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Medicine

Oralen Biofilm Sampling für Microbiome Analyse bei gesunden Kindern

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

Änderungen in der mündlichen Microbiome während der gesamten Kindheit sind von wachsendem Interesse. Vergleich der verschiedenen Microbiome Studien zeigt einen Mangel an standardisierten Probenahme Protokolle. Begrenzten Raum macht Probenahme Ton subgingivalen Sulcus von schwierigen Kindern. Papier Punkt Probenahme präsentiert sich hier im Detail als die Methode der Wahl für diesen Bereich.

Abstract

Oraler Biofilm und seiner molekularen Analyse bilden eine Grundlage für die Untersuchung von verschiedenen zahnmedizinischen Forschung und klinischen Fragestellungen. Kenntnis der Zusammensetzung des Biofilms führt zu einem besseren Verständnis der Mechanismen kariogenen und Periopathogenic. Mikrobielle Veränderungen in der Mundhöhle während der Kindheit sind aus mehreren Gründen interessant. Die Entwicklung des Kindes mündliche Mikrobiota und Verschiebungen in der Zusammensetzung müssen weiter analysiert werden, um zu verstehen und möglicherweise verhindern, dass den Ausbruch der Krankheit. Zur gleichen Zeit braucht man fortgeschrittene Kenntnisse in der natürlichen Zusammensetzung der oralen Biofilm. Frühe Stadien der kariesfreien permanente Gebiss mit gesundem Zahnfleisch bieten einen weitgehend unberührt subgingivalen Lebensraum, der als ein in Situ -Baseline für die Untersuchung der Eigenschaften der oralen Gesundheit und Krankheit dienen kann. Analyse von Kinder oralen Biofilm in einzelnen Phasen im Leben ist daher ein wichtiges Thema im Bereich. Moderne molekulare Analysemethoden bieten umfassende Informationen über die bakteriellen Vielfalt von solchen Biofilmen. Um Mikrobiota Datenvergleich zu ermöglichen, ist es wichtig, jeden Schritt des Verfahrens für molekulare Datengenerierung zu standardisieren. Dieses Verfahren reicht von klinischen Proben, nächste Generation Sequencing (NGS), Bioinformatic Datenverarbeitung, taxonomische Interpretation. Einer der kritischsten Faktoren hier ist Biofilm Probenahme. Probenahme bei Kindern ist noch schwieriger, insbesondere aufgrund der beengten Platzverhältnisse im subgingivalen Bereichen. Wir konzentrieren uns daher auf die Verwendung von Papierspitzen zur subgingivalen Probenahme. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur oralen Biofilm Probenahme der subgingivalen Sulcus, Schleimhaut und Speichel bei Kindern.

Introduction

Menschlichen oralen Biofilm besteht aus einer breiten Community, bestehend hauptsächlich aus Kommensalen und nützlichen Mikroorganismen1,2,3. Zu kolonisieren Arten finden Sie hier alle Nischen, dass die Mundhöhle4,5,6 bietet. Biofilm-Zusammensetzung in diesen Nischen variiert so weit wie die Lebensräume. Speichel wird z. B. verschiedene bakterielle Profile als Plaque Proben. In Plaque Proben von gesunden Erwachsenen ist die relative Häufigkeit der Actinobacteria über 20 %, während weniger als 7 % im Speichel gefunden wird. Bacteroidetes und Firmicuten erscheinen dagegen in viel größerer Zahl im Speichel7. So ist es wichtig, Probe an verschiedenen Standorten in den Mund, um das Gesamtbild zu erhalten. Verschiedener Faktoren wie geographische und ethnische Unterschiede, Alter, Geschlecht und viele andere Faktoren erschweren zusätzlich das allgemeine Regeln für Biofilm Entwicklung und Krankheit Beginn8,9zu identifizieren. Die Untersuchung der Periopathogenic und kariogenen Biofilm hat seit vielen Jahren ein zentrales Anliegen8,10,11,12,13.

In den letzten Jahren hat die Forschung an gesunden Probanden Bedeutung nicht nur für ein umfassenderes Verständnis der Krankheit, sondern auch für die Umsetzung von vorbeugenden Maßnahmen14gewonnen. Neue Technologien und molekulare Analysen weiter aufzuklären, mündliche Biofilmbildung und Funktion15,16, und ermöglichen die komplette Profilierung der mikrobiellen Diversität17,18. Dies wird voraussichtlich auch zu einem neuen Verständnis von mikrobiellen Veränderungen während der kieferorthopädischen Therapie19führen. Auswirkungen auf die Entwicklung der kieferorthopädischen Biomaterialien ist absehbar. Die erweiterte Perspektive beleuchten neue Komplikationen der kieferorthopädischen Therapie verbunden mit Biofilm, wie Emaille Demineralisation und Parodontalerkrankungen12,20,21. Um weltweit Datenvergleiche zu ermöglichen, ist es wichtig, alle Schritte in die Datengenerierung zu standardisieren. Geringfügige Änderungen im Laborverfahren können die Ergebnisse stark beeinflussen. Darüber hinaus kann die Verwendung unterschiedlicher rechnerische Plattformen in der Datenverarbeitung zu nicht vergleichbaren Datensätzen führen. Zu guter Letzt hat die Wahl von statistischen Tests und Korrekturen einen Einfluss auf die Ergebnisse. Jedoch Probenahme Voreingenommenheit kann bereits lange vor jeder Arbeit im Labor auftreten oder Bio-computing beginnt. Nicht-standardisierte Stichprobenverfahren führen zu einer von Natur aus voreingenommenen Studie. Im Hinblick auf geringe bis moderatem Niveau der Standardisierung in den relevanten Studien gibt es wenig Beweise über die Beziehung zwischen Kieferorthopädie und Mikrobiome19. Daher würde die Entwicklung standardisierter Methoden qualifizierter Vergleich der Daten im Feld erleichtern.

Dieser Artikel stellt standardisierte oralen Biofilm Stichprobenverfahren. Das Protokoll soll dazu beitragen, weltweit vergleichbare Sammlungen von mikrobiellen Sequenzdaten generieren. Ein Schritt für Schritt Protokoll zur oralen Biofilm Probenahme bei gesunden Kindern wird vorgestellt. Als die Methode der Wahl sind Papierspitzen eingefügten Zahnimplantat in den Ton subgingivalen Sulcus. Um Lebensraum Vergleiche zu erleichtern, wird die Schleimhaut der Wange nach dem gleichen Protokoll abgetastet. Dieser Artikel beschreibt außerdem parallel und zusammengefasste Probenahme. Darüber hinaus ist Speichel Sampling gezeigt. Eine einfache Farbcodierung Transport und Speichersystem wird ebenfalls dargestellt, Probe-Management zur weiteren Verarbeitung zu erleichtern. Die Wahl der downstream-Aktivitäten bezüglich Speichermedium, metagenomische Analysen und Bioinformatik richtet sich klinische Fragen nach verschiedenen Feldern in der mündlichen Forschung. In diesem Manuskript wurde DNA-Proben für NGS als Beispiel für eine mögliche Anwendung für die kieferorthopädischen Forschung gewählt.

Protocol

Protokoll und video-Aufnahmen wurden von der institutionellen Review Board der medizinischen Universität Graz (Votum 27-126ex14/15) genehmigt. Schriftlicher Zustimmung für dieses video wurde von dem Kind und ihrer Eltern erhalten.

1. Instrumente und Materialien

  1. Schnitt kalibriert (ISO 015/02) und steriler Papierspitzen, verwendet in der Regel in der endodontischen Therapie, bei der ersten Ring-Markierung um ihre Länge (Abbildung 1) zu standardisieren.
  2. Anwendung von UV-Licht-Bestrahlung bei 260 nm für 30 min zur Vermeidung von DNA und RNA Kontamination von Papierspitzen (Abbildung 2).
  3. Autoklaven der Rohre für die Lagerung bei 120 ° C und 1,2 bar für 20 min und UV bestrahlen sie sowie oder beschäftigen Ready-to-Use Gamma bestrahlt Röhren.

2. Vorbereitung des Probanden

Hinweis: Schriftliche Einwilligungserklärung wurde von Kind und Eltern vor der Einschreibung erhalten.

  1. Kakaobutter auf die Lippen auftragen
  2. Montieren Sie die Wange und Zunge Retraktor für vollen Zugriff auf beide dental Bögen.
  3. Führen Sie der Zahnbelag mit Plaque Offenlegung zu Flecken.
  4. Entfernen Sie den trockenen Bereich Apparat.
  5. Spülen Sie den Mund mit Wasser, bis das Wasser farblos ist.
  6. Putzen Sie die Zähne gründlich mit einer elektrischen Zahnbürste auf 45° Winkelung. Geben Sie Wasser nur aber keine Zahnpasta den oralen Biofilm verändern würde.
  7. Montieren Sie den trockenen Bereich Apparat wieder, einschließlich der Zunge Guard um den Mund offen und trocken zu halten.
  8. Sauber und trocken zeigen die Index-Zähne mit sterilen Wattestäbchen, Aufnahme von supragingivale Flüssigkeit bei Papier zu vermeiden Probenahme.

(3) Biofilm Sampling

  1. Papier Punkt Probenahme von subgingivalen sulcus
    1. Greifen Sie die Papierspitzen mit sterilen zahnärztliche Pinzette.
    2. Legen Sie Papier Punkte tangential bis zu einer definierten Länge von 4 mm. Besondere Vorsicht nicht zu traumatisieren die Knoten Epithel (Abbildung 3).
    3. Entfernen Sie Papierspitzen nach 20 s.
    4. Papierspitzen direkt in vorbereiteten Röhren sammeln: setzen Sie die Papier-Punkt-Spitze direkt in einem sterilen und DNA-freie Fläschchen, und schneiden Sie es bei der dritten Marke auf eine einheitliche Länge von 4 mm (Abbildung 4).
    5. Wenn durch die Studienprotokolle angezeigt, legen Sie zwei Papierspitzen parallel und gleichzeitig am selben Standort (Abb. 5A).
    6. Papierspitzen alternativ von mehreren Seiten zu sammeln, wenn das Studienprotokoll "gepoolte Proben" erfordert (Abb. 5 b).
    7. Entfernen Sie die trockenen Bereich Vorrichtung zur Schleimhaut und Speichel Sampling.
  2. Schleimhaut Papier Punkt Probenahme
    1. Papierspitzen auf die vestibuläre Falte die obere Backe (Abbildung 6) anwenden.
    2. Schließen Sie die Wange und massieren Sie es kurz.
    3. Öffnen Sie die Wange und entfernen Sie die Papierspitzen nach 20 s.
    4. Schneiden Sie Papierspitzen bei der dritten Marke und legen Sie sie in ein steriles Röhrchen wie für subgingivalen Probenahme angegeben.
  3. Speichel sampling
    1. Lassen Sie das Kind spucken unstimulierte Speichel in eine sterilisierte Sammelbehälter (Abbildung 7).

4. Übertragung und Speicherung

  1. Sammeln Sie Papierspitzen als Einzel-, gebündelt oder parallel Proben je nach Studiendesign (Abbildung 8).
  2. Anwenden einer farbcodierten Speichersystem um Probenverwaltung (Abbildung 9) weiter zu erleichtern.
  3. Schließlich speichern Sie die Proben bei −80 ° C bis Microbiome Analyse.

Representative Results

In der vorliegenden Publikation wird DNA-Proben für NGS als Beispiel für eine mögliche Anwendung für die kieferorthopädischen Forschung demonstriert. Bakterieller DNA wird direkt aus der Papierproben Punkt gewonnen. Diese DNA kann dann verwendet werden, in Studien der mikrobiellen Zusammensetzung für klinische oder Forschungsfragen (wie in Abbildung 10zusammengefasst).

Moderne molekulare Analysemethoden wie die NGS Methode 454-Pyrosequenzierung geben einen Überblick über die komplette Mikrobiota einer Probe. Die DNA von Tausenden von Bakterien wird gleichzeitig auf verschiedenen phylogenetischen Ebenen identifiziert, über die 16 s rRNA Sequenzunterschiede. Bioinformatic Plattformen müssen generiert werden, als ein Mittel zur Strukturierung in Clustern, die die Informationen aus den großen Datensätzen abgerufen. Statistische Analyse kann dann auf Mikrobiota Datasets angewendet werden.

Insgesamt relative Häufigkeit bestimmter Bakterienarten kann analysiert werden, wie Verschiebungen in der Mikrobiota aufgrund veränderter Lebensbedingungen können. Balkendiagramme (Abbildung 11) und Heatmaps (Abbildung 12) anzeigen die subgingivalen bakterielle Zusammensetzung Phylum Ebene oder auf Auftragsebene. Verschiedenen Personen und Behandlungen können von beschreibenden und schlussfolgernde Statistik verglichen werden. Abbildung 13 zeigt einen Histogramm-Vergleich von zwei Modi der subgingivalen Papierspitze Probenahme auf verschiedenen taxonomischen Ebenen. Tabelle 1 zeigt die Verschiebung im Biofilm Zusammensetzung während einer in-vitro- Studie vergleicht zwei Zeitpunkten (T1 und T3). Statistisch signifikante Veränderungen wurden mit Wilcoxon unterzeichnet-Rank-Test und folgende Bonferroni-Korrektur von 454-Pyrosequenzierung Daten berechnet.

Zu guter Letzt ermöglicht Principal Coordinate Analyse (HKoA) 3D Direktvergleich operative taxonomische Einheit (OTU) Ebene wie in verschiedenen Proben identifiziert. HKoA Grundstücke in Abbildung 14 zeigt Intra - und inter - individuelle Unterschiede der subgingivalen Microbiome in einer Fallserie von fünf Kindern. Abbildung 15 zeigt die Ergebnisse einer kieferorthopädischen Fall-Kontroll-Studie: rosa bis roten Punkte sind die Fälle, hell bis dunkel blauen Punkte sind die Kontrollen, alle aufgenommenen wiederholt über einen Zeitraum von vier Monaten. Ein klares clustering der Fälle nach der kieferorthopädischen Intervention (rote Punkte), stellt eine Verschiebung der Microbiome. Blaue Punkte repräsentieren die Kontrollgruppe sind gleichmäßig verteilt.

Figure 1
Abbildung 1 : Bereiten Sie Papierspitzen standardisierte Länge. Kalibrierten steriler Papierspitzen werden an der ersten Ring-Marke zu standardisieren ihre Länge geschnitten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Sterilisation und kostenlose Papierspitzen aus DNA. Standardisierte Papierspitzen werden sterilisiert und UV Bestrahlung in einem sauberen Werkbank. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Subgingivalen Papier Punkt einfügen. Kalibrierten steriler Papierspitzen werden tangential in der subgingivalen Sulcus eingefügt, bis 4 mm Ring Mark für 20 s.

Figure 4
Abbildung 4 : Papierspitze in Rohr schneiden. Unmittelbar nach der Probenahme, werden Papierspitzen am dritten Ring Mark (4 mm) in eine sterile und DNA-freie 1,5 mL Fläschchen geschnitten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Gebündelt und parallel Probenahme. Zwei Papierspitzen werden gleichzeitig in der subgingivalen Sulcus (A) ein Zahn oder mehrere Papierspitzen in der subgingivalen Furchen von mehreren Zähnen (B) eingefügt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Schleimhaut Probenahme. Kalibrierten steriler Papierspitzen werden in die Schleimhaut der vestibuläre Falte gelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Speichel Sammlung. Unstimulierte Speichel in ein steriles Becherglas zu spucken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Stichprobenplan. Proben können als Single (linke Seite, einen Zahn), zusammengefasst (mehrere zu aller Couleur in einer Ampulle) oder Parallel (blaue Streifen, zwei Papierspitzen an einem Zahn) Proben gesammelt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9 : Farblich Lagerung. Vorlegende Farbcode für Bettwäsche und Fläschchen erleichtert weiter probieren Handhabung.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10 : Analyse subgingivaler Biofilm. Schematische Darstellung der klinischen Biofilm Probenahme (A), DNA-Extraktion (B) und verschiedene NGS Technologien (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11 : Balkendiagramm. Zeigt relative Häufigkeit von Bakterien auf Phylum Ebene mit 454-Pyrosequenzierung analysiert. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 12
Abbildung 12 : Heatmap. Zeigt relative Häufigkeiten der bakteriellen Bestellungen analysiert mit 454-Pyrosequenzierung. Dunkelblaues Rot steht für eine hohe relative Häufigkeit (> 10 %). Dunkelblau stellt einen sehr geringen keine relative Häufigkeit der jeweiligen bakterielle Bestellung dar. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 13
Abbildung 13 : Histogramm. Vergleich von zwei Modi des Papiers Punkt Probenahme (Modi A und B) auf verschiedenen taxonomischen Ebenen. Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 14
Abbildung 14 : 2D HKoA Plot. Eine Fallserie (n = 5) zeigt intra individuelle und interindividuelle Unterschiede durch zwei subgingivalen Probenahmeverfahren (1 Farbe ist 1 Thema). Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten. Bild von Santigli Et Al. geändert 22 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 15
Abbildung 15 : Momentaufnahme der HKoA Handlung 3D-Animation. Zeigt subgingivalen Microbiome verschiebt sich in einer kieferorthopädischen Fall-Kontroll-Studie (n = 16; jeder Gruppe, 3 Punkte in der Zeit; Fällen: rosa bis rot, Kontrollen: leichte bis dunkelblau). Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten.Unveröffentlichte Daten aus Arbeitsgruppe Santigli. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Taxon: Bakterien Zeitpunkt 1 [%] Zeitpunkt 3 [%] Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-test
Phylum/Gattung 25. Median 75. 25. Median 75. p-Wert p-Wert angepasst #
Andere
Andere 0.70 1.07 1.28 1.32 1,63 1.93 .000 .005
Actinobacteria
Actinomyces 0.00 0,04 0.13 0,06 0,30 0,97 .001 .021
Rothia 0.00 0.00 0.05 0.00 0.13 0,32 .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0.00 0,01 0,22 0,15 1.02 2.44 .000 .006
Firmicuten
Andere (Bazillen) 0.00 0,01 0,06 0.00 0,04 0.10 .706 1.000
Staphylokokken 0.00 0,01 0.12 0.00 0,07 0,17 .548 1.000
(Gemellaceae) 0.00 0.00 0,07 0.12 0,77 1.24 .005 .091
(Lactobacillales) 0.00 0.00 0,04 0.00 0.12 1.50 .004 .073
Granulicatella 0,09 0,23 0,37 0.64 1.59 2.28 .000 .003
Lactobacillus 0.00 0.00 0.18 0.00 0.00 0,04 .700 1.000
Andere (Streptococcaceae) 0.00 0,04 0.13 0.00 0.10 0,19 .768 1.000
(Streptococcaceae) 0,04 0.10 0,23 0.12 0,37 0.69 .005 .083
Streptokokken 53.42 61,96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930
Andere (Lachnospiraceae) 0.00 0.00 0,01 0.00 0.00 0,11 .003 .058
Dialister 0.00 0.00 0,04 0.00 0.00 0,04 .240 1.000
Veillonella 3.43 27.15 42.78 6,69 13,38 27.05. .157 1.000
Proteobakterien
Haemophilus 0.00 0.00 0,03 0,31 0,84 2.38 .000 .008
#p-Wert Wilcoxon unterzeichnet-Rang-Test angepasst nach Bonferroni-Korrektur
Eine p < 0.0026 galt als bedeutende

Tabelle 1: Statistische Analyse. Unterschiede in der mündlichen Microbiome von gesunden Kindern an zwei Punkten in der Zeit. Mit 454-Pyrosequenzierung generierte Daten. Bild von Klug Et Al. geändert 23

Discussion

Bakterien sind an allen Standorten innerhalb der Mundhöhle24,25,26gefunden. Viele Studien konzentrierten sich auf die Verwendung von Speichel als Medium Probenahme mündliche Kolonisation zuordnen, da es leicht entnommen werden kann, durch spucken27,28,29,30,31, 32. Allerdings spiegelt die Speicheldrüsen Biofilm nicht subgingivaler Biofilm Zusammensetzung. So, die Verwendung von anderen Probenahmeverfahren ist entscheidend für das ganze Bild zu schaffen und neue Diskussionen in der zahnmedizinischen Forschung wecken wird. Mehrere Artikel vergleichen die Verwendung von Zigarretten und Papierspitzen zur subgingivalen Probenahme von periodontally erkrankten Probanden8,33,34. Noch ist keine Forschungsgruppe bekannt, auf die Anwendung von standardisierten Probenahmegeräte für verschiedene Altersgruppen, vor allem für Kinder19konzentriert haben.

In diesem Video präsentiert oralen Biofilm Probenahme von drei mündliche Lebensräume bei gesunden Kindern.

Modifikationen und Fehlerbehebung:

Das Ziel des Manuskripts konzentriert sich auf das klinische Protokoll für subgingivaler Biofilm Probenahme von gesunden Kindern. Die Methode der Wahl bezieht sich auf solide subgingivalen Furchen wo Platzmangel macht Probenahme besonders anspruchsvoll. In diesem Video wurde die Methode zur frühen permanente Gebiss angewendet. Es kann auch gemischt oder Reife Gebiss und Kinder und/oder Erwachsene angewendet werden. Unsere Sampling-Methode ermöglicht Modifikationen wie Einzel- oder gepoolten Proben. Letzteres könnte ein entscheidender Faktor für molekulare Analysen aufgrund der geringen Menge der DNA Sammlerstücke aus der gesunden subgingivalen Sulcus geworden. Die Wahl der Index Zähne kann bei Bedarf geändert werden; insbesondere, möglicherweise einem anderen Zahn Stichprobe als eine Alternative, wenn das Epithel traumatisiert ist und Blutungen, wodurch die Papierspitze unbrauchbar. Parallele Probenahmen mit zwei Papierspitzen gleichzeitig an einem Standort macht Probe Wiederholungen in einem Schritt, neben der Verkürzung der Behandlungszeit für Kinder.

Mit geringfügigen Änderungen können erkrankten Zahnfleischtaschen entnommen werden. Papierspitzen müssen hier auf die volle Länge der Tasche eingefügt werden, die bis zu 10 mm erreichen. Die Länge und Conus Papierspitzen sowie die Tiefe der Einfügung der intraoralen Lebensraum von Interesse angepasst werden müssen, sondern sollte immer durch Material und Dimensionen vereinheitlicht werden. Proben können auch die Schleimhaut mit Papierspitzen entnommen werden. Identische Protokolle erlauben Vergleiche der verschiedenen mündlichen Lebensräume und verschiedenen Dentalmaterialien. Patientenvorbereitung und Lagerung der Probe können durchgeführt werden, wie in diesem Video beschrieben. Für die Metatranskriptom Forschung könnte RNA mit der gleichen Methode beprobt werden. Daher sollte nach der Probenahme, die Papierspitzen direkt in RNA Stabilisierung Lösung eingefügt werden.

Grenzen der Technik:

Unabhängig von Änderungen ist die klinische Sampling-Methode, die wir beschreiben beschränkt sich auf die solide subgingivalen Sulcus. Anderen Meßstellen für Beispiel periodontally erkrankten Taschen, waren nicht Teil unserer Studie Design. Papierspitzen sind möglicherweise nicht groß genug, um ausreichend Proben zu sammeln, bei Bedarf Probenahme, die volle Tiefe der solche Taschen. Wenn experimentelle Ziel ist es, Daten von sound subgingivalen Furchen und periodontally erkrankten Taschen abgetastet zu vergleichen, ist es wichtig die inhärente Tendenz bewusst sein, die verschiedenen klinischen Probenahmeverfahren zugeordnet ist. Es ist daher nicht ratsam, solche Daten zu vergleichen.

Eine Einschränkung der hier vorgestellten Methode ist ohne die spätere Verwendung der Propidium Monoazide Probenahme. Durch Hinzufügen dieser Agent direkt nach der Entnahme können für spezifische Analyse nur die lebenden Zellen im Biofilm analysiert. Die hier beschriebene Samplingmethode spiegelt Anzahlen von lebenden und toten Zellen. Für die Forschung von schweren Parodontitis müssen Papierspitzen wahrscheinlich durch Küretten, ersetzt werden da Biofilmbildung in tiefen Taschen stark ist. Papierspitze Probenahme nicht das gesamte Spektrum der mikrobiellen in diesen Fällen widerspiegeln könnte, da ihre Oberfläche zu schnell gesättigt sein könnte.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:

Das vorgeschlagene Manuskript ist das erste seiner Art, subgingivalen Probenahme in der gesunden Sulcus mit Papierspitzen zu standardisieren. Andere Berichte eingegangen, die Verwendung von Metall Küretten35,36 oder Papier 37,38,39Punkte, aber nicht beschreiben, die Prozesse, die vor der Probennahme, statt solche als Plaquekontrolle, Zahnreinigung, Zahn Isolation und trocknen sowie die Prozesse führen, die aus unzureichenden Spezifikationen auf die Entnahmeleitungen Technik und Zeit.

In zwei früheren Artikeln zeigen wir, dass die Verwendung von Papier Punkten eine reproduzierbare Methode zur subgingivaler Biofilm Sampling im Kinder22,40. Aufgrund ihrer Konstruktion sind Zigarretten zu groß für die flachen Sulcus mit wenig Platz und zu scharf für die zarten Knoten Epithel. Es ist entscheidend für die subgingivalen Sulcus zugreifen, ohne das Epithel traumatisierend. Auf diese Weise ist Voreingenommenheit entstehenden Blutungen vermieden. Somit ist die Verwendung von schlank und zart Papierspitzen bevorzugt für diesen Bereich. Papierspitzen sind funktionelle Veränderungen im Biofilm Zusammensetzung während der kieferorthopädischen Behandlung21,41überwachen. Sie sind schlank und flexibel genug, um zwischen den Elementen von festen kieferorthopädischen Geräten passen. Dies ist ein großer Vorteil zu anderen Probenahmeverfahren wie Zigarretten. Atraumatisch Probenahme wird vereinfacht und Probenahme von geringen Mengen von DNA ist möglich.

Zukünftige Anwendungen:

In diesem Video haben wir die Methode auf nicht-erkrankten, frühen, permanente Gebiss gezeigt. Es kann auch auf gemischte oder Reife Gebiss angewendet werden. Mit gewissen Anpassungen ist es möglich, periodontally erkrankten Websites wie Zähne oder Implantate und anderen Nischen durch Dentalmaterialien zu probieren, durch Anschluss an das gleiche Protokoll. Karies-Forschung profitieren von dieser standardisierten Protokoll, insbesondere Studien auf Wurzelkaries. Der wichtigste Vortrag aus unserer video Probenahme ist die Standardisierung der Protokolle zu machen Daten vergleichbar, egal was und wie Proben gemessen werden.Zukunft video-Demonstrationen könnte das Feld der klinischen Probenahme im Allgemeinen verbessern.

Oralen Biofilm erhalten wie im Video gezeigt wird in Kliniken und für wissenschaftliche Untersuchungen verwendet. In Vivo ist eine gute Ergänzung für in-vitro- Molekulare Techniken wie Fluoreszenz in Situ Hybridisierung und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie15. NGS Methoden können als die hier gezeigten Pyrosequenzierung angewendet, die gesammelten Biofilm, die Analyse der kompletten Mikrobiota. Berechnung der relativen Häufigkeiten bestimmte Bakterienarten, Behandlungen zu unterstützen oder um verschiedene Patienten oder verschiedenen Behandlungen zu vergleichen lässt. Zusammen mit standardisierten Sequenzierung Protokoll und Sequenz-Analyse-Workflow haben wir zuvor beschrieben40, dieses Sampling-Methode ermöglicht Sequenzanalyse bis auf die Ebene der Gattung. Weitere "Meta"-Studien wie z. B. Metatranscriptomic oder Metabolomic Studien möglich sind anhand der Probenahme-Protokoll in diesem Video vorgestellt.

Wichtige Schritte:

Vermeidung von Kontaminationen ist ein entscheidender Schritt: sterile Instrumente müssen in einer Umgebung unsteril in Vivo angewandt werden. Die Übertragung aus dem Mund an der Werkbank muss schnell und sicher durchgeführt werden, von einem erfahrenen Prüfer Behandlungszeit für Studienteilnehmer so kurz wie möglich zu halten. Der wichtigste Schritt im Protokoll ist das atraumatische Einfügen von Papierspitze in der subgingivalen Sulcus. Störung der Knoten Epithel und absolut Blutungen müssen vermieden werden. Weitere Versorgung muss ergriffen werden, um die Papierspitzen und Lagerung Fläschchen mit exogener DNA oder RNA nicht verunreinigen. Die Lagerung selbst dann ist auch ein wichtiger Schritt. Proben müssen eingefroren werden direkt, am besten bei −80 ° C. Dies vermeidet Änderungen bei der bakteriellen Zusammensetzung Post Probenahme, die Sequenzierung Ergebnisse verfälschen würde.

Disclosures

Die Autoren berichten keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser wissenschaftlichen Videoproduktion.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar für die hervorragende technische Unterstützung in der Videoproduktion und Monica Farrell (Forschungsmanagement, medizinische Universität Graz) als Sprecher Joachim Theussl (Zentrum für medizinische Forschung, medizinische Universität Graz).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Oralen Biofilm Sampling für Microbiome Analyse bei gesunden Kindern
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Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

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