede papir Point af standardiserede længde. Sterile kalibreret papir Point er skåret på den første ring mark at standardisere deres længde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Sterilize og gratis papir point fra DNA. Standardiseret papir Point er steriliseret og UV bestråling i en ren bænk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Subgingival papir punkt indsættelse. Sterile kalibreret papir Point er indsat tangentielt ind i den subgingival sulcus indtil 4 mm ring mark for 20 s.

Figure 4
Figur 4 : Opskæring papir point i tube. Direkte efter prøvetagning, papir Point er skåret på den tredje ring mark (4 mm) i en steril og DNA-fri 1,5 mL hætteglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Poolede og parallelle prøvetagning. To papir Point er indsat samtidigt i den subgingival sulcus i en tand (A) eller flere kontaktpunkter, papir i den subgingival sulci flere tænder (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Slimhinder prøveudtagning. Sterile kalibreret papir Point er lagt ind i slimhinden i den vestibulære fold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Spyt samling. Unstimulated spyt er spytte i et sterilt bæger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Prøveudtagningsprocedure. Prøver kan indsamles som single (venstre side, en tand hver), samlet (flere af dem alle striber i et hætteglas) eller parallel (blå striber, to papir Point på en tand) prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9 : Farvekodede opbevaring. En henvisende farvekode for ark og hætteglas letter yderligere prøve håndtering.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10 : Subgingival biofilm analyse. Skematisk præsentation af klinisk biofilm prøveudtagning (A), DNA-ekstraktion (B) og forskellige NGS teknologier (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11 : Søjlediagram. Viser relativ overflod af bakterier på phylum plan analyseret ved hjælp af 454-pyrosequencing. Billede fra Santigli et al. har ændret 22 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12 : Heatmap. Viser relative mængder af bakteriel ordrer analyseret ved hjælp af 454-pyrosequencing. Mørk rød repræsenterer en høj relativ overflod (> 10%). Mørkeblå repræsenterer en meget lav at ingen relative forekomst af de respektive bakteriel rækkefølge. Billede fra Santigli et al. har ændret 22 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13 : Histogram. Sammenligning af to former for papir punkt prøveudtagning (tilstande A og B) på forskellige taksonomiske niveauer. Data genereret med 454-pyrosequencing. Billede fra Santigli et al. har ændret 22 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 14
Figur 14 : 2D PCoA plot. En case serie (n = 5) viser intra individuelle og indbyrdes individuelle forskelle som følge af to subgingival prøveudtagningsmetoder (1 farve er 1 emne). Data genereret med 454-pyrosequencing. Billede fra Santigli et al. har ændret 22 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 15
Figur 15 : Snapshot af en 3D PCoA plot animation. Viser subgingival microbiome forskydninger i en tandregulering case-control undersøgelse (n = 16; hver gruppe, 3 point i tid; tilfælde: lyserød til rød, kontrol: lys til mørk blå). Data genereret med 454-pyrosequencing.Upublicerede data fra arbejdsgruppen vedrørende Santigli. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Systematisk enhed: Bacteriae Tidspunkt 1 [%] Tidspunkt 3 [%] Wilcoxon underskrevet-rank test
Phylum/slægten 25. Median 75 25. Median 75 p-værdi p-værdi justeret #
Andre
Andre 0.70 1.07 1.28 1.32 1.63 1,93 .000 .005
Actinobacteria
Actinomyces 0,00 0,04 0,13 0,06 0,30 0,97 .001 .021
Rothia 0,00 0,00 0,05 0,00 0,13 0,32 .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0,00 0,01 0,22 0,15 1,02 2,44 .000 .006
Firmicutes
Andre (baciller) 0,00 0,01 0,06 0,00 0,04 0,10 .706 1,000
Staphylococcus 0,00 0,01 0,12 0,00 0,07 0,17 .548 1,000
(Gemellaceae) 0,00 0,00 0,07 0,12 0,77 1.24 .005 .091
(Lactobacillales) 0,00 0,00 0,04 0,00 0,12 1,50 .004 .073
Granulicatella 0,09 0,23 0,37 0,64 1,59 2.28 .000 .003
Lactobacillus 0,00 0,00 0,18 0,00 0,00 0,04 .700 1,000
Andre (Streptococcaceae) 0,00 0,04 0,13 0,00 0,10 0,19 .768 1,000
(Streptococcaceae) 0,04 0,10 0,23 0,12 0,37 0,69 .005 .083
Streptococcus 53.42 61.96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930
Andre (Lachnospiraceae) 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,11 .003 .058
Dialister 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,04 .240 1,000
Veillonella 3.43 27.15 42.78 6.69 13.38 27.05 .157 1,000
Proteobakterier
Haemophilus 0,00 0,00 0,03 0.31 0,84 2,38 .000 .008
#p-værdi Wilcoxon underskrevet-rank test justeret ifølge Bonferroni korrektion
En p < 0.0026 blev betragtet som væsentlig

Tabel 1: Statistiske analyse. Forskelle i den mundtlige microbiome af sunde børn på to punkter i tid. Data genereret med 454-pyrosequencing. Billedet ændres fra Klug et al. 23

Discussion

Bakterier findes på alle steder i mundhulen24,25,26. Mange undersøgelser har fokuseret på brugen af spyt som en prøveudtagning medium til kort mundtlige kolonisering, som det kan nemt udtages gennem spytte27,28,29,30,31, 32. Spyt biofilm afspejler imidlertid ikke subgingival biofilm sammensætning. Således, anvendelse af andre prøveudtagnings er afgørende for at skabe hele billedet, og vil fremkalde nye diskussioner i dental forskning. Flere artikler sammenligne brugen af curettes og papir Point til subgingival prøvetagning af periodontally syge fag8,33,34. Endnu er ingen forskningsgruppe kendt for at have fokuseret på anvendelsen af standardiserede prøveudtagning enheder til forskellige aldersgrupper, især for børn19.

I denne video præsenteres orale biofilm prøveudtagning af tre mundtlige levesteder i raske børn.

Ændringer og fejlfinding:

Formålet med håndskriftet fokuserer på den kliniske protokol for subgingival biofilm prøveudtagning af raske børn. Den foretrukne metode henviser til lyd subgingival sulci hvor begrænset plads gør prøveudtagning især udfordrende. I denne video blev metoden anvendt til tidlig permanente tandsæt. Det kan også anvendes til blandet eller modne tandsæt og til børn og/eller voksne. Vores prøveudtagningsmetode giver mulighed for ændringer som enkelt eller samlet prøver. Sidstnævnte kan blive en afgørende faktor for molekylære analyser på grund af den lille mængde DNA indsamles fra den sunde subgingival sulcus. Valget af indeks tænder kan ændres efter efterspørgslen; især muligvis en anden tand stikprøven som alternativ når epitel er traumatiseret og blødning, hvilket gør papir punktet ubrugelig. Parallelle prøvetagning ved hjælp af to papir Point samtidig på én lokation gengiver prøve replikater i ét trin, ud over at nedbringe tid, stol til børn.

Syge parodontale lommer kan udtages prøver med mindre ændringer. Papir Point skal her indsættes den fulde længde af lommen, som kan nå op til 10 mm. Længde og conus papir Point samt dybden af isætning skal tilpasses til intraorale levested for interesse, men bør altid være standardiseret af materiale og dimensioner. Prøver kan også tages fra slimhinden ved hjælp af papir Point. Identiske protokoller foretage sammenligninger af forskellige mundtlige levesteder og forskellige dental materialer. Patienters forberedelse og opbevaring af prøven kan udføres som beskrevet i denne video. For metatranscriptome forskning, kunne RNA udtages med den samme metode. Således, efter prøvetagning, papir Point bør indsættes direkte i RNA stabilisering løsning.

Begrænsninger af teknikken:

Uanset ændringer er den kliniske prøveudtagningsmetode vi beskrive begrænset til den sunde subgingival sulcus. Andre websteder, prøveudtagning, som for eksempel periodontally syge lommer, var ikke en del af vores undersøgelse design. Prøveudtagning til den fulde dybde af sådanne lommer er nødvendige, kan papir Point ikke være stor nok til at indsamle prøver tilstrækkeligt. Hvis den eksperimentelle mål er at sammenligne data stikprøven fra lyd subgingival sulci og periodontally syge lommer, er det vigtigt at være opmærksom på den iboende skævhed, der er knyttet til forskellige kliniske prøveudtagningsmetoder. Det er derfor ikke tilrådeligt at sammenligne sådanne data.

En begrænsning af den metode, der præsenteres her prøvetagning uden efterfølgende brug af propidium monoazide. Tilføjer denne agent direkte efter prøveudtagningen tillader specifikke analyse af kun de levende celler i biofilm analyseret. Stikprøvemetoden beskrives her afspejler antal levende og døde celler. For forskning af svær paradentose, vil papir Point sandsynligvis nødt til at blive erstattet af curettes, som Biofilmdannelse i dybe lommer er stærk. Papir punkt prøveudtagning ikke kan afspejle det hele mikrobielle spektrum i disse sager, som deres overflade kan være mættet for hurtigt.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder:

Den foreslåede manuskript er først af sin art til at standardisere subgingival sampling i den sunde sulcus med papir Point. Andre rapporter har omhandlet anvendelsen af metal curettes35,36 eller papir peger 37,38,39, men ikke beskrive de processer, der finder sted forud for prøveudtagning, sådan som plaque kontrol, tand rensning, tand isolation, og tørring, samt de processer, der skyldes utilstrækkelig specifikationer på prøveudtagning teknik og tid linjer.

I to tidligere artikler viser vi, at brugen af papir Point er en reproducerbar metode for subgingival biofilm prøveudtagning i børn22,40. På grund af deres design er curettes for stor til den lavvandede sulcus med begrænset plads og for skarpt til den møre junctional epitel. Det er afgørende at få adgang til den subgingival sulcus uden traumatizing epitel. På denne måde undgås bias som følge af blødning. Således foretrækkes brug af slank og ømme papir Point for dette område. Papir Point er funktionel til at overvåge ændringer i biofilm sammensætning under tandretning21,41. De er slanke og fleksible nok til at passe mellem elementer af faste Ortodontisk apparater. Dette er en stor fordel at andre metoder som curettes. Atraumatisk prøveudtagning er forenklet og prøveudtagning af små mængder af DNA er muligt.

Fremtidige ansøgninger:

I denne video viste vi metoden på ikke-syge, tidlig, permanente tandsæt. Det kan også anvendes til blandet eller modne tandsæt. Med visse tilpasninger er det muligt at prøve periodontally syge sites som tænder eller implantater og andre nicher på grund af dentale materialer ved at følge samme protokol. Caries forskning kunne drage fordel af denne standardiseret protokol, i særlige undersøgelser på roden caries. De vigtigste foredrag fra vores video prøveudtagning er standardisering af protokoller at gøre dataene sammenlignelige, uanset hvad, og hvordan prøver måles.Fremtidige video demonstrationer kunne forbedre inden for klinisk prøveudtagning i almindelighed.

Orale biofilm fremstillet som vist i videoen bruges i klinikker og for videnskabelige undersøgelser. Denne i vivo tilgang udgør en god tilføjelse til in vitro- molekylære teknikker som fluorescens i situ hybridisering og konfokal laser scanning mikroskopi15. NGS metoder, Tillad som pyrosequencing vist her, anvendes på de indsamlede biofilm, analyse af den komplette mikrobiota. Beregning af de relative mængder af visse bakteriearter kan bruges til at understøtte behandlinger eller til at sammenligne forskellige patienter eller de forskellige behandlinger. Sammen med en standardiseret sekventering protokol og sekvens analyse arbejdsproces, vi tidligere har beskrevet40, denne prøveudtagningsmetode tillader Sekvensanalyse slægten niveau. Yderligere "meta"-undersøgelser såsom metatranscriptomic eller metabolomic undersøgelser er muligt baseret på prøvetagning protokollen præsenteret i denne video.

Kritiske trin:

Undgå forurening er et kritisk skridt: sterile instrumenter der skal anvendes i en ikke-sterile i vivo miljø. Overførsel fra munden til bænken har skal udføres hurtigt og sikkert af en erfaren censor at holde stol tid for undersøgelsens deltagere så kort som muligt. Den mest kritiske trin i protokollen er atraumatisk indsættelsen af papir point i den subgingival sulcus. Afbrydelse af junctional epitel og blødning helt skal undgås. Yderligere pleje der skal tages for at ikke forurene papir Point og opbevaring hætteglas med eksogene DNA eller RNA. Opbevaring selv derefter er også et afgørende skridt. Prøverne skal indefryses direkte, i bedste fald ved −80 ° C. Dette undgår ændringer i bakteriel sammensætning post stikprøver, som ville forfalske sekventering resultater.

Disclosures

Forfatterne rapport ingen interessekonflikter, der er relateret til denne videnskabelige videoproduktion.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige at Joachim Theussl (Center for medicinalforskning, medicinske universitet i Graz) for den fremragende teknisk bistand i video-produktion og Monica Farrell (forskningsledelse, medicinske universitet i Graz) sangtalent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183, (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73, (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9, (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18, (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65, (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19, (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32, (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6, (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73, (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221, (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84, (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19, (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19, (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18, (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27, (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5, (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27, (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18, (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391, (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57, (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122, (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51, (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7, (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6, (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7, (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1, (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17, (4), 1209-1218 (2013).
Orale Biofilm prøveudtagning for Microbiome analyse i sunde børn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter