Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Sağlıklı çocuklarda Microbiome analiz için sözlü biyofilm örnekleme

doi: 10.3791/56320 Published: December 31, 2017

Summary

Çocukluk boyunca oral microbiome ilgi büyüyen değişikliklerdir. Farklı microbiome çalışmalar karşılaştırılması Standart örnekleme iletişim kurallarının eksikliği ortaya koymaktadır. Sınırlı alanlarda çocukların zorlu ses subgingival sulkus örnekleme yapar. Kağıt noktası örnekleme yönteminin seçimi için bu alanı olarak ayrıntılı olarak burada sunulur.

Abstract

Sözlü biyofilm ve moleküler analizi onun çeşitli diş araştırma ve klinik sorular inceleyen için bir temel oluşturur. Biyofilm kompozisyon bilmek daha iyi cariogenic ve periopathogenic mekanizmaları için anlamak için getirir. Mikrobiyal değişiklikleri çocukluk döneminde ağız boşluğunda yer alan ilgi için çeşitli nedenleri vardır. Çocuk sözlü microbiota ve vardiya onun bileşiminde evrimi anlamak ve muhtemelen hastalığın başlangıcı önlemek için daha fazla çözümlenmesi gerekiyor. Aynı zamanda, sözlü biyofilm doğal kompozisyon gelişmiş bilgi gereklidir. Sağlıklı diş etleri ile çürük ücretsiz kalıcı diş erken dönemlerinde şekil-in ağız sağlığı ve hastalığı eğitim için bir situ içinde temel olarak hizmet verebilir bir yaygın etkilenmemiş subgingival yaşam alanı sağlar. Çocuk ağız biyofilm hayatında farklı aşamalarında böylece alanında önemli bir tema analizidir. Modern moleküler analiz yöntemleri böyle biyofilmler bakteri çeşitliliği hakkında kapsamlı bilgi sağlar. Microbiota veri karşılaştırma etkinleştirmek için bu yordamı her adımda moleküler veri üretimi için standartlaştırmak önemlidir. Bu yordamı taksonomik yoruma klinik örnekleme, sonraki nesil sıralama (NGS), bioinformatic veri işleme'den yayılan. Burada en önemli faktörlerden biridir biyofilm örnekleme. Örnekleme çocuklarda daha fazla özellikle subgingival alanlarda sınırlı yer nedeniyle zordur. Biz böylece subgingival örnekleme kağıt Puan kullanımına odaklanmaktadır. Bu makalede subgingival sulkus, mukoza ve çocuklarda tükürük ağız biyofilm örnekleme için detaylı bir protokol sağlar.

Introduction

İnsan sözlü biyofilm çoğunlukla commensals ve yararlı mikroorganizmaların1,2,3oluşan geniş bir topluluk oluşmaktadır. Burada bulunan türler ağız boşluğu4,5,6sunmaktadır nişler kolonize. Bu nişler bileşiminde biyofilm habitatları olarak yaygın olarak değişir. Tükürük örneğin plaket örnekleri daha farklı bakteriyel profillerini görüntüler. % 7'den az tükürük içinde bulunur iken sağlıklı yetişkin plak örneklerinde evvel göreli bolluk % 20, sona erdi. Bacteroidetes ve Firmicutes tükürük7çok daha yüksek rakamlarla buna ek olarak görünür. Böylece, bütün resmi almak için örnek, ağız farklı yerlerdeki önemlidir. Ayrıca, coğrafi ve etnik farklılıkları, yaş, cinsiyet ve diğer birçok faktöre gibi çeşitli faktörler biyofilm geliştirme ve hastalık başlangıçlı8,9için genel kuralları tespit etmek zordur olun. Uzun yıllar boyunca periopathogenic ve cariogenic biyofilm Araştırma Merkezi endişe8,10,11,12,13oldu.

Son yıllarda, sağlıklı konularda araştırma sadece hastalık daha geniş bir anlayış için aynı zamanda önleyici tedbirler14uygulanması için önem kazanmıştır. Yeni teknolojiler ve moleküler analizleri daha fazla sözlü biyofilm oluşumu ve işlev15,16aydınlatmak ve mikrobiyal çeşitlilik17,18tam profil oluşturmayı etkinleştirmek. Bu da mikrobiyal değişiklikleri yeni bir anlayış ortodontik tedavi19sırasında yol bekleniyor. Ortodontik Biyomalzeme gelişimi üzerinde etkili öngörülebilir. Gelişmiş perspektif ortodontik tedavinin biyofilm, emaye Demineralizasyon ve periodontal hastalıklar12,20,21gibi ilişkili komplikasyonlar yeni ışık tutacak. Dünya çapında veri karşılaştırmaları izin vermek için tüm adımları veri üretimi standartlaştırmak önemlidir. Laboratuvar yordamlar küçük değişiklikler güçlü sonuçları etkileyebilir. Buna ek olarak, veri işleme Hesaplamalı platformlar değişen kullanım için karşılaştırılabilir olmayan veri kümeleri açabilir. Son olarak, istatistiksel testler ve düzeltmeler seçim sonuçları üzerinde büyük etkisi vardır. Ancak, önyargı örnekleme zaten uzun zaman önce herhangi bir laboratuar oluşabilir veya biyo-bilgi işlem başlar. Olmayan Standart örnekleme yöntemleri için doğal olarak önyargılı bir çalışma kurşun. İlgili çalışmalarda standardizasyon orta düzeyde düşük içinde görüş-in Ortodonti ve microbiomes19arasındaki ilişki çok az kanıt var. Bu nedenle, standart yöntem geliştirme nitelikli alandaki verilerin karşılaştırılması kolaylaştırmak.

Bu makale standart sözlü biyofilm örnekleme yordamları sunar. Protokol genel olarak karşılaştırılabilir koleksiyonları mikrobiyal sıralı veri üreten doğru katkıda bulunmak için tasarlanmıştır. Sağlıklı çocuklarda ağız biyofilm örnekleme için adım adım bir protokol sunulmuştur. Seçim yöntemi olarak kağıt ses subgingival sulkus içine eklenen atraumatically noktalarıdır. Habitat karşılaştırmaları kolaylaştıracak, yanak mukozasında göre aynı iletişim kuralını örneklenir. Bu makalede ayrıca paralel ve havuza alınan örnekleme gösterilmektedir. Ayrıca, tükürük örnekleme gösterilir. Basit bir renk kodlu taşıma ve depolama sistemi de diğer işlemler numune Yönetimi kolaylaştırmak sundu. Sözlü araştırma farklı alanları tarafından geçirilen klinik sorulara aşağı akım işlemleri ile ilgili depolama ortamı, metagenomic analizleri ve Biyoinformatik seçimi bağlıdır. Bu makale, DNA örnekleme NGS için ortodontik araştırma için olası bir uygulama örneği olarak seçildi.

Protocol

Protokol ve video çekim tıbbi Graz Üniversitesi (Votum 27-126ex14/15) Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi. Bu video yayın için yazılı izni çocuk ve onun üst elde edildi.

1. aletleri ve malzemeler

  1. Kalibre edilmiş kesim (ISO 015/02) ve genellikle kendi uzunluğu (şekil 1) standart hale getirmek için ilk halka işareti endodontik tedavide kullanılan steril kağıt puan.
  2. UV ışık ışınlama 260 uygulamak nm kağıt puan (Şekil 2) DNA ve RNA kirlenmesini önlemek için 30 dk için.
  3. Otoklav 120 ° C ve 1.2 depolama tüpler 20 dk ve UV ışınlatayım için onları de ya da istihdam kullanıma hazır gama tüpler ışınlanmış.

2. konular hazırlanması

Not: Çocuk ve onun üst kayıt önce yazılı Onam alındı.

  1. Kakao yağı dudaklar için geçerlidir.
  2. Retraktörü her iki diş kemer için tam erişim için dil ve yanak monte.
  3. Dental plak plak açığa çıkması ile leke.
  4. Kuru alan cihazları çıkarın.
  5. Su renksiz olana ağız suyla durulayın.
  6. Fırça diş 45 ° bükülme bir elektrikli diş fırçasıyla iyice. Bu sözlü biyofilm değiştirecek su diş macunu, ama sadece geçerlidir.
  7. Yine, ağız açık ve kuru tutmak için dil guard dahil olmak üzere kuru alan aparatı monte.
  8. Temiz ve kuru steril pamuk temizleme bezi supragingival sıvı emme sırasında kağıt önlemek için dizin dişleriyle örnekleme noktası.

3. biyofilm örnekleme

  1. Subgingival sulkus örnekleme noktası kağıt
    1. Kağıt Puan steril diş cımbız ile kavramak.
    2. Kağıt Puan yüzeysel kadar 4 mm tanımlanmış bir uzunluğu yerleştirin. Bileske epitel (şekil 3) travmatize değil özel dikkat.
    3. Sonra 20 kağıt noktalarını kaldırma s.
    4. Doğrudan hazır tüpler içine kağıt puan toplamak: kağıt noktası uç doğrudan bir steril ve DNA ücretsiz şişe yerleştirin ve üçüncü işareti olarak 4 mm (şekil 4) standart uzunluğa kesti.
    5. Çalışma iletişim kuralları tarafından belirtilen iki kağıt nokta paralel ve aynı anda aynı sitede (şekil 5A) yerleştirin.
    6. Alternatif olarak, toplamak kağıt makas çeşitli sitelerden çalışma Protokolü "havuza alınan örnekleri" gerektiriyorsa (şekil 5B).
    7. Kuru alan cihazları için kaldırmak Mukozal ve tükürük örnekleme.
  2. Mukozal kağıt üzerine gelin örnekleme
    1. Kağıt Puan üst yanak (şekil 6) Vestibüler kat uygulanır.
    2. Yanak kapatın ve kısa bir süre masaj.
    3. Yanak açın ve sonra 20 kağıt noktalarını kaldırma s.
    4. Kağıt puan üçüncü işareti olarak kesin ve onları steril bir tüp içinde subgingival örnekleme için gösterilen şekilde yerleştirin.
  3. Tükürük örnekleme
    1. Unstimulated tükürük sterilize koleksiyonu gemi (Şekil 7) tükürmek çocuk izin.

4. transfer ve depolama

  1. Bağlı olarak çalışma tasarımı (şekil 8) tek, havuza alınan veya paralel örnekleri olarak kağıt puan toplamak.
  2. Daha fazla örnek Yönetimi (Şekil 9) kolaylaştırmak için renk kodlu depolama sisteminin uygulayın.
  3. Son olarak, −80 ° C microbiome analiz bekleyen örnekleri saklayın.

Representative Results

Mevcut yayında DNA örnekleme NGS için ortodontik araştırma için olası bir uygulama örneği olarak gösterilmiştir. Bakteriyel DNA doğrudan kağıt noktası örneklerinden elde edilir. Bu DNA'yı sonra mikrobiyal kompozisyon için çalışmalarda kullanılan klinik veya araştırma soruları ( şekil 10' özetlendiği gibi).

NGS yöntemi 454-pyrosequencing gibi modern moleküler analiz yöntemleri örneği tam microbiota genel bir bakış verir. Binlerce bakteri DNA aynı anda farklı filogenetik düzeylerde 16s üzerinde tanımlanmış rRNA sıra farklılıklar. Bioinformatic platformlar büyük veri kümeleri bilgileri alındı kümeler halinde yapılandırma aracı olarak oluşturulması gerekir. İstatistiksel analiz sonra microbiota veri kümeleri için uygulanabilir.

Değişen yaşam koşulları nedeniyle microbiota nöbetleşe mümkün olduğunca bazı bakteri türleri genel olarak göreli bolluk analiz edilebilir. Çubuk grafikler (Şekil 11) ve heatmaps (şekil 12) subgingival bakteriyel kompozisyon şube düzeyinde veya sipariş düzeyinde görüntüleyin. Açıklayıcı ve Çıkarımsal istatistik tarafından çeşitli bireyler ve tedavileri karşılaştırılabilir. Şekil 13 bir çubuk grafik karşılaştırma farklı taksonomik düzeylerde örnekleme subgingival kağıt noktasının iki mod sunuyor. Tablo 1 vardiya iki zaman puan (T1 ve T3) karşılaştırarak bir vitro çalışma sırasında biyofilm bileşiminde gösterir. İstatistiksel olarak anlamlı değişiklikler Wilcoxon imzaladı-rank testi ve aşağıdaki Bonferroni düzeltmesi 454-pyrosequencing verilerden hesaplanmıştır.

Son olarak, asıl Coordinate çözümleme (PCoA) farklı örneklerinde tanımlandığı gibi operasyonel taksonomik birimi (OTU) düzeyinde doğrudan 3D karşılaştırma sağlar. Şekil 14 PCoA araziler içi ve arası individual farklılıkları subgingival microbiome beş çocuk büyük bir dizi görüntüler. Şekil 15 ortodontik bir vaka-kontrol çalışması sonuçlarını gösterir: durumlar için kırmızı noktalar pembe vardır, hafif koyu mavi noktalar denetimi, art arda dört aylık bir süre içinde tüm örneklenen vardır. Açık kasa ortodontik müdahale (kırmızı nokta) sonra kümeleme microbiome bir kayma temsil eder. Kontrol grubu temsil eden mavi noktalar eşit şekilde dağıtılır.

Figure 1
Resim 1 : Kağıt Puan standart uzunlukta hazırlayın. Steril kalibre edilmiş kağıt Puan uzunlukları standart hale getirmek için ilk halka işareti olarak kesilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Sterilize ve DNA ücretsiz Kağıt noktaları. Standart kağıt Puan steril ve temiz bir tezgah UV ışınlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Subgingival kağıt noktası ekleme. Steril kalibre edilmiş kağıt Puan eklendiği yüzeysel subgingival sulkus kadar 4 mm halka mark 20 s.

Figure 4
Şekil 4 : Kağıt nokta tüp içine kesme. Doğrudan örnekleme sonra üçüncü halka işareti (4 mm) içine bir steril ve DNA-Alerjik 1,5 mL flakon kağıt Puan kesilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Havuza alınmış ve paralel örnekleme. İki kağıt nokta aynı anda bir diş(a)veya birkaç kağıt noktaları subgingival sulci içine birkaç diş (B) sulkus subgingival eklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Mukozal örnekleme. Steril kalibre edilmiş kağıt puanları Vestibüler kat mukoza koyulur vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : Tükürük toplama. Unstimulated tükürük steril bir kabı tükürmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8 : Örnekleme planı. Örnekleri havuza alınmış (sol tarafta, bir diş) tek, (çeşitli bir şişe içinde bütün çizgileri için) veya paralel (mavi çizgili, bir diş iki kağıt noktada) örnekleri olarak toplanabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9 : Renk kodlu Muhafazası. Başvuran bir renk kod sayfaları ve şişeleri kolaylaştırır için daha fazla işleme örnek.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10 : Subgingival biyofilm analiz. Şematik sunumu klinik biyofilm örnekleme(a), (B) DNA ekstraksiyon ve farklı NGS teknolojileri (C). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 11
Şekil 11 : Çubuk grafik. 454-pyrosequencing kullanılarak analiz şube düzeyinde bakterilerin göreli bereket gösterilen. Santigli ve ark. modifiye resim 22 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 12
Şekil 12 : Heatmap. Bakteriyel siparişlerin kullanılarak analiz göreli zenginliği 454-pyrosequencing gösterilen. Koyu kırmızı temsil eden bir yüksek göreli bereket (> % 10). Koyu mavi ilgili bakteriyel sipariş göreli yok bereket için çok düşük temsil eder. Santigli ve ark. modifiye resim 22 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 13
Şekil 13 : Histogram. Karşılaştırma, iki işletim modundan birinde kağıt örnekleme (modları A ve B) farklı taksonomik düzeylerde üzerine gelin. 454-pyrosequencing ile oluşturulan veri. Santigli ve ark. modifiye resim 22 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 14
Şekil 14 : 2D PCoA arsa. Bir durum serisi (n = 5) intra bireysel ve inter bireysel farklılıklar (1 rengidir 1 konu) iki subgingival örnekleme yöntem sonucu olarak gösteriliyor. 454-pyrosequencing ile oluşturulan veri. Santigli ve ark. modifiye resim 22 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 15
Şekil 15 : Anlık görüntü 3D PCoA arsa animasyonun. Gösteren subgingival microbiome vardiya bir ortodontik vaka kontrol çalışmada (n = 16; her grup, 3 puan zamanında; durumlar: pembe kırmızı, denetimlere: koyu mavi ışık). 454-pyrosequencing ile oluşturulan veri.Yayınlanmamış veriler çalışma grubu Santigli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Takson: Bacteriae Zaman noktası 1 [%] Zaman noktası 3 [%] Wilcoxon imzaladı-rank testi
Şube/cins 25 Medyan 75 25 Medyan 75 p-değeri p-değeri düzeltilir #
Diğer
Diğer 0.70 1,07 1.28 1,32 1,63 1.93 .000 .005
Bunlar
Özellikle 0,00 0,04 0,13 0,06 0,30 0,97 *.001 .021
Rothia 0,00 0,00 0,05 0,00 0,13 0,32 *.001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0,00 0,01 0,22 0,15 1,02 2.44 .000 .006
Firmicutes
Diğer (basili) 0,00 0,01 0,06 0,00 0,04 0,10 .706 1.000
Stafilokok 0,00 0,01 0,12 0,00 0,07 0.17 .548 1.000
(Gemellaceae) 0,00 0,00 0,07 0,12 0.77 1,24 .005 .091
(Lactobacillales) 0,00 0,00 0,04 0,00 0,12 1,50 .004 .073
Granulicatella 0,09 0,23 0,37 0.64 1.59 2.28 .000 .003
Lactobacillus 0,00 0,00 0.18 0,00 0,00 0,04 .700 1.000
Diğer (Streptococcaceae) 0,00 0,04 0,13 0,00 0,10 0,19 .768 1.000
(Streptococcaceae) 0,04 0,10 0,23 0,12 0,37 0,69 .005 .083
Streptokok 53,42 61.96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930
Diğer (Lachnospiraceae) 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,11 .003 .058
Dialister 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,04 .240 1.000
Veillonella 3.43 27.15 42.78 6,69 13,38 27.05 .157 1.000
Bakteri
Haemophilus 0,00 0,00 0.03 0.31 0,84 2.38 .000 .008
#p-değeri Wilcoxon imzaladı-rank testi göre Bonferroni düzeltmesi ayarlanabilir
Bir p < 0.0026 olarak önemli kabul

Tablo 1: İstatistiksel analiz. İki nokta sağlıklı çocuklara oral microbiome farklılıkları zamanında. 454-pyrosequencing ile oluşturulan veri. Görüntü Klug vd. modifiye 23

Discussion

Bakteri ağız boşluğu24,25,26içinde tüm sitelerdeki bulunur. Birçok çalışma olarak kolayca27,28,29,30,31tükürme ile tatmak mümkündür gibi sözlü kolonizasyon eşlemek için bir örnekleme orta tükürük kullanımı odaklı olması, 32. Ancak, tükürük biyofilm subgingival biyofilm kompozisyon yansıtmaz. Böylece, diğer örnekleme yöntemleri bütün resmi oluşturmak için çok önemlidir ve diş araştırma yeni tartışmalara uyandırmak. Çeşitli makaleleri, Curettes| ve kağıt Puan kullanılması periodontally hastalıklı konular8,33,34subgingival örnekleme için karşılaştırın. Henüz hiçbir araştırma grubu farklı yaş gruplarına, özellikle çocuk19için Standart örnekleme aygıt uygulama odaklı olması bilinmektedir.

Bu videoda, sözlü biyofilm örnekleme sağlıklı çocuk üç sözlü alanları sunulur.

Değişiklikler ve sorun giderme:

Yazının amacı subgingival biyofilm örnekleme sağlıklı çocukların klinik protokol üzerinde duruluyor. Yönteminin seçimi nerede sınırlı alanlarda özellikle zorlu örnekleme yapar ses subgingival sulci ifade eder. Bu videoda yöntemi için erken kalıcı diş uygulandı. Ayrıca karışık veya olgun diş ve çocuk ve/veya yetişkin uygulanabilir. Bizim örnekleme yöntemi gibi tek veya havuza alınmış örnekleri değişiklikleri olanak sağlar. İkinci DNA sağlıklı subgingival sulkus collectable az miktarda nedeniyle moleküler analizleri için önemli bir faktör haline gelebilir. Seçtiğiniz dizin diş bir isteğe bağlı olarak değiştirilebilir; Özellikle, başka bir diş epitel travmaya bir alternatif olarak örneklenen ve kanama, böylece kağıt noktası kullanılamaz hale olabilir. Paralel örnekleme iki kağıt nokta aynı anda bir sitede kullanarak örnek çoğaltır sandalye zaman çocuklar için kısaltma ek olarak tek bir adımda işler.

Hafif değişikliklerle hastalıklı periodontal cepler tatmak mümkündür. Burada kağıt Puan 10 mm'ye kadar ulaşabilirsiniz cep boy eklenmesi gerekir. Konus kağıt noktalarının yanı sıra ekleme derinliği ve uzunluğu faiz intraoral habitat için adapte olmalıdır, ama her zaman malzeme ve boyutları tarafından standart. Örnekleri de kağıt noktalarını kullanarak mukoza alınabilir. Aynı iletişim kurallarına izin ver farklı oral habitatları ve çeşitli diş malzemeleri karşılaştırmalar. Hastanın hazırlanması ve örnek depolama Bu videoda anlatıldığı gibi gerçekleştirilir. Metatranscriptome araştırma için RNA aynı yöntemle örnek. Böylece, örnekleme sonra kağıt Puan doğrudan RNA sabitleme çözümde takılmalıdır.

Teknik sınırlamaları:

Değişiklikleri ne olursa olsun, biz tarif klinik örnekleme yöntemi için ses subgingival sulkus sınırlıdır. Örnek periodontally hastalıklı cepler, gelince diğer örnekleme siteleri bizim çalışma tasarımının parçası değildi. Örnekleme böyle cepler tam derinliği için gerektiği gibi kağıt Puan örnekleri yeterince toplayacak kadar büyük olmayabilir. Deneysel hedef ses subgingival sulci ve periodontally hastalıklı cepler örnek verileri karşılaştırmak için ise, farklı klinik örnekleme yöntemleri ile ilişkili doğasında önyargı haberdar olmak önemlidir. Bu nedenle bu tür verileri karşılaştırmak için tavsiye edilmez.

Burada sunulan yöntem bir sınırlama propidium monoazide sonraki kullanımı olmadan örnekleme. Bu aracı doğrudan örnekleme sonra ekleme analiz biyofilm yaşayan hücrelerde belirli analiz sağlar. Burada açıklanan örnekleme yöntemi numaraları canlı ve ölü hücrelerin yansıtır. Derin cepleri biyofilm oluşumu güçlü olduğu gibi ciddi periodontitis araştırma için kağıt Puan muhtemelen Curettes| tarafından değiştirilmesi gerekir. Örnekleme bu gibi durumlarda, mikrobiyal tüm spektrumu onların yüzey olarak yansıtmıyor kağıt noktası çok hızlı bir şekilde doymuş.

Önemi ile ilgili mevcut yöntemler:

Önerilen el yazması kağıt puan ile sağlıklı sulkus subgingival örnekleme standartlaştırmak için türünün ilk örneğidir. Diğer raporlar metal Curettes|35,36 kullanmak için sevk veya kağıt 37,38,39puan, ama örnekleme önce gerçekleşecek işlemler tarif değil böyle plak kontrolü, diş temizliği, diş yalıtım ve kurutma, işlemleri yanı sıra bu örnekleme tekniği ve zaman satırlarındaki yetersiz özellikleri neden.

İki önceki makaleler, kağıt noktaları kullanımı subgingival biyofilm örnekleme çocuk22,40yılında için tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu göstereceğiz. Onların tasarımı sayesinde, Curettes| sınırlı alanı ile sığ sulkus için çok büyük ve çok keskin ihale bileske epitel için. Epitel travmatik olmadan subgingival sulkus erişmek çok önemlidir. Bu şekilde, kanama üzerinden doğan önyargı önlenmiş olur. Böylece, ince ve yumuşak kağıt noktaları kullanımı bu alan için tercih edilir. Kağıt biyofilm kompozisyon ortodontik tedavi21,41sırasında değişiklikleri izlemek için fonksiyonel noktalarıdır. Bunlar ince ve sabit ortodontik aletleri unsurları arasında uyacak kadar esnek. Bu Curettes| gibi diğer örnekleme yöntemleri için büyük bir avantajdır. Atravmatik örnekleme Basitleştirilmiş ve küçük miktarlarda DNA'ın olası örnektir.

Gelecekteki uygulamalar:

Bu videoda yöntemi hastalıklı olmayan, erken, kalıcı diş üzerinde gösterdi. Ayrıca karışık veya olgun diş için uygulanabilir. Bazı uyarlamalar ile aynı iletişim kuralını takip ederek diş veya implantlar ve diş malzemeleri nedeniyle diğer niş gibi periodontally hastalıklı siteler örnek mümkündür. Çürük araştırma kök çürük üzerinde belirli çalışmalarda bu standart iletişim kuralı yarar. Bizim örnekleme video üzerinden en önemli ders standardizasyon kurallarının verileri karşılaştırılabilir, ne ve nasıl örnekleri ölçülür olursa olsun yapmak olduğunu.Gelecekteki video gösteriler klinik genel örnekleme alanında geliştirmek.

Sözlü biyofilm videoda gösterildiği gibi elde edilen klinik ve bilimsel araştırmalar için kullanılır. Bu vivo içinde yaklaşım vitro moleküler teknikleri Floresans in situ hibridizasyon ve confocal lazer mikroskobu15tarama gibi iyi bir ek temsil eder. NGS yöntemler, burada gösterildiği pyrosequencing tam microbiota analizini toplanan biyofilm için uygulanan olanak sağlar. Bazı bakteri türleri göreli zenginliği hesaplama tedaviler veya farklı hasta veya farklı tedaviler karşılaştırmak için kullanılabilir. Bir standart sıralama iletişim kuralı ve sıralaması analiz iş akışı ile birlikte daha önce elimizde40açıklanan, bu örnekleme yöntemi bir cins düzeye dizi analizi sağlar. Daha fazla "meta"-Bu videoda sunulan örnekleme protokol üzerinde tabanlı çalışmaları gibi metatranscriptomic veya metabolomic çalışmaları mümkündür.

Kritik adımlar:

Kirlenme kaçınarak kritik bir adımdır: steril aletlerin steril olmayan in vivo ortamda uygulanması gerekiyor. Tezgah ağzından aktarmak hızlı ve güvenli sandalye zaman çalışmaya katılanların olabildiğince kısa tutmak için deneyimli bir sınav tarafından yapılması gerekiyor. En kritik protokolündeki subgingival sulkus kağıt noktasına Atravmatik ekleme adımdır. Kaçınılması gereken bozulma bileske epitel ve kesinlikle kanama var. Kağıt noktaları ve depolama tüpleri eksojen DNA veya RNA ile kontamine değil için alınması gereken daha fazla bakım vardır. Depolama kendisi sonra da kritik bir adımdır. Örnekleri donmuş doğrudan, en iyi −80 ° C. gerekir Bu sıralama sonuçları tahrifat bakteriyel kompozisyon yazı örnekleme değişimler önler.

Disclosures

Yazarlar bu bilimsel video üretimi için ilgili hiçbir Çatışmaları rapor.

Acknowledgments

Yazarlar Joachim Theussl (merkezi tıbbi araştırma, tıbbi Graz Üniversitesi) ses yetenek olarak mükemmel teknik destek video prodüksiyon ve Monica Farrell (Araştırma yönetimi, tıbbi Graz Üniversitesi) için minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183, (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73, (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9, (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18, (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65, (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19, (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32, (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6, (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73, (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221, (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84, (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19, (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19, (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18, (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27, (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5, (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27, (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18, (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391, (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57, (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122, (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51, (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7, (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6, (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7, (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1, (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17, (4), 1209-1218 (2013).
Sağlıklı çocuklarda Microbiome analiz için sözlü biyofilm örnekleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter