Ændringer i den mundtlige microbiome hele barndommen er af stigende interesse. Sammenligning af forskellige microbiome undersøgelser afslører en mangel på standardiserede prøveudtagning protokoller. Begrænset plads gør prøveudtagning den lyd subgingival sulcus børn udfordrende. Papir punkt prøveudtagning præsenteres her i detaljer som den foretrukne metode til dette område.
Orale biofilm og dens molekylære analyser danne grundlag for at undersøge forskellige dental forskning og kliniske spørgsmål. Viden om biofilm sammensætning fører til en bedre forståelse i kariogene og periopathogenic mekanismer. Mikrobielle ændringer finder sted i mundhulen i barndommen er interessante af flere grunde. Udviklingen af børns mundtlige mikrobiota og ændringer i dets sammensætning skal være analyseret yderligere for at forstå og muligvis forhindre udbrud af sygdommen. På samme tid, er avanceret viden om den naturlige sammensætning af orale biofilm nødvendig. Tidlige stadier af caries-fri permanente tandsæt med sundt tandkød giver et bredt upåvirket subgingival levesteder, der kan tjene som en i situ baseline til at studere kendetegn ved oral sundhed og sygdom. Analyse af børns mundtlige biofilm på forskellige stadier i livet er således et vigtigt tema i feltet. Moderne molekylære analysemetoder kan give omfattende information om den bakterielle mangfoldighed af sådanne biofilm. Hvis du vil aktivere mikrobiota data sammenligning, er det vigtigt at standardisere hvert trin i proceduren for molekylære data generation. Denne procedure spænder fra kliniske prøveudtagning, næste Generation Sequencing (NGS), bioinformatic databehandling, taksonomisk fortolkning. En af de mest kritiske faktorer her er biofilm prøveudtagning. Prøvetagning i børn er endnu mere udfordrende navnlig på grund af begrænset plads i subgingival områder. Dermed fokuserer vi på brugen af papir Point til subgingival sampling. Denne artikel giver en detaljeret protokol for orale biofilm udsnit af den subgingival sulcus, slimhinder og spyt hos børn.
Menneskelige orale biofilm består af et bredt fællesskab bestående hovedsagelig af latente og gavnlige mikroorganismer1,2,3. Arter, der findes her kolonisere alle nicher, mundhulen tilbyder4,5,6. Biofilm sammensætning i disse nicher varierer så bredt som levesteder. Spyt viser for eksempel forskellige bakterielle profiler end plaque prøver. I plaque prøver af raske voksne er den relative forekomst af Actinobacteria over 20%, mens mindre end 7% er fundet i spyt. Bacteroidetes og Firmicutes fremgå derimod meget højere numre i spyt7. Således, det er vigtigt at prøve forskellige steder i munden for at få hele billedet. Derudover gør forskellige faktorer såsom geografiske og etniske forskelle, alder, køn og mange andre faktorer det vanskeligt at identificere generelle regler for biofilm udvikling og sygdom udbrud8,9. Undersøgelse af periopathogenic og kariogene biofilm har i mange år været et centralt anliggende8,10,11,12,13.
I de seneste år, har forskning på raske forsøgspersoner fik betydning ikke blot for en bredere forståelse af sygdommen, men også for gennemførelsen af forebyggende foranstaltninger14. Nye teknologier og molekylære analyser yderligere belyse orale biofilm dannelsen og funktionen15,16, og aktiverer komplet profilering af mikrobiel diversitet17,18. Dette forventes at også føre til en ny forståelse af mikrobielle ændringer under Ortodontisk behandling19. Indvirkning på udviklingen af Ortodontisk biomaterialer er forudsigelige. Den forbedrede perspektiv vil kaste nyt lys over komplikationer af Ortodontisk behandling forbundet med biofilm, såsom emalje demineralisering og parodontale sygdomme12,20,21. For at tillade verdensomspændende data sammenligninger, er det afgørende at standardisere alle trin i data generation. Mindre ændringer i laboratorieprocedurer kan stærkt påvirke resultaterne. Desuden kan brug af varierende beregningsmæssige platforme i databehandling føre til ikke-sammenlignelige datasæt. Endelig har valg af statistiske test og korrektioner en indflydelse på resultaterne. Dog prøveudtagning bias kan allerede opstår længe før nogen laboratoriearbejde eller bio-computing påbegyndes. Ikke-standardiseret prøveudtagningsmetoder føre til en ifølge sagens natur partisk undersøgelse. På grund af lav til moderat niveauer af standardisering i de relevante undersøgelser findes lidt dokumentation på forholdet mellem ortodonti og microbiomes19. Derfor vil udviklingen af standardiserede metoder lette kvalificeret sammenligning af data i feltet.
Denne artikel præsenterer standardiseret orale biofilm prøveudtagningsprocedurer. Protokollen er beregnet til at bidrage til at generere globalt sammenlignelige samlinger af mikrobielle sekvens data. En trinvis protokol for orale biofilm prøveudtagning i sunde børn er præsenteret. Som den foretrukne metode er papir Point indsatte atraumatically ind i den lyd subgingival sulcus. For at lette habitat sammenligninger, er kinden slimhinde stikprøven efter samme protokol. Denne artikel viser desuden parallelle og poolet prøveudtagning. Derudover er spyt prøver vist. En simpel farve-kodet transport og opbevaringssystem er også præsenteret, lette modellen management til videreforarbejdning. Valg af downstream operationer vedrørende opbevaring medium, metagenomic analyser og bioinformatik afhænger de kliniske spørgsmål fra forskellige felter i mundtlig forskning. I dette manuskript, er DNA prøveudtagning for NGS blevet valgt som et eksempel på et muligt program for tandregulering forskning.
Bakterier findes på alle steder i mundhulen24,25,26. Mange undersøgelser har fokuseret på brugen af spyt som en prøveudtagning medium til kort mundtlige kolonisering, som det kan nemt udtages gennem spytte27,28,29,30,31, 32. Spyt biofilm afspejler imidlertid ikke subgingival biofilm sammensætning. Således, anvendelse af andre prøveudtagnings er afgørende for at skabe hele billedet, og vil fremkalde nye diskussioner i dental forskning. Flere artikler sammenligne brugen af curettes og papir Point til subgingival prøvetagning af periodontally syge fag8,33,34. Endnu er ingen forskningsgruppe kendt for at have fokuseret på anvendelsen af standardiserede prøveudtagning enheder til forskellige aldersgrupper, især for børn19.
I denne video præsenteres orale biofilm prøveudtagning af tre mundtlige levesteder i raske børn.
Ændringer og fejlfinding:
Formålet med håndskriftet fokuserer på den kliniske protokol for subgingival biofilm prøveudtagning af raske børn. Den foretrukne metode henviser til lyd subgingival sulci hvor begrænset plads gør prøveudtagning især udfordrende. I denne video blev metoden anvendt til tidlig permanente tandsæt. Det kan også anvendes til blandet eller modne tandsæt og til børn og/eller voksne. Vores prøveudtagningsmetode giver mulighed for ændringer som enkelt eller samlet prøver. Sidstnævnte kan blive en afgørende faktor for molekylære analyser på grund af den lille mængde DNA indsamles fra den sunde subgingival sulcus. Valget af indeks tænder kan ændres efter efterspørgslen; især muligvis en anden tand stikprøven som alternativ når epitel er traumatiseret og blødning, hvilket gør papir punktet ubrugelig. Parallelle prøvetagning ved hjælp af to papir Point samtidig på én lokation gengiver prøve replikater i ét trin, ud over at nedbringe tid, stol til børn.
Syge parodontale lommer kan udtages prøver med mindre ændringer. Papir Point skal her indsættes den fulde længde af lommen, som kan nå op til 10 mm. Længde og conus papir Point samt dybden af isætning skal tilpasses til intraorale levested for interesse, men bør altid være standardiseret af materiale og dimensioner. Prøver kan også tages fra slimhinden ved hjælp af papir Point. Identiske protokoller foretage sammenligninger af forskellige mundtlige levesteder og forskellige dental materialer. Patienters forberedelse og opbevaring af prøven kan udføres som beskrevet i denne video. For metatranscriptome forskning, kunne RNA udtages med den samme metode. Således, efter prøvetagning, papir Point bør indsættes direkte i RNA stabilisering løsning.
Begrænsninger af teknikken:
Uanset ændringer er den kliniske prøveudtagningsmetode vi beskrive begrænset til den sunde subgingival sulcus. Andre websteder, prøveudtagning, som for eksempel periodontally syge lommer, var ikke en del af vores undersøgelse design. Prøveudtagning til den fulde dybde af sådanne lommer er nødvendige, kan papir Point ikke være stor nok til at indsamle prøver tilstrækkeligt. Hvis den eksperimentelle mål er at sammenligne data stikprøven fra lyd subgingival sulci og periodontally syge lommer, er det vigtigt at være opmærksom på den iboende skævhed, der er knyttet til forskellige kliniske prøveudtagningsmetoder. Det er derfor ikke tilrådeligt at sammenligne sådanne data.
En begrænsning af den metode, der præsenteres her prøvetagning uden efterfølgende brug af propidium monoazide. Tilføjer denne agent direkte efter prøveudtagningen tillader specifikke analyse af kun de levende celler i biofilm analyseret. Stikprøvemetoden beskrives her afspejler antal levende og døde celler. For forskning af svær paradentose, vil papir Point sandsynligvis nødt til at blive erstattet af curettes, som Biofilmdannelse i dybe lommer er stærk. Papir punkt prøveudtagning ikke kan afspejle det hele mikrobielle spektrum i disse sager, som deres overflade kan være mættet for hurtigt.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder:
Den foreslåede manuskript er først af sin art til at standardisere subgingival sampling i den sunde sulcus med papir Point. Andre rapporter har omhandlet anvendelsen af metal curettes35,36 eller papir peger 37,38,39, men ikke beskrive de processer, der finder sted forud for prøveudtagning, sådan som plaque kontrol, tand rensning, tand isolation, og tørring, samt de processer, der skyldes utilstrækkelig specifikationer på prøveudtagning teknik og tid linjer.
I to tidligere artikler viser vi, at brugen af papir Point er en reproducerbar metode for subgingival biofilm prøveudtagning i børn22,40. På grund af deres design er curettes for stor til den lavvandede sulcus med begrænset plads og for skarpt til den møre junctional epitel. Det er afgørende at få adgang til den subgingival sulcus uden traumatizing epitel. På denne måde undgås bias som følge af blødning. Således foretrækkes brug af slank og ømme papir Point for dette område. Papir Point er funktionel til at overvåge ændringer i biofilm sammensætning under tandretning21,41. De er slanke og fleksible nok til at passe mellem elementer af faste Ortodontisk apparater. Dette er en stor fordel at andre metoder som curettes. Atraumatisk prøveudtagning er forenklet og prøveudtagning af små mængder af DNA er muligt.
Fremtidige ansøgninger:
I denne video viste vi metoden på ikke-syge, tidlig, permanente tandsæt. Det kan også anvendes til blandet eller modne tandsæt. Med visse tilpasninger er det muligt at prøve periodontally syge sites som tænder eller implantater og andre nicher på grund af dentale materialer ved at følge samme protokol. Caries forskning kunne drage fordel af denne standardiseret protokol, i særlige undersøgelser på roden caries. De vigtigste foredrag fra vores video prøveudtagning er standardisering af protokoller at gøre dataene sammenlignelige, uanset hvad, og hvordan prøver måles.Fremtidige video demonstrationer kunne forbedre inden for klinisk prøveudtagning i almindelighed.
Orale biofilm fremstillet som vist i videoen bruges i klinikker og for videnskabelige undersøgelser. Denne i vivo tilgang udgør en god tilføjelse til in vitro- molekylære teknikker som fluorescens i situ hybridisering og konfokal laser scanning mikroskopi15. NGS metoder, Tillad som pyrosequencing vist her, anvendes på de indsamlede biofilm, analyse af den komplette mikrobiota. Beregning af de relative mængder af visse bakteriearter kan bruges til at understøtte behandlinger eller til at sammenligne forskellige patienter eller de forskellige behandlinger. Sammen med en standardiseret sekventering protokol og sekvens analyse arbejdsproces, vi tidligere har beskrevet40, denne prøveudtagningsmetode tillader Sekvensanalyse slægten niveau. Yderligere “meta”-undersøgelser såsom metatranscriptomic eller metabolomic undersøgelser er muligt baseret på prøvetagning protokollen præsenteret i denne video.
Kritiske trin:
Undgå forurening er et kritisk skridt: sterile instrumenter der skal anvendes i en ikke-sterile i vivo miljø. Overførsel fra munden til bænken har skal udføres hurtigt og sikkert af en erfaren censor at holde stol tid for undersøgelsens deltagere så kort som muligt. Den mest kritiske trin i protokollen er atraumatisk indsættelsen af papir point i den subgingival sulcus. Afbrydelse af junctional epitel og blødning helt skal undgås. Yderligere pleje der skal tages for at ikke forurene papir Point og opbevaring hætteglas med eksogene DNA eller RNA. Opbevaring selv derefter er også et afgørende skridt. Prøverne skal indefryses direkte, i bedste fald ved −80 ° C. Dette undgår ændringer i bakteriel sammensætning post stikprøver, som ville forfalske sekventering resultater.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige at Joachim Theussl (Center for medicinalforskning, medicinske universitet i Graz) for den fremragende teknisk bistand i video-produktion og Monica Farrell (forskningsledelse, medicinske universitet i Graz) sangtalent.
Paper Points Taper .02, sterilised | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
Rondells blue | DIRECTA AB | Rondell Tablets | http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 |
Great Lakes Nola Dry Field System | Great Lakes Ortho | 300-401 | http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 |
tooth brush | Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | |
micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml | Lactan | CH77.1 to CH81.1 | www.lactan |
cotton swabs | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |