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Immunology and Infection

用 MDCK-SIAT1 细胞 Microneutralization 法测定人血清中中和 (H3N2) 病毒的流感中和抗体反应

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

流感中和抗体与流感感染的保护相关。Microneutralization 测定检测人血清中和抗体, 通常用于流感人血清学。我们描述了一个 microneutralization 的方法, 使用 MDCK-SIAT1 细胞测量中和抗体滴的当代 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 病毒在流感疫苗接种或感染后。

Abstract

对流感病毒血 (HA) 的中和抗体被认为是与保护流感感染相关的主要免疫机制。Microneutralization (MN) 检测通常用于测量流感疫苗接种或感染后人血清中和抗体的反应。机达比犬肾脏 (MDCK) 细胞是常用的细胞基质的锰测定方法。然而, 目前循环 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 流感病毒已获得改变受体结合特异性。MDCK-SIAT1 细胞系增加α-26 唾液半乳糖基在表面上已证明提供改善感染和更忠实的复制比传统的 MDCK 细胞为这些当代 A (H3N2) 病毒。在这里, 我们描述了使用 MDCK-SIAT1 细胞的锰测定方法, 它已经被优化, 以量化中和抗体滴到这些当代 a (H3N2) 病毒。在本协议中, 含有中和抗体的热灭活血清首先依次稀释, 然后用 100 TCID50/流感病毒 A (H3N2) 细菌孵育, 使血清中的抗体与病毒结合。然后将 MDCK-SIAT1 细胞添加到病毒抗体混合物中, 在37° c 下孵育 18-20 h, 5% CO2 , 允许 (H3N2) 病毒感染 MDCK-SIAT1 细胞。在夜间孵化后, 用流感 A 核 (NP) 单克隆抗体的酶联免疫吸附试验 (ELISA) 对每一个井中的病毒数量进行固定和定量。中和抗体滴度被定义为最高的血清稀释的相互作用, 提供50% 抑制病毒传染性。

Introduction

流感病毒每年继续造成人类人口的发病率和死亡率。HA 是流感病毒的主要表面糖蛋白。中和抗体靶向 HA 是主要的免疫机制, 与流感感染的保护相关的1,2。血凝抑制 (HI) 和锰测定法是广泛用于检测流感病毒感染或疫苗接种后的人血清中抗体应答的两种方法3。高含量的检测方法可抑制红细胞的病毒血凝, 并被认为是一种替代性试验。与 HI 不同, 锰测定法可以直接测定人血清中的抗体水平, 从而消除细胞培养中的流感感染。MDCK 细胞常用于流感病毒分离和锰含量测定4。

流感病毒经常进行抗原漂移和转移, 获取 HA 蛋白的突变, 从而改变病毒的受体结合特异性。自2014年以来, 新的一组 (H3N2) 病毒出现并继续流传到本赛季。这些病毒大多数属于基因组 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a 基于 HA 蛋白质的系统进化分析。许多循环 3 c. 2 的病毒已经降低了 hemagglutinate 红细胞的能力, 因此不能用 hi 化验5来表征。中和测定必须用于测量这些病毒的抗体应答, 而不 hemagglutinate6。此外, 研究表明, 这些当代 a (H3N2) 病毒改变受体结合性能与早期 a (H3N2) 病毒, 并倾向于积累文化适应突变和多态性时, 传代在体外细胞区域性7,8,9。与传统的 MDCK 细胞相比, MDCK-SIAT1 是由 Matrosovich et al.开发的细胞系。通过α2,6-sialtransferase (SIAT1) 的 cDNA MDCK 细胞的稳定转染。这条细胞线表达了增加的α2,6-唾液半乳糖基和减少α2,3-唾液酸基的数量比父 MDCK 细胞10。与 MDCK 细胞11相比, MDCK-SIAT1 细胞已显示出改善 (H3N2) 病毒的隔离率。最近, 林et al.报告说, 对于新出现的 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a 人 a (H3N2) 流感病毒, 更忠实的病毒复制和更好的病毒传染, 当病毒被培养了在 MDCK-SIAT1 细胞线与 MDCK 细胞对比7。因此, MDCK-SIAT1 细胞更适合于锰测定, 以表征抗体对最近一组 (H3N2) 病毒的反应。

在这里, 我们描述了一个使用 MDCK-SIAT1 细胞的锰测定方法来测量当代 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 病毒在人类血清中的抗体应答。在这种方法中, 可以使用在卵或细胞中生长的病毒。含有中和抗体的热灭活血清先被连续稀释, 然后用 100 TCID50/甲型流感病毒 (H3N2) 进行孵育, 使血清中的抗体与病毒结合。然后将 MDCK-SIAT1 细胞添加到病毒抗体混合物中, 在37° c 下孵育 18-20 h, 5% CO2 , 允许 A (H3N2) 病毒感染 MDCK-SIAT1 细胞并进行复制。经过一夜的孵化, 该板块是固定和数量的病毒在每个井是量化的 ELISA 使用流感的一个 NP 单克隆抗体。NP 的检测表明病毒感染的存在和中和抗体的缺乏。中和抗体滴度被定义为最高的血清稀释的倒数, 提供了≥50% 抑制病毒传染性。

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Protocol

所有流感病毒都应按照微生物和生物医学实验室生物安全 (BMBL)12所界定的适当的生物安全水平要求 (BSL-2 或更高) 来处理。

1. 试剂和起动材料的制备

  1. 制备 MDCK-SIAT1 细胞和无菌细胞培养基
    1. 使用500毫升 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 制备具有高葡萄糖、10% v/v 热灭活胎牛血清 (FBS)、2毫米 l-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1毫克/毫升 G418 硫酸盐 (例如) 的MDCK-SIAT1 细胞培养基g-418), 100 U/毫升青霉素与100µg/毫升链霉素 (可选)。通过0.2 µM 孔径膜进行过滤消毒。添加 G418 硫酸盐, 以确保 MDCK-SIAT1 细胞的质粒稳定性。
    2. 准备MDCK-SIAT1单元格行。在162厘米2-组织培养瓶 (s) 含有30毫升的无菌细胞培养基, 种子烧瓶与 2-2.5 x 106 MDCK-SIAT1 细胞和孵化在37° c 5% CO2为2天;这将用于组织培养的传染性剂量 (TCID) 的测定和锰的化验。
      注: MDCK-SIAT1 细胞由德国马尔堡 Dr. m Matrosovich 提供,10。此单元格线也可以在商业上获得 (请参见材料表)。
  2. 使用500毫升 DMEM 高糖、0.3% 牛血清白蛋白 (BSA) 分数 V、100 U/毫升青霉素、100µg/毫升链霉素和 20 mM HEPES, 准备无菌病毒传播介质。通过0.2 µM 孔径膜进行过滤消毒。
  3. 准备 0.75% (v/v)豚鼠红细胞 (gpRBCs)在含有0.01 米 pbs 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中, pH 值为7.2。
  4. 使用 DMEM 高糖、1% 牛白蛋白 V (BSA)、100 U/毫升青霉素、100µg/毫升链霉素和20毫米 HEPES 制备无菌病毒稀释剂。用0.2 µm 孔径膜进行过滤消毒, 并为每种化验准备新鲜。
  5. 在 pbs (0.01 米 pbs, pH 7.2) 中制备80% 冷丙酮, 作为冷细胞固定剂。
  6. 使用 pbs (0.01 M pbs pH 7.2) 和 0.3% (v/v) tween-20 准备洗涤缓冲器。
  7. 使用 pbs (0.01 米 pbs、pH 7.2)、0.3% (v/v) tween-20 和5% 脱脂干奶制备抗体稀释剂。
  8. 使用流感一个 NP 小鼠单克隆抗体克隆 A1 和 A3 池作为主要抗体。用滴定法测定抗体稀释剂中的最佳浓度。
  9. 使用山羊 anti-mouse IgG 共轭的马萝卜过氧化物酶 (HRP) 作为二次抗体。用滴定法测定抗体稀释剂中的最佳浓度。
  10. 使用o-二胺基盐酸盐 (门诊) 在0.05 米磷酸酯溶液中制备过氧化物酶衬底, pH 值为5。在使用前立即溶解 1 capsule/100 毫升去离子 H2, 将0.05 米的磷酸氢盐缓冲液溶出1门诊片剂 (10 毫克)/20 毫升的磷酸酯缓冲液。
  11. 使用0.5 米的硫酸作为门诊停止解决方案。在化学罩中加入28毫升的18米硫酸库存到972毫升去离子 H2O。
  12. 人和动物血清的治疗
    1. 在测定前30分钟, 在56° c 的水浴中, 热钝化在锰化验中使用的人体血清。立即使用或在需要时, 将解冻的血清贮存在4° c 以下不超过24小时;如果需要更长的贮存期, 则将血清冷冻在-20 ° c 或更冷。
    2. 在分析前用受体破坏酶 (RDE) 和热灭活法对锰测定中使用的动物血清进行如下处理。
      1. 在37˚C 的水浴中解冻血清然后放在冰上。将1体积的动物血清样本与3卷的 RDE。孵育在37˚C 为 18-20 h。
      2. 热钝化 RDE 治疗的血清在56˚C 30 分钟. 添加6容量的 PBS, pH 7.2 每样品为最后 pre-dilution 1:10。如需要, 在4° c 贮存解冻血清, 不超过24小时;如果需要更长的贮存期, 则将血清冷冻在-20 ° c 或更冷。
        注: 动物血清中可能含有各种唾液酸糖, 可能与流感病毒有结合, 抑制流感特异抗 HA 抗体的结合。因此, 有必要 RDE 治疗所有动物血清前的锰化验, 以消除这些非特异性病毒 HA 粘合剂的血清样本。

2. MDCK-SIAT1 细胞培养的通过

注意: 所有细胞培养必须在生物安全柜中进行, 以防止污染。

  1. 醒酒细胞培养培养基从细胞单层在162厘米2烧瓶。通过用胰蛋白酶-EDTA 冲洗单层处理细胞。加入5毫升胰蛋白酶-EDTA 来覆盖细胞单层。孵育在37° c, 5% CO2直到单层分离 (5-10 分钟)。在每个装有 trypsinized 细胞的烧瓶中加入15毫升的 MDCK-SIAT1 细胞培养基, 吸管向上和向下分离成细胞。
  2. 使用例和台盼蓝来确定细胞计数和生存能力。种子细胞在新的162厘米2组织培养烧瓶含有30毫升的细胞培养基与 2-2. 5 x 106细胞/烧瓶和孵化在37° c 与 5% CO2为使用在 TCID 和锰化验中2天。种子细胞在 4-5 x 106细胞/烧瓶中孵育, 在37° c 与 5% CO2在病毒传播中使用2天。
    注意: 如果需要更短或更长的培养期, 可以调整播种密度。对于病毒传播, 细胞应达到超过 100% 70-100。对于组织培养感染剂量 (TCID) 和锰测定, 细胞应在 75-95% 70-100 (图 1)。

3. A (H3N2) 病毒在 MDCK-SIAT1 细胞中的传播

注: A (H3N2) 病毒可在 10-11 天老胚母鸡的卵, 根据标准协议3, 或 MDCK-SIAT1 细胞培养。MDCK-SIAT1 细胞应达到超过 100% 70-100 的病毒接种。病毒种子种群可以接种多种稀释的接种。接种稀释具有最好的收获 HA 和传染性, 可用于进一步的锰化验。

  1. 在162厘米2烧瓶中, 从细胞单层 (> 100% 70-100) 中取出细胞培养基。用15毫升无菌 0.01 M PBS, pH 7.2, 和醒酒两次冲洗单层。
  2. 标签1瓶作为控制, 并添加20毫升的病毒传播媒体。孵育烧瓶在37° c 与 5% CO2。离开这个瓶子不动, 并使用1天后的病毒传播比较。
  3. 将10毫升无菌病毒传播介质添加到烧瓶中, 并在37° c、5% CO2中孵育所有烧瓶。在室温下解冻一小瓶流感病毒, 然后放在冰上。用病毒传播介质稀释到目标稀释。
    注: 目标稀释可根据 HA 滴病毒类股进行调整。要准备一个1:1000 稀释的接种, 增加100µL 病毒到9.9 毫升的无菌病毒传播媒介。轻轻倒置, 去除1毫升1:100 稀释到9毫升的无菌病毒传播媒介, 轻轻倒置1:1000 稀释接种。在冰上的地方。
  4. 除去恒温箱中的所有烧瓶。从 MDCK-SIAT1 细胞的烧瓶中取出病毒传播介质, 并将每个烧瓶接种10毫升稀释病毒。孵育烧瓶在37° c, 5% CO2为 1 h, 旋转烧瓶每15分钟。
  5. 从烧瓶中取出5毫升的接种, 代之以15毫升病毒传播培养基, 其中含有1µg/毫升 TPCK-胰蛋白酶。孵育烧瓶 (s) 在37° c, 5% CO2为 16-18 h。
  6. 在夜间孵化后, 观察在100X 显微镜下的烧瓶, 并寻找病变效果 (CPE) 的细胞。从烧瓶中取出15-17 毫升病毒上清液, 并替换为 15-17 毫升的新鲜制备的病毒传播介质, 含有2µg/毫升 TPCK-胰蛋白酶。
  7. 孵育烧瓶在37° c, 5% CO2。监测单层的 CPE (与细胞控制瓶相比), 并定期检查 HA (每4小时) 与 0.75% gpRBC 直到收获。
    1. 设置 HA 96 井孔板。增加50µL 0.01 M PBS, pH 7.2 到井 A2-A12 和 B2-B12 (重复) 和井 H1-H12 为控制。
    2. 将100µL 的病毒上清液添加到 A1 和 A2, 通过 B1 和 A12 从 A1 和 B12 中进行2倍的连续稀释。在 A12 和 B12 混合后丢弃50µL。将50µL 0.75% gpRBCs 添加到行 A、B 和 H。
    3. 轻敲板, 室温孵育1小时。
      1. 在45°至60°角倾斜96井孔板, 确定病毒上清液的 HA。
      2. 阅读用于血凝的板;最高的稀释病毒, 达到完全血凝被认为是 HA 滴定终点的特定病毒。记录的最高病毒稀释的倒数与完全血凝作为病毒的 HA 效价。
        注: 在排 H (控制) 中的固定红细胞应开始 "运行", 并形成一个小水滴形状, 由于重力。等到红细胞在控制井中完成运行, 然后读取在病毒滴定井的 RBC 按钮。那些陈列 RBC 按钮和 "奔跑", 不达到血凝。找到最高的稀释病毒, 完全抑制血凝作为终点 HA 滴度的病毒。
  8. 当病毒培养高原的 ha 或病毒培养达到目标 ha (例如 > 16 口), 但在细胞单分子开始显示重要的 CPE 之前, 就会收获病毒。
    1. 离心病毒培养上清在 300 x g 为10分钟在4° c 对颗粒细胞残骸。将含有病毒的澄清上清液转移到一个干净的管子。分将病毒收获的上清液放入一次性无菌低温小瓶中, 并在-70 ° c 或更冷时立即冻结。
      注: 用于锰化验的病毒储存物应具有高传染性的效价和极小的缺陷颗粒。最低稀释的病毒库存达到 100 TCID50/50 µL 的锰测定是1:100。
      注: 在锰化验中使用的病毒储存不应解冻和解冻。

4. 病毒 TCID 的测定

  1. 1天: 病毒滴定
    1. 在室温下解冻一小瓶病毒, 并立即在冰上放置。
    2. 在两个不同的启动稀释上测试病毒:10-2和 10-3。将100µL 病毒添加到9.9 毫升的病毒稀释剂中, 10-2稀释。将1毫升的 10-2稀释液添加到9.0 毫升的病毒稀释剂中, 以 10-3稀释。
    3. 使用两个孔板 (板材1为 10-2稀释和板2为 10-3稀释), 增加100µL 病毒稀释剂对所有井除了1的专栏 96-井孔板材。
    4. 执行½log10稀释 (10-2, 10-2.5, 10-3,等)。添加146µL 的病毒开始稀释到所有井在1栏和转移46µL 串行从1栏到列 11 (图 2)。改变井之间的吸管技巧。混合柱11后, 丢弃46µL 稀释的提示。
    5. 使用列12作为单元格控件 (CC);它只含有病毒稀释剂。孵育1小时在37° c, 5% CO2.
  2. 1天: MDCK-SIAT1 细胞的制备
    注: MDCK-SIAT1 细胞单层应达到 75-95% 70-100 的 TCID 和锰含量测定。一个162厘米的2烧瓶在 95% 70-100 应产生足够的细胞种子〜 4-5 孔板。
    1. 用20毫升 PBS 洗涤 75-95% 汇合单层, 去除培养基中的 FBS。处理细胞如下。
      1. 用无菌 PBS 冲洗单层, 加入7毫升胰蛋白酶-EDTA 来覆盖细胞单层。放置烧瓶平坦, 孵育在37° c, 5% CO2 , 直到单层分离 (约 5-10 min)。在含有 trypsinized 细胞的每个烧瓶中加入7毫升的病毒稀释剂。
    2. 用病毒稀释剂清洗细胞去除 FBS。
      1. 轻轻吸管向上和向下分离的细胞。将电池转移至50毫升锥形管;用病毒稀释剂填充管。
      2. 离心机在 485 x g, 用于5分钟醒酒病毒稀释剂, 用新鲜50毫升病毒稀释剂代替, 用 485 x g 离心机, 5 分钟醒酒病毒稀释液, 用新鲜的病毒稀释液取代 (10 毫升/烧瓶) 重颗粒。
    3. 使用例和台盼蓝来确定细胞计数和生存能力。将病毒稀释剂的细胞浓度调整到 1.5 x 105细胞/毫升。
    4. 在孔板 (1.5 x 104细胞/井) 的每一个井中加入100µL 稀释的 MDCK-SIAT1 细胞, 并盖板。孵育在37° c, 5% CO2为 18-20 h。
  3. 2天: ELISA
    1. 细胞固定
      1. 从孔板中取出介质。用 PBS 的200µL 清洗每一个井。每井加300µL 冷80% 丙酮, 室温孵育10分钟, 取出定影液, 使板材晾干。
    2. elisa
      1. 主要抗体加法
        注意: 抗流感 A 型单克隆抗体应作为 ELISA 中的主要抗体过量使用。通过在锰中执行抗体滴定, 确定各主要抗体的最佳抗体稀释度。选择的主要抗体浓度超过和最好的信号的背景比。
        1. 在抗体稀释剂中稀释流感的单克隆抗体 (主要抗体) 到靶浓度 (例如将30µL 的主抗体加到30毫升的抗体稀释液中以达到目标稀释 1:1000)。
        2. 洗盘子3次, 用300µL 洗涤缓冲器。在每个井中加入100µL 稀释的初级抗体。室温孵育1小时。
      2. 二次抗体加法
        注意:山羊抗小鼠 IgG 与马萝卜过氧化物酶 (HRP) 结合使用, 应作为 ELISA 中的二级抗体。通过执行抗体滴定, 确定每一次抗体的最佳抗体稀释度。选择过量的二级抗体浓度, 并以最佳的信号为背景比。
        1. 在抗体稀释剂中, 将 anti-mouse 抗体 (二次抗体) 和靶向浓度 (例如, 在30毫升的抗体稀释液中加入7.5 µL), 将其稀释。
        2. 用300µL 洗涤缓冲器将盘子洗3次。在每个井中加入100µL 稀释的二级抗体。室温孵育1小时。
      3. 基材添加和板读
        1. 用300µL 洗涤缓冲器洗盘子5次, 并在无绒擦拭上轻拍。
        2. 在每口井中加入100µL 新制备的基底, 并在室温下孵育, 直至细胞控制井 < 0.2 的颜色发育饱和和光学密度 (OD)。
        3. 为所有井加100µL 的止回液。使用微分光光度计阅读 490 nm 的油井外径。
  4. TCID 50计算
    1. 计算单元格控件的中间 OD490 (列 12)。
    2. 考虑任何测试的 od490大于 CC 井的中间 od490的两倍为 "正";否则, 它被认为是 "否定的"。
    3. 使用簧片-明奇方法13计算病毒的 TCID50 。
      1. 确定每次稀释时的正面和负面的数量。
      2. 计算表 1中所示的 "累计正"、"累计负"、"比率" 和 "% 正数"。
      3. 使用以下方法计算稀释显示 > 50% 阳性与稀释显示 < 50% 阳性之间的 "比例距离":
        Equation 1
        注: ½原木稀释的校正系数为0.5。例如, 在表 1中: (80 − 50)/(80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. 通过将比例距离添加到稀释显示 > 50% 阳性, 来计算病毒 TCID50 。
        注意: 例如, 在表 2中, TCID50是 10-5 + (-0.25) = 10-5.25。注意这是每100µL (或 10-5.25/100 µL) 病毒的 TCID50 。
    4. 计算病毒稀释度。对于锰的化验, 稀释病毒到 200 TCID50/100 µL (相当于 100 TCID50/50 µL 每井)。
      注意: 在表 1中的示例中, 1 TCID50在100µL 中为 10-5.25 , 而实现 200 TCID50/100 µL 的稀释是基于计算的 1:891: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102.95 = 1/891

5. 用 MDCK-SIAT1 细胞进行锰含量测定

  1. 1天: 测试和控制血清准备和板材布局
    1. 在37° c 的水浴中解冻, 解冻后立即取出。分需要测试的血清量;至少需要10µL 的原始血清来测试一个单线态病毒。如果可能, 请重复测试血清。
    2. 在56° c 的水浴中, 热使人的血清在30分钟内失效, 如在步骤1.12.1。将血清放在冰岗热失活上, 将病毒稀释剂添加到血清中达到 1:10 pre-dilution。
    3. RDE 治疗和 pre-dilute 的动物血清到1:10 用于每1.12.2 的控制。
      注: 解冻和经处理的人和动物血清可贮存在4° c 不长于 24 h. 如果在化验前需要较长的贮存期, 应在-20 ° c 或更冷的时间内将血清冷冻保存。
    4. 要使用一种病毒进行测试, 请将100µL 1:10 稀释的血清添加到 A1 A10 (图 4) 的列中。将50µL 的病毒稀释剂添加到 B 到 H 行中, 但11和12列除外 (图 4)。从 a 到 h 行执行2倍的连续稀释, 并在 h 行上丢弃最后50µL (图 4)。
      注意: 当要测试多个病毒时, 可以在滴度管中稀释血清。血清的稀释, 为确定血清滴度的目的, 井 A 是 1:10, 井 B 1:20, 井 C 1:40, 井 D 1:80, 井 E 1:160, 井 F 1:320, 井 G 1:640, 井 H 1:1, 280 (图 4)。
    5. 对于病毒控制, 添加50µL 的病毒稀释剂到水井 A12, B12, C12 和 D12 (无血清)。对于细胞控制, 添加100µL 的病毒稀释剂到水井 E12, F12, G12 和 H12 (没有病毒, 没有血清)。
    6. 对于控制血清 (例如, 雪貂血清控制), 添加100µL 稀释控制血清到一列11和添加50µL 的病毒稀释剂 B11 H11。连续稀释。
    7. 盖板, 孵育在37° c, 5% CO2 , 直到准备好病毒添加。
  2. 1天: 病毒添加
    1. 将病毒稀释到 100 TCID50/50 µL 与病毒稀释剂。
    2. 将50µL 稀释的病毒添加到所有水井中, 除后滴定 (BT) 板上的11栏和单元控制井 E12、F12、G12 和 H12 在所有板块上 (图 4)。对于那些在11栏有控制血清的盘子, 将病毒添加到11栏。
    3. 后滴定 (BT)
      1. 在一组重复的盘子 (例如, 板1A 和 1B) 的11栏中加入 BT。在11栏的所有水井中加入50µL 的病毒稀释剂。在 100 TCID50/50 µL 向第一井 (A11) 添加50µL 病毒。移上下混合。
      2. 混合和转让50µL 到连续井执行2倍的串行稀释。改变井之间的吸管提示, 以避免病毒的结转。丢弃50µL 从井 H11。
      3. 将50µL 的病毒稀释剂添加到11栏, 将最后的容量增加到100µL. 轻敲盘子混合。
    4. 孵育板在37° c, 5% CO2为 1 h。
    5. 执行 MDCK-SIAT1 细胞加法在天1和 ELISA 在天2如描述在步骤4.2 和 4.3 (也描述在5.3 和 5.4)
  3. 1天: MDCK-SIAT1 细胞添加
    1. 如步骤4.2 所述, 准备 MDCK-SIAT1 单元。将100µL MDCK-SIAT1 单元格添加到 1.5 x 105单元格/mL 到每个井 (1.5 x 104单元格/井)。孵育板在37° c, 5% CO2为 18-20 h。
  4. 2天: ELISA
    1. 在夜间孵化后, 第二天, 修复80% 冷丙酮的细胞, 如步骤4.3 所述。
    2. 主要抗体加法
      1. 用300µL 洗涤缓冲器将盘子洗3次。将流感的 NP 单克隆抗体 (主抗体) 稀释到抗体稀释剂中滴定法测定的最佳浓度 (例如:将30µL 的主抗体加到30毫升的抗体稀释液中, 以达到稀释 1:1000) 的目的。
        注: 100 µL 的初级抗体是必需的每井。每盘需要10毫升。
      2. 在每个井中加入100µL 稀释的初级抗体。室温孵育1小时。
    3. 二次抗体加法
      1. 洗涤板3次与300µL 洗涤缓冲。稀释山羊抗鼠 IgG 抗体 (二次抗体) 与抗体稀释剂中的靶浓度 (如在目标1:4000 中添加7.5 µL 的二次抗体到30毫升抗体稀释液)。
        注: 100 µL 的二次抗体需要每96井。每盘需要10毫升。
      2. 在每个井中加入100µL 稀释的二级抗体。室温孵育1小时。
    4. 基材添加和板读
      1. 用300µL 洗涤缓冲液冲洗盘子5次, 并轻拍无绒擦拭。
      2. 在每口井中添加100µL 新制备的基板, 并在室温下孵育, 直到病毒控制井达到 od490 = 0.8-3, 并且单元控制在低背景 od490 < 0.2。
      3. 在所有水井上加100µL 的止回液。使用微分光光度计阅读 490 nm 的油井外径。
  5. 数据分析
    注: 每个板块分别测定锰的计算。
    1. 确定每个血清样品的中和抗体滴度。
      1. 使用以下等式计算每个板的50% 病毒中和的 OD490截止:
        Equation 2
        注: 这里 x = 50% 中和切断。对应于最高稀释量的相互血清稀释与 OD490少于50% 的截止 (50% 抑制) 被认为中和抗体滴度为那血清样品 (图 5)。
    2. 检查单元控制井是否有 od490 < 0.2, 病毒控制井具有 od490 = 0.8-3。
    3. 验证病毒感染性的每一个检测 (100x TCID50) 病毒 bt. bt 的可接受范围是50、100或 200 TCID。如果使用在步骤4.4.2 中定义的相同截止度, 则在 E11、F11、G11 中, BT 柱中最高的病毒稀释度应在井下。
      注: 血清阳性对照应给予滴在前几次试验中获得的2倍的值。负血清控制的 OD490应与病毒控制所观察到的一样。

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Representative Results

测定病毒种群的传染性是锰测定的第一步。图 2说明了用于确定病毒储存的 TCID50的版面布局。对于未知传染性的病毒种群, 病毒可以从多个 pre-dilutions 滴定, 例如 10-2和 10-3, 以便捕获最佳的滴定曲线来计算病毒的传染性。在锰测定中使用的病毒数量应标准化到 100 TCID50/井 (50 µL)。病毒储存的最小稀释量达到 100 TCID50/井是1:100。


图 3描述使用 MDCK-SIAT1 单元进行锰测定的关键步骤。热灭活血清是连续稀释 96-井板中所示, 在图 4。100 TCID50/50 µL 病毒, 然后添加到每个井。在 1 h 潜伏期后, 允许血清中的抗体与病毒结合, 每个井中添加100µL 1.5 x 105细胞/毫升 MDCK-SIAT1 细胞。为了获得最佳结果, MDCK-SIAT1 的单元格应为 TCID50和锰分析的 75-95% 70-100 (图 1)。然后在37° c、5% CO 2 中孵育 18-20 h.经过一夜的孵化, 每井的病毒数量检测和量化的流感一个 NP ELISA (图 3)。

每个井中的 OD 代表在含有中和抗体的连续稀释的血清中存在的 MDCK-SIAT1 细胞中病毒感染和复制的数量。它可以绘制反对血清稀释 (图 5)。达到50% 中和的最高血清稀释的倒数被认为是血清样品的抗体效价。图 5包含2例对 A/HongKong/4801/2014 a (H3N2) 3 c. 2 a 病毒和 post-influenza 疫苗接种的配对血清测试结果的示例。与患者 1 pre-vaccination 血清, 没有血清稀释抑制病毒感染 (图 5, 浅蓝色曲线), 因此被认为是阴性 (< 10)。相比之下, 该患者的 post-vaccination 血清抑制病毒复制, 表明疫苗诱导中和抗体。这种血清的第三稀释是最高稀释低于50% 的截止, 因此, 这个病人有一个 post-vaccination 的效价为 40 (图 5, 深蓝色曲线)。相比之下, 第二个患者 pre-vaccination 的血清中含有已存在的中和抗体, 其效价为320。接种后, 滴度增加到 > 1280。在这种情况下, 在 1:10 pre-dilution 的血清, 没有抗体结束滴度达到。血清应重新在较高的 pre-dilution, 以达到最终的效价。

Figure 1
图 1.MDCK-SIAT1 细胞培养.MDCK-SIAT1 细胞。(A) MDCK-SIAT1 汇合单层 (> 100% 70-100) 进行病毒接种;(B) 在日志阶段 MDCK-SIAT1 单元格, 其 75-95% 70-100 用于 TCID50和 MN 检测。

Figure 2
图 2.TCID 板布局.病毒传染性由 TCID50确定。病毒的股票是 pre-diluted 到 10-2, 然后串行稀释在½日志每稀释到 10-7 (列 1-11), 在8复制每稀释 (排 H)。列12用作单元格的唯一控件。TCID50的病毒储存可以使用芦苇-明奇方法计算。

Figure 3
图 3.用 MDCK-SIAT1 细胞进行锰测定的示意图.50µL 的热灭活血清是连续2倍稀释成96口井板。50µL 100 TCID50 A (H3N2) 病毒, 然后添加到每个井。板在37° c 下孵育1小时, 以允许病毒和抗体结合。然后在每个井中添加 1.5 x 104 MDCK-SIAT1 单元格。在37° c、5% CO2中孵育 18-20 h 的板。在夜间孵化后, 盘子被洗涤和固定, 每个井中的病毒数量是用流感 A NP 单克隆抗体的 ELISA 进行量化的。血清抗体滴是根据病毒控制和细胞控制所定义的切断来计算的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.锰测定板的布局.热灭活血清是 pre-diluted 在 1:10, 然后连续2倍稀释在 96-井板 1-10。病毒控制 (仅病毒和细胞, 没有血清) 和细胞控制 (仅细胞, 没有病毒和没有血清) 在专栏12。11栏用于背部滴定或控制血清。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5.用 MDCK-SIAT1 细胞对 A/HongKong/4801/2014 A (H3N2) 病毒进行了人血清的锰测定结果.用 MDCK-SIAT1 细胞对 A/HongKong/4801/2014 A (H3N2) 病毒进行了两例 post-2016-17 和季节性流感疫苗的血清检测。中和滴是最高的血清稀释的倒数, 达到50% 病毒中和, 由箭头在每条曲线表明。病人 1: pre-vaccination 效价 < 10, post-vaccination 效价 40;病人 2: pre-vaccination 效价 320, post-vaccination 效价 > 1280。

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Discussion

锰测定法是流感血清学中用于检测流感感染或疫苗接种后抗体应答的主要方法之一。由锰测定产生的滴常被用作许多流感血清研究的主要结果。锰测定法也广泛用于血清诊断和疫苗免疫原性评价。国际 inter-lab 的研究已经进行比较, 在多个实验室的锰化验结果14。

与 HI 相比, 锰测定法的目的是直接测量细胞培养中能中和病毒感染的功能性抗体。世界各地的野外实验室都有各种形式的锰测定方法。出的分析 (即, 减少在中和抗体存在下的病毒感染) 可以基于 ELISA 定量的病毒 NP 抗体, HA 定量的病毒, 或免疫染色的病毒斑块在每个井在细胞培养中存在抗体和潜伏期后感染病毒14,15。各种形式的 fluorescent-based 斑块还原中和试验 (例如, 聚焦还原法和 ViroSpot 测定) 通常用于大量流感病毒场分离株的抗原鉴定, 部分原因是低病毒这些化验所需的金额15,16。为了描述人类血清学中流感抗体的反应, 世界卫生组织 (世卫组织) 全球流感监测网络建议采用2天的 ELISA 法进行血清诊断, 以检测流感3。该方法也广泛应用于血清流行病学研究和流感疫苗接种后抗体应答的评估。它主要检测到流感 HA 表面蛋白的抗体, 因此可以检测功能性菌株特异抗体。

在这里, 我们描述了一个2天的 ELISA-based 锰测定, 利用 MDCK-SIAT1 细胞。这一方法的优化, 以检测中和抗体的当代 A (H3N2) 病毒的人血清。使用 MDCK-SIAT1 细胞进行锰含量测定时应考虑几个关键步骤。首先, MDCK-SIAT1 细胞应在含有 G418 硫酸盐的培养基中传代, 以维持人αSIAT1 cDNA 在细胞系中的稳定性。在使用 MDCK-SIAT1 细胞进行病毒传播和锰含量测定时, 介质中不需要 G418 硫酸盐 (例如, g-418)。在锰含量测定中使用的细胞应在记录生长阶段, 75-95% 70-100。其次, 良好的病毒储存是必要的, 以便进行成功的锰化验。病毒类股应具有高传染性, 由 TCID50滴定和最小数量的缺陷颗粒测量。病毒储存达到 100 TCID50/井病毒的最低稀释量应等于或大于1:100。虽然卵和细胞传代病毒都可以用于锰的检测, MDCK-SIAT1 细胞线保持更好的遗传稳定性, 传播 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 病毒7。在病毒传播后, 应对病毒种群的 HA 和 NA 基因进行测序, 以确保在关键抗原部位不引入任何卵细胞或细胞培养适应突变, 这可能会导致检测中使用的病毒的抗原性发生变化。第三, 每种化验中所使用的传染性病毒的数量应仔细滴定, 并在每种化验结果中加入一种反滴定法来验证。检测中使用的病毒过多可能会降低抗体的滴, 降低测定的灵敏度。同样, 检测中使用的病毒过少也会导致 VC 信号弱、背景 (CC) 和假阳性结果。因此, 重要的是要包括适当的阳性和阴性控制血清的检测, 以监测性能。当比较使用同一血清的多种病毒的抗体应答时, 确保所有病毒的背部滴定在一个可接受的范围内是至关重要的。

用 MDCK-SIAT1 细胞进行锰含量测定是灵敏的, 特异的检测抗体对当代 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a (H3N2) 流感病毒在人类血清中, 包括抗原漂移 a (H3N2) 病毒6。该方法已被用于评估接种的人血清面板 3 c. 2 a 和 3 c. 3 a a a (H3N2) 病毒在灭活流感疫苗接种以后5,17,18。然而, 如流感病毒继续获得突变, 可以改变抗原性和受体结合性质的病毒和引起抗原漂移, 需要不断努力, 以优化现有的流感血清学化验, 以保持新出现的流感病毒所需的敏感性和特异性。

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Disclosures

作者报告没有利益冲突。这份出版物的调查结果和结论是作者的, 不一定代表疾病控制和预防中心和资助机构的观点。

Acknowledgments

我们感谢 Dr. 绣花卢, Dr., 和 Ms. 从疾病预防控制中心的流感部门的阿什利。我们感谢 CDC 流感部门的 Dr. 利伯, 帮助他准备图 3的图形。最后, 我们感谢 Dr. m Matrosovich, 马尔堡, 德国提供 MDCK-SIAT1 细胞。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

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References

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用 MDCK-SIAT1 细胞 Microneutralization 法测定人血清中中和 (H3N2) 病毒的流感中和抗体反应
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