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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Abstract

Anticorpos neutralizantes contra a hemaglutinina (HA) de vírus da gripe são considerados o principal mecanismo imune que se correlaciona com proteção para infecções de gripe. Ensaios de Microneutralization (MN) são frequentemente usados para medir respostas de anticorpos neutralizantes em soros humanos após vacinação gripe ou infecção. Madine Darby Canine renal (MDCK) as células são o substrato de célula comumente utilizada para ensaios de MN. No entanto, atualmente circulam 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe adquiriram o vírus alterado especificidade de ligação do receptor. A linhagem de células MDCK-SIAT1 com metades de aumento α-2,6 siálico galactose na superfície provou para fornecer melhorada infecciosidade e replicações mais fiel do que células MDCK convencionais para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Aqui, descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 que foi otimizado para quantificar os anticorpos neutralizantes para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Neste protocolo, soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para vincular aos vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada bem é quantificada por um ensaio imunoenzimático (ELISA) usando antigripe uma cadeia (NP) os anticorpos monoclonais. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece ≥ 50% de inibição de infecciosidade do vírus.

Introduction

Vírus da gripe continuam a causar morbidade e mortalidade na população humana, a cada ano. HA é a glicoproteína de superfície principal de vírus da gripe. Anticorpos neutralizantes direcionamento HA são o principal mecanismo imune que se correlaciona com a proteção da gripe infecção1,2. Ensaios de inibição (HI) de hemaglutinação e ensaios de MN são dois métodos amplamente utilizados para medir respostas de anticorpos no soro humano após gripe infecção ou vacinação3. O ensaio de HI mede anticorpo da inibição da hemaglutinação vírus das células vermelhas do sangue e é considerado um ensaio de substituto. Ao contrário de HI, o ensaio de MN diretamente pode medir os níveis de anticorpos no soro humano que neutraliza a infecção da gripe em culturas de células. Células MDCK são frequentemente usadas no isolamento do vírus da gripe e MN ensaios4.

Vírus da gripe sofrem constantemente deriva antigênica e shift, adquirindo mutações em proteínas HA que podem alterar a especificidade de ligação do receptor do vírus. Desde 2014, novos grupos de A(H3N2) vírus emergiram e continuaram a circular até a temporada atual. A maioria destes vírus pertence ao grupo genético 3C.2a e 3C.3a com base na análise filogenética das proteínas HA. Muitos dos vírus circulantes 3C.2a tinham reduzido a capacidade de hemagglutinate células vermelhas do sangue e, portanto, não podem ser caracterizados por HI ensaios5. Ensaios de neutralização devem ser usados para medir as respostas de anticorpos para esses vírus que não hemagglutinate6. Além disso, estudos têm mostrado que estes vírus A(H3N2) contemporâneas alteraram as propriedades de ligação de receptores em comparação com anteriores A(H3N2) vírus e tendem a se acumular mutações cultura adaptada e polimorfismo quando passadas na cela em vitro culturas de8,7,9. Em comparação com células MDCK convencionais, MDCK-SIAT1 é uma linha de celular desenvolvida por Matrosovich et al . através do transfection estável de células MDCK com cDNA de α2 humano, 6-sialtransferase (SIAT1). Esta linha de célula expressa uma quantidade aumentada de α2, metades 6-siálico galactose e diminuição da quantidade de α2, partes de ácido siálico-3 do que o pai de células MDCK10. Células MDCK-SIAT1 mostraram-se para melhorar as taxas de isolamento de vírus A(H3N2) em relação ao de células MDCK11. Recentemente, Lin et al. relatou-se que para o novo 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe vírus humanos, replicações de vírus mais fiel e melhor infecciosidade do vírus foram alcançados quando vírus eram cultivadas em linhas de células MDCK-SIAT1 comparadas com o de células MDCK7. Assim, as células MDCK-SIAT1 são mais adequadas em ensaios de MN para caracterizar respostas de anticorpos para os clusters recentes do vírus A(H3N2).

Aqui descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 para medir respostas de anticorpos para 3C.2a contemporânea e vírus A(H3N2) 3C.3a em soros humanos. Vírus cultivados em células ou ovos podem ser usados neste ensaio. Soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para ligar ao vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que o A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1 e replicar. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada poço é quantificada por um ELISA usando os anticorpos monoclonais antigripe A NP. A detecção de NP indica a presença de infecção pelo vírus e a ausência de anticorpos neutralizantes. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece a inibição de 50% ≥ de infecciosidade do vírus.

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Protocol

Todos os vírus da gripe devem ser tratados de acordo com requisitos de nível de biossegurança adequado (BSL-2 ou superior) como definido na Biossegurança na microbiológicas e Biomedical Laboratories (BMBL)12.

1. preparação dos reagentes e matérias-primas

  1. Preparar células MDCK-SIAT1 e meio de cultura celular estéril
    1. Preparar o meio de cultura de células MDCK-SIAT1 usando de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) de 500 mL com glicose alta, inactivados por calor de v/v de 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, sulfato 1mg/mL G418 (por exemplo, Geneticin) e 100 U/ml penicilina com 100 estreptomicina µ g/mL (opcional). Esterilize por filtração através de uma membrana de tamanho de poro de 0,2 µM. G418 sulfato é adicionado para assegurar a estabilidade do plasmídeo nas células MDCK-SIAT1.
    2. Prepare a linhagem de células MDCK-SIAT1 . 162 cm2- flask(s) de cultura de tecidos contendo 30 mL de meios de cultura de células estéreis, frascos com 2 a 2,5 x 106 MDCK-SIAT1 células da semente e incubar a 37 ° C em 5% de CO2 por 2 dias; Este será utilizado para a determinação de dose infecciosa (TCID) cultura de tecidos e MN ensaios.
      Nota: Células MDCK-SIAT1 foram gentilmente cedidas pelo Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemanha10. Esta linha de celular também pode ser obtida comercialmente (consulte a Tabela de materiais).
  2. Prepare os meios de propagação de vírus estéril usando 500 mL de glicose alta DMEM, fração de albumina de soro bovino (BSA) de 0,3% V, 100 penicilina U/mL Estreptomicina 100 µ g/mL e 20 mM HEPES. Esterilize por filtração através de uma membrana de tamanho de poro de 0,2 µM.
  3. Prepare a 0,75% (v/v) cobaia células vermelhas do sangue (gpRBCs) em solução salina tamponada fosfato (PBS) contendo PBS de 0,01 M, pH 7,2.
  4. Prepare o diluente estéril vírus usando DMEM glicose alta, 1% V de fração de Albumina bovina (BSA), 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 µ g/mL e 20 mM HEPES. Esterilizar por filtração com uma membrana de tamanho de poro 0,2 µm e prepare-se fresco para cada ensaio.
  5. Prepare o fixador de cela fria como acetona gelada 80% em PBS (PBS de 0,01 M, pH 7,2).
  6. Preparar o tampão de lavagem usando PBS (pH 7,2 de 0,01 M PBS) e 0,3% (v/v) tween-20.
  7. Preparar o diluente de anticorpo usando PBS (PBS de 0,01 M, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 e 5% magro seco leite.
  8. Use antigripe A NP clone de anticorpo monoclonal de rato A1 e A3 piscina como o anticorpo primário. Diluído em diluente na concentração ideal, conforme determinado por titulação do anticorpo.
  9. Cabra de uso do anti-mouse IgG conjugado com peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) como o anticorpo secundário. Diluído em diluente na concentração ideal, conforme determinado por titulação do anticorpo.
  10. Prepare o substrato de peroxidase usando o- fenilenodiamina dicloridrato (OPD) em tampão de citrato fosfato 0,05 M pH 5. Preparar o tampão de citrato fosfato 0,05 M dissolvendo-se 1 cápsula/100 mL água deionizada H2O. dissolver OPD 1 comprimido (10 mg) / 20 mL de tampão de citrato fosfato imediatamente antes do uso.
  11. Usar 0,5 M de ácido sulfúrico como o OPD parar de solução. Adicione 28 mL de estoque de ácido sulfúrico de 18 M 972 mL água deionizada H2O numa vizinhança de química.
  12. Tratamento de soros humanos e animais
    1. Calor inactivate o soros humanos utilizados em ensaios os MN em um banho de água a 56 ° C durante 30 min antes do ensaio. Use imediatamente ou se necessário, armazenar sera descongelado a 4 ° C, para não mais de 24 h; Se houver necessidade de longo período de armazenamento, armazene soros congelados a-20 ° C ou mais frios.
    2. Tratar os soros de animais utilizados em ensaios de MN com Receptor destruindo enzima (RDE) e calor inativar antes do ensaio da seguinte forma.
      1. Descongelar o sera em um banho-maria 37 ˚ c, em seguida, coloque no gelo. Misturar 1 volume de amostra de soro animal com 3 volumes de RDE. Incube a 37 ˚ c por 18-20 h.
      2. Calor inactivate o sera RDE Tratado em 56 ˚ c por 30 min. Adicione 6 volumes de PBS, pH 7.2 para cada amostra para uma pre-diluição final de 01:10. Se necessário, armazenar sera descongelado a 4 ° C, para não mais de 24 h; Se houver necessidade de longo período de armazenamento, armazene soros congelados a-20 ° C ou mais frios.
        Nota: Soros de animais podem conter vários os glicanos de ácido siálico que podem ligar para o tem de vírus da gripe e inibe a ligação de gripe específicos anti-HA anticorpos. Portanto, é necessário para RDE tratar todos os soros animais antes dos ensaios de MN para remover estas pastas HA virais específico nas amostras de soro.

2. a passagem da cultura de células MDCK-SIAT1

Nota: Todas as culturas de célula devem ser executadas em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação.

  1. Decante o meio de cultura celular da monocamada de células em frascos de2 162 cm. Trypsinize as células enxaguando a monocamada com tripsina-EDTA. Adicione 5 mL do trypsin-EDTA para cobrir a monocamada de células. Incube a 37 ° C, 5% CO2 até a monocamada desanexa (5-10 min). Adicione 15 mL de meio de cultura de células MDCK-SIAT1 a cada balão contendo células trypsinized, pipeta para cima e para baixo celas separadas.
  2. Use um hemocytometer e trypan azul para determinar que a célula conta e viabilidade. As células em novos frascos de cultura de tecidos de2 162 cm contendo 30 mL de meio de cultura celular com 2 a 2,5 x 106 células /flask de sementes e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 dias para uso em ensaios TCID e MN. Células em 4-5 x 106 células/balão de sementes e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 2 dias para uso na propagação de vírus.
    Nota: A densidade de semeadura pode ser ajustada se períodos mais curtos ou mais longos de cultura são desejados. Para a propagação de vírus, células devem chegar a mais 100% confluência. Para os ensaios de cultura de tecidos infecção Dose (TCID) e MN, as células devem ser na confluência de 75-95% (Figura 1).

3. a propagação de vírus A(H3N2) nas células MDCK-SIAT1

Nota: A(H3N2) vírus podem ser propagado de qualquer dia de 10-11 em ovos de galinha embrionados velha de acordo com o protocolo padrão3, ou de células MDCK-SIAT1 culturas. Células MDCK-SIAT1 devem alcançar mais de 100% confluencia para inoculação do vírus. Reservas de sementes de vírus podem ser inoculadas com várias diluições do inóculo. As diluições do inóculo com a melhor colheita HA e infectividade podem ser usados para mais ensaios de MN.

  1. Remover o meio de cultura celular de monocamada a célula (> 100% confluência) em frascos de2 162 cm. Lave a monocamada duas vezes com 15 mL de PBS estéril de 0,01 M, pH 7,2 e decantar.
  2. 1 frasco como controle de rótulo e adicionar 20 mL de meios de propagação do vírus. Incube o frasco a 37 ° C com 5% de CO2. Deixe este frasco intocado e usar para comparação após dia 1 de propagação do vírus.
  3. Adicionar 10 mL de meios de propagação de vírus estéril para o flask(s) e incubar todas flask(s) a 37 ° C, 5% de CO2. Descongelar um frasco de estoque de vírus da gripe em temperatura ambiente, em seguida, coloque no gelo. Dilua com os meios de propagação de vírus para as diluições de alvo.
    Nota: Alvo diluições podem ser ajustadas baseado no HA uma concentração de reservas de vírus. Para preparar um 1: 1000 diluído inóculo, adicionar 100 µ l de vírus a 9,9 mL de meios de propagação de vírus estéril. Inverter suavemente, retire 1 mL da diluição de 1: 100 para 9 mL de meios de propagação de vírus estéril, inverter suavemente para um inóculo de 1: 1000 diluído. Coloque no gelo.
  4. Remova todos os frascos exceto balão de controle da incubadora. Remover os meios de propagação do vírus da flask(s) de células MDCK-SIAT1 e inocular cada frasco com 10 mL de vírus diluído. Incube os frascos a 37 ° C, 5% de CO2 para 1 h, girando o flask(s) a cada 15 min.
  5. Retire o flask(s) de 5 mL de inóculo e substitua por meios de propagação de vírus 15 mL contendo 1 µ g/mL TPCK-tripsina. Incube a flask(s) a 37 ° C, 5% de CO2 para 16-18 h.
  6. Após a incubação durante a noite, observar o flask(s) sob 100 X ampliação do microscópio e procurar efeitos citopático (CPE) nas células. Remova o flask(s) 15-17 mL do sobrenadante de vírus e substitua por 15-17 mL de meios de propagação de vírus recentemente preparada com 2 µ g/mL TPCK-tripsina.
  7. Incube os frascos a 37 ° C, 5% de CO2. Monitorar o CPE da monocamada (em comparação com o balão de controle da célula) e verificar o HA periodicamente (a cada 4 h) com gpRBC de 0,75% da colheita.
    1. Configure uma placa de microtitulação 96 HA. Adicionar 50 µ l de PBS 0,01 M, pH 7,2 a poços A2 - A12 e B2 - B12 (duplicatas) e poços H1 - H12 para controle.
    2. Adicionar 100 µ l do sobrenadante de vírus para A1 e A2, realizar uma diluição serial 2 vezes de A1 e B1 a A12 e B12. Descarte de 50 µ l após a mistura em A12 e B12. Adicionar 50 µ l de gpRBCs de 0,75% para as linhas A, B e H.
    3. Toque a placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      1. Determine HA de vírus sobrenadante pela inclinação da placa de 96 poços da microplaca um 45 ° de ângulo de 60°.
      2. Ler as placas para hemaglutinação; a maior diluição do vírus que atinge a completa hemaglutinação é considerada o ponto final de titulação HA para o vírus específico. Recorde a recíproca da maior vírus diluição com hemaglutinação completa como o HA sendo o título do vírus.
        Nota: As hemácias se estabeleceram na linha H (controles) devem começar a "correr" e uma forma de pequena lágrima devido à gravidade. Esperar até hemácias em controle de poços terminar executando, em seguida, ler os botões de RBC no vírus poços de titulação. Aqueles que apresentam botões RBC e "correr", não alcançar a hemaglutinação. Localize a maior diluição do vírus que inibem completamente hemaglutinação como o ponto final HA sendo o título do vírus.
  8. Recolher o vírus quando o HA de cultura de vírus platôs ou a cultura de vírus atinge o alvo HA (por exemplo, > 16 HAU), mas antes da célula monocamada começa a exibir CPE significativa.
    1. Centrifugar a cultura de vírus sobrenadante a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C e os restos celulares de Pelotas. Transferi o sobrenadante clarificado contendo a colheita de vírus para um tubo limpo. Alíquota do sobrenadante contendo o vírus colheita dentro dos frascos criogênicos estéril de uso único e congelar imediatamente a-70 ° C ou mais frio.
      Nota: As reservas de vírus usadas para os ensaios de MN devem ter alta concentração infecciosa e mínimas partículas defeituosas. A diluição mínima de reservas de vírus para atingir 100 µ l de TCID5050 para ensaio de MN é de 1: 100.
      Nota: As reservas de vírus usadas em ensaios os MN não devem ser descongeladas e recongeladas.

4. determinação de TCID do vírus

  1. Dia 1: Titulação do vírus
    1. Descongelar um frasco de vírus à temperatura ambiente e coloque imediatamente no gelo.
    2. Testar o vírus em duas diferentes diluições de partida: 10-2 e 10-3. Adicione 100 µ l de vírus a 9,9 mL de diluente para 10-2 de diluição de vírus. Adicione 1 mL de 10-2 diluição a 9,0 mL de diluente para a 10-3 de diluição de vírus.
    3. Usando dois microtiter placas (1 para 10-2 diluição) e chapa 2 para a 10-3 diluição, adicionar 100 µ l de diluente de vírus para todos os poços exceto coluna 1 da placa de 96 poços da microplaca.
    4. Realize diluições de10 ½log (10-2, 10-2.5, 10-3, etc.). Adicionar 146 µ l do vírus começando a diluição de todos os poços na coluna 1 e transferir 46 µ l em série da coluna 1 pela coluna 11 (Figura 2). Pontas de pipetas de mudança entre poços. Após a mistura coluna 11, elimine as pontas com a diluição de 46 µ l.
    5. Use a coluna 12 como a célula controle (CC); Ela contém apenas o diluente de vírus. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
  2. Dia 1: Preparação de células MDCK-SIAT1
    Nota: A monocamada de células MDCK-SIAT1 deve alcançar confluência de 75-95% para ensaios TCID e MN. Um frasco de 162 cm2 a confluência de 95% deve produzir células suficientes para semente ~ 4-5 placas de microtitulação.
    1. Lave a monocamada confluente de 75-95% com 20 mL de PBS para remover o FBS nos meios de cultura. As células Trypsinize da seguinte forma.
      1. Enxágue a monocamada com PBS estéril, adicionar 7 mL do trypsin-EDTA para cobrir a monocamada de células. Colocar o balão liso e incubar a 37 ° C, 5% CO2 até a monocamada desanexa (aproximadamente 5-10 min). Adicione 7 mL de diluente de vírus a cada balão que contém as células trypsinized.
    2. Lave as células com diluente de vírus para remover o FBS.
      1. Delicadamente Pipete para cima e para baixo para separar as células. Transferir as células para um tubo cónico de 50 mL; Encha o tubo com diluente de vírus.
      2. Centrifugar a 485 x g durante 5 min. decantar o diluente de vírus, substitua com diluente de vírus fresco 50 mL e centrifugar a 485 x g, durante 5 min. decantar o diluente de vírus e diluente de vírus fresco (10 mL/frasco) para Ressuspender o precipitado.
    3. Use um hemocytometer e trypan azul para determinar a contagem de células e a viabilidade. Ajuste a concentração de células com o vírus diluente para 1,5 x 105 células/mL.
    4. Adicione 100 µ l de diluídos células MDCK-SIAT1 a cada poço das placas de microtitulação (1,5 x 104 células/poço) e cobrir as placas. Incube a 37 ° C, 5% de CO2 para 18-20 h.
  3. Dia 2: ELISA
    1. Fixação de células
      1. Remova o meio das placas de microtitulação. Cada um Lave bem com 200 µ l de PBS. Adicionar 300 µ l frio 80% de acetona em cada poço e incubar a temperatura ambiente por 10 min. Retire o fixador e permitir que as placas para o ar seco.
    2. ELISA
      1. Adição de anticorpo primário
        Nota: Anticorpo monoclonal de anti-influenza A NP deve ser usado em excesso como o anticorpo primário em ELISA. Determine a diluição de anticorpo para cada lote de anticorpos primários, realizando as titulações de anticorpos em MN. Selecione a concentração do anticorpo primário que é em excesso e com o melhor sinal à relação de fundo.
        1. Diluir o anticorpo monoclonal antigripe A NP (anticorpo primário) para a concentração alvo em diluente o anticorpo (por exemplo, Adicionar 30 µ l de anticorpo primário a 30 mL de diluente para uma diluição de 1: 1000 de alvo do anticorpo).
        2. Lave a placa 3 vezes com 300 µ l de tampão de lavagem. Adicione o anticorpo primário diluídos de 100 µ l a cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
      2. Adição de anticorpo secundário
        Nota: Cabra anti-mouse IgG conjugada com rabanete de cavalo peroxidase (HRP) deve ser usado em excesso como o anticorpo secundário em ELISA. Determine a diluição de anticorpo para cada lote de anticorpos secundários realizando titulações de anticorpos. Selecione a concentração do anticorpo secundário em excesso e com o melhor sinal à relação de fundo.
        1. Dilua o anti-mouse de cabra IgG conjugada com anticorpo HRP (anticorpo secundário) para a concentração alvo em diluente o anticorpo (por exemplo, adicionar 7,5 µ l de anticorpo secundário a 30 mL de diluente para uma diluição de 1:4000 alvo de anticorpo).
        2. Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem 300 µ l. Adicione o anticorpo secundário diluído de 100 µ l de cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
      3. Adição do substrato e leitura de placa
        1. Lave as placas 5 vezes com 300 µ l lavagem buffer e torneira em uma limpeza de fiapos.
        2. Adicione 100 µ l de substrato recentemente preparado a cada poço e incubar a temperatura ambiente até o desenvolvimento de cor satura e a densidade óptica (OD) de poços de controle do celular < 0.2.
        3. Adicione 100 µ l de solução de paragem para todos os poços. Leia o D.O. de poços a 490 nm, utilizando um Espectrofotômetro de microplacas.
  4. Cálculo de TCID 50
    1. Calcule a mediana de OD490 dos controles de célula (coluna 12).
    2. Considerar qualquer teste bem com um OD490 superior a duas vezes a mediana OD490 dos poços CC como "positivo"; caso contrário, considera-se "negativo".
    3. Calcule a TCID50 do vírus usando o método de Reed-Muench13.
      1. Determine o número de pontos positivos e negativos para cada diluição.
      2. Calcule o "positivo cumulativo", "Cumulativa negativa", "Relação" e "% positiva" como ilustrado na tabela 1.
      3. Calcular a distância"proporcional" entre a exibição de diluição > 50% positivos e apresentando a diluição < 50% positivos usando o seguinte:
        Equation 1
        Nota: O fator de correção para a diluição de log ½ é 0,5. Por exemplo, na tabela 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0,5 = 0,25
      4. Calcule o vírus TCID50 adicionando a distância proporcional a diluição mostrando > 50% positivo.
        Nota: por exemplo, na tabela 2, TCID50 é 10-5+(-0.25) = 10-5.25. Nota que este é o TCID50 do vírus por 100 µ l (ou 10 µ l de-5.25100).
    4. Calcule a diluição de vírus. Para os ensaios de MN, dilua o vírus para 200 TCID50100 µ l (equivalente a 100 µ l de TCID5050 por alvéolo).
      Nota: No exemplo da tabela 1, 1 TCID50 10-5.25 em 100 µ l, e a diluição para atingir 200 TCID50100 µ l é 1:891 com base nos cálculos: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102.95 = 1 / 891

5. MN ensaio usando células MDCK-SIAT1

  1. Dia 1: Teste e controle de soros preparação e placa layout
    1. Descongelar o sera em banho-maria a 37 ° C e remover imediatamente após o descongelamento. Alíquota a quantidade de soro que precisam ser testados; um mínimo de 10 µ l do soro original é necessária para testar com um vírus no singlet. Teste soros em duplicatas, se possível.
    2. Calor inactivar os soros humanos por 30 min em um banho de água de 56 ° C como na etapa 1.12.1. Soros de lugar no gelo postar inactivação de calor, adicione o diluente de vírus para soros a alcançar um 01:10 pré-diluição.
    3. RDE tratar e pre-diluir soros de animais a 01:10 para usar controles por 1.12.2.
      Nota: Descongelados e tratados soros humanos e animais podem ser armazenados a 4 ° C por não mais do que 24 h. Sera deve ser armazenado congelado a-20 ° C ou mais frio se mais longo período de armazenamento é necessária antes do ensaio.
    4. Para testar com um vírus, adicionar 100 µ l 01:10 diluído soros a colunas de A1 a A10 (Figura 4). Adicione 50 µ l de diluente de vírus para linhas B a H, exceto colunas 11 e 12 (Figura 4). Realizar uma diluição serial 2 vezes de linhas de À H e descartar a última 50 μL na coluna H (Figura 4).
      Nota: Quando vários vírus estão a ser testado, soros podem ser diluídos em tubos de titulação. A diluição do soro, para a finalidade de determinar a concentração de soro, no bem A é 01:10, bem B 01:20, bem C 01:40, bem 1:80 de D, bem E 1:160, bem F 1:320, bem 1:640 de G, bem H 1:1,280 (Figura 4).
    5. Para o controle de vírus, adicionar 50 μL de diluente de vírus poços A12, B12, C12 e D12 (sem soro). Para o controle de célula, adicionar 100 µ l de diluente de vírus poços E12, F12, G12 e H12 (nenhum vírus, não sera).
    6. Para os soros de controlo (por exemplo, controles de soros de furão), adicione 100 µ l do soro controle diluído bem uma coluna 11 e adicionar 50 µ l de diluente de vírus para poços B11 - H11. Série diluído para baixo.
    7. Cobrir as placas, incubar a 37 ° C, 5% CO2 até que esteja pronto para a adição de vírus.
  2. Dia 1: Adição de vírus
    1. Dilua o vírus a 100 TCID5050 µ l com diluente de vírus.
    2. Adicione vírus diluído de 50 µ l de todos os poços, excepto a coluna 11 sobre as placas traseiras titulação (BT) e poços de controle a célula E12, F12, G12 e H12 em todas as placas (Figura 4). Para as chapas com soros de controlo na coluna 11, adicione vírus a coluna 11.
    3. Volta a titulação (BT)
      1. Inclua um BT na coluna 11 de um conjunto de placas duplicadas (por exemplo, placa 1A e 1B). Adicione 50 µ l de diluente de vírus para todos os poços na coluna 11. Adicione 50 µ l do vírus em 100 TCID5050 µ l para o primeiro poço (A11). Misture pipetando para cima e para baixo.
      2. Misturar e transferir 50 µ l de sucessivos poços para executar 2 vezes diluições em série. Altere as pontas de pipeta entre poços para evitar transferência do vírus. Descarte de 50 µ l de H11 bem.
      3. Adicione 50 µ l de diluente para coluna 11 para trazer o volume final de 100 µ l. vírus toque as placas para misturar.
    4. Incube as placas a 37 ° C, 5% de CO2 por 1h.
    5. Realizar adição de células MDCK-SIAT1 no dia 1 e ELISA no dia 2, como descrito nos passos 4.2 e 4.3 (também descrito em 5.3 e 5.4)
  3. Dia 1: Adição de células MDCK-SIAT1
    1. Prepare as células MDCK-SIAT1, conforme descrito na etapa 4.2. Adicione 100 células MDCK-SIAT1 de µ l em 1.5 x 105 células/mL para cada poço (1,5 x 104 células/poço). Incube as placas a 37 ° C, 5% de CO2 para 18-20 h.
  4. Dia 2: ELISA
    1. Após a incubação durante a noite, no segundo dia, corrigi as células com acetona gelada 80% conforme descrito na etapa 4.3.
    2. Adição de anticorpo primário
      1. Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem 300 µ l. Diluir o anticorpo monoclonal antigripe A NP (anticorpo primário) a concentração óptima conforme determinado por titulação em diluente de anticorpo (por exemplo, Adicionar 30 µ l de anticorpo primário a 30 mL de diluente para uma diluição de 1: 1000 de alvo do anticorpo).
        Nota: 100 µ l de anticorpo primário é necessário por bem. ~ 10 mL é necessária por placa.
      2. Adicione o anticorpo primário diluídos de 100 µ l a cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
    3. Adição de anticorpo secundário
      1. Lave a placa 3 vezes com tampão de lavagem 300 µ l. Diluir a cabra anti-mouse IgG conjugada com anticorpo HRP (anticorpo secundário) para a concentração alvo no diluente de anticorpo (por exemplo, adicionar 7,5 µ l de anticorpo secundário a 30 mL de diluente para um alvo 1:4000 anticorpo.)
        Nota: 100 µ l de anticorpo secundário é necessária por 96 bem. ~ 10 mL é necessária por placa.
      2. Adicione o anticorpo secundário diluído de 100 µ l de cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Adição do substrato e leitura de placa
      1. Lave as placas 5 vezes com 300 µ l lavagem buffer e torneira na limpeza de fiapos.
      2. Adicione 100 µ l de substrato recentemente preparado a cada poço e incubar a temperatura ambiente até os poços de controle do vírus atinjam um OD490 = 0,8 - 3, com o controle de célula em uma baixa de fundo OD490 < 0.2.
      3. Adicione 100 µ l da solução de paragem para todos os poços. Leia o D.O. de poços a 490 nm, utilizando um Espectrofotômetro de microplacas.
  5. Análise de dados
    Nota: Os cálculos de MN são determinados por cada placa individualmente.
    1. Determine o título de anticorpos neutralizantes de cada amostra de soro.
      1. Calcule o limite de490 OD de neutralização de vírus de 50% para cada placa, usando a seguinte equação:
        Equation 2
        Nota: Aqui x = 50% de recorte neutralização. A diluição do soro recíproca correspondente à maior diluição com OD490 menos de 50% de recorte (≥ 50% inibição) é considerado o título de anticorpos de neutralização para aquela amostra de soro (Figura 5).
    2. Verifique se os poços de controle do celular tem uma OD490 < 0.2 e poços de controle do vírus tem uma OD490 = 0,8 - 3.
    3. Verifique se a infectividade do vírus em cada ensaio (100 x TCID50) pelo vírus BT o intervalo aceitável de BT 50, 100 ou 200 TCID. Se usando o mesmo corte, conforme definido na etapa 4.4.2, a maior diluição do vírus na coluna BT com OD acima o corte deve ser em poços E11, F11, G11.
      Nota: Os controles de soro positivo devem dar títulos dentro de 2 dobras dos valores obtidos nos testes anteriores. O OD490 do controle negativo soro deve ser semelhante à observada para o controle de vírus.

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Representative Results

Determinação da infectividade das populações de vírus é o primeiro passo no ensaio de MN. A Figura 2 ilustra o layout da placa para determinar a TCID50 das populações de vírus. Para reservas de vírus com infecciosidade desconhecida, o vírus pode ser titulado de várias pre-diluições, por exemplo 10-2 e 10-3, a fim de capturar a melhor curva de titulação para calcular a infectividade do vírus. A quantidade de vírus utilizada no ensaio de MN deve ser padronizada para 100 TCID50pois (50 µ l). A diluição mínima de reservas de vírus para atingir 100 TCID50/bem é de 1: 100.


A Figura 3 descreve as etapas críticas de um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1. Calor-inativado soros são serial-diluído em placas de 96 poços conforme ilustrado na Figura 4. 100 vírus de µ l TCID5050 é adicionado a cada poço. Após incubação de 1 h para permitir que o anticorpo no soro bind para o vírus, 100 µ l de 1,5 x 105 células/mL de células MDCK-SIAT1 são adicionados a cada poço. Para obter melhores resultados, células MDCK-SIAT1 devem estar na confluência de 75-95% (Figura 1) para o TCID50 e ensaios de MN. As placas são incubadas em seguida por 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2. Após a incubação durante a noite, a quantidade de vírus em cada poço é detectada e quantificada por um antigripe A NP ELISA (Figura 3).

O OD em cada bem representa a quantidade de vírus infecção e replicação em células MDCK-SIAT1 na presença de soros serialmente diluídas contendo anticorpos neutralizantes. Ele pode ser plotado contra as diluições do soro (Figura 5). A recíproca da maior diluição do soro que alcançado ≥ 50% neutralização é considerada o título de anticorpos para a amostra de soro. Figura 5 contém exemplos de resultados de 2 pacientes com soros pareados testados contra A/Hong Kong/4801/2014 A(H3N2) 3C.2a vírus pré e pós gripe vacinação. Com soros de pré-vacinação paciente 1, nenhuma das diluições do soro inibiu a infecção pelo vírus (Figura 5, curva de luz azul) e, portanto, é considerado negativo (< 10). Em contraste, pós-vacinação soros deste paciente inibiam a replicação do vírus, indicando a vacinação induzida por anticorpos neutralizantes. A terceira diluição deste sera é a maior diluição abaixo o limite de 50%, assim, o paciente tem um título de pós-vacinação 40 (Figura 5, curva azul escura). Em comparação, o soro de pré-vacinação segundo paciente contém pré-existente, neutralizando anticorpos em um título de 320. Após a vacinação, o título aumentado para > 1.280. Neste caso, em um 01:10 pré-diluição do soro, nenhum título final de anticorpos foi alcançado. O soro deve ser re-testado a uma maior pre-diluição de para alcançar o título final.

Figure 1
Figura 1 . Cultura de células MDCK-SIAT1. Células MDCK-SIAT1. (A) monocamada confluente MDCK-SIAT1 (> 100% confluência) para inoculação do vírus; (B) MDCK-SIAT1 células em fase de registro com a confluência de 75-95% para TCID50 e ensaios de MN.

Figure 2
Figura 2 . Layout de placa TCID. Infecciosidade do vírus é determinada pelo TCID50. Estoque de vírus é previamente diluída a 10-2e em seguida serialmente diluída em um log ½ por diluição de 10-7 (coluna 1-11), em 8 repetições por diluição (linha A -H). Coluna 12 é usada como o controle de célula única. TCID50 da unidade populacional de vírus pode ser calculado usando o método de Reed-Muench.

Figure 3
Figura 3 . Esquemático do ensaio MN usando células MDCK-SIAT1. 50 µ l de soro inativado de calor 2 dobras em série são diluídos em placas de 96 poços. 50 µ l de 100 TCID50 do A(H3N2) vírus são adicionados a cada poço. As placas são incubadas a 37 ° C por 1 h permitir a ligação do vírus e anticorpos. Em seguida, 1.5 x 104 MDCK-SIAT1 células são adicionados a cada poço. As placas são incubadas durante 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2. Após a incubação durante a noite, as placas são lavadas e fixo, a quantidade de vírus em cada poço é quantificada por um ELISA usando os anticorpos monoclonais antigripe A NP. Anticorpos de soros são calculados com base em cortes definidos pelo vírus controles e controles de célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . O layout de placa de ensaio de MN. Soros inactivadas pelo calor são pre-diluídos em 01:10, então 2 dobras serialmente diluída em placas de 96 poços na coluna 1-10. Controles de vírus (vírus e células apenas, sem soro) e célula (células apenas, sem vírus e sem soro) estão na coluna 12. Coluna 11 é usada para trás soros de titulação ou controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Os resultados de ensaio de MN de soros humanos testados contra vírus A/Hong Kong/4801/2014 A(H3N2) usando células MDCK-SIAT1. Os soros de vacinação de gripe sazonal pré e post-2016-17 dois pacientes foram testados contra vírus A/Hong Kong/4801/2014 A(H3N2) usando células MDCK-SIAT1. Títulos de neutralização são a recíproca da maior diluição do soro que atinge a neutralização de vírus ≥ 50%, conforme indicado pelas setas em cada curva. Paciente 1: pré-vacinação título < 10, sendo o título de pós-vacinação 40; paciente 2:pre-título de vacinação 320, pós-vacinação título > 1.280.

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Discussion

O ensaio de MN é um dos principais ensaios utilizados para sorologia de gripe para detectar respostas de anticorpos após a infecção da gripe ou vacinação. Títulos gerados a partir de ensaios de MN são usados frequentemente como o resultado primário de muitos estudos de gripe hematológicas. Ensaios de MN são também amplamente utilizados para sero-diagnóstico e avaliação da imunogenicidade da vacina. Internacionais interlaboratório estudos têm sido realizados para comparar os ensaios de MN, realizados em vários laboratórios14.

Em contraste com HI, o ensaio de MN é projetado para medir diretamente anticorpos funcionais que podem neutralizar a infecção do vírus em cultura de células. Existem várias formas de ensaios de MN usados em laboratórios de campo em todo o mundo. A leitura dos ensaios (ou seja, redução de infecciosidade do vírus na presença de anticorpos neutralizantes) pode basear-se na quantificação de ELISA de anticorpos de vírus NP, HA quantificação do vírus, ou imuno-coloração de placas de vírus em cada poço após a infecção do vírus na presença de anticorpos e incubação em culturas de células14,15. Várias formas de ensaios de neutralização de redução de placa fluorescente-baseado (por exemplo, foco redução de ensaios e ensaios de ViroSpot) são frequentemente utilizadas para caracterização antigênica de um grande número de isolados de campo de vírus da gripe, em parte devido ao vírus de baixo quantidade necessária nestes ensaios15,16. Para a caracterização das respostas de anticorpos à gripe em sorologia humana, o ELISA de 2 dias com base MN ensaio é recomendado pela rede de vigilância global da gripe da Organização Mundial de saúde (OMS) para diagnóstico sorológico de gripe3. Este método é também amplamente utilizado em estudos de sero-epidemiologia e a avaliação das respostas de anticorpos após a vacinação de gripe. Principalmente detecta anticorpos para a proteína HA da gripe e, portanto, pode detectar anticorpos funcionais de estirpe específica.

Aqui, descrevemos um ensaio de ELISA-baseado MN que utiliza células MDCK-SIAT1 2 dias. Este ensaio é otimizado para detectar anticorpos neutralizantes para contemporânea A(H3N2) vírus em soros humanos. Vários passos críticos devem ser considerados quando realizar MN ensaios usando células MDCK-SIAT1. Em primeiro lugar, células MDCK-SIAT1 devem ser passadas em meios de cultura contendo sulfato de G418 para manter a estabilidade do cDNA humano αSIAT1 em linhagem celular. Sulfato de G418 (por exemplo, geneticin) não é necessário nos meios de comunicação durante a propagação de vírus e MN ensaios usando células MDCK-SIAT1. As células utilizadas em ensaios de MN devem estar em fase de crescimento log com a confluência de 75-95%. Reservas de vírus segundo, bom são essenciais para realizar ensaios de MN sucesso. Reservas de vírus devem ter alta infectividade, medido por TCID50 titulação e uma quantidade mínima de partículas com defeito. A diluição mínima de reservas de vírus para atingir 100 TCID50/bem vírus deve ser igual ou maior que 1: 100. Apesar de tanto ovo e célula passado vírus podem ser usados em ensaios de MN, linha de células MDCK-SIAT1 mantém melhor estabilidade genética para a propagação de vírus A(H3N2) 3C.2a e 3C.3a7. Após a propagação de vírus, os genes HA e das reservas de vírus devem ser sequenciados para não garantir que nenhuma cultura ovo ou célula adaptado de mutações são introduzidas em locais-chave antigênicos que podem causar alterações na antigenicidade do vírus utilizado no ensaio. Em terceiro lugar, a quantidade de vírus infecciosos usados em cada ensaio deve ser cuidadosamente titulado e verificado com a inclusão de uma titulação de volta para cada vírus em cada ensaio. Muito vírus utilizado no ensaio podem reduzir os anticorpos detectados e reduzir a sensibilidade do ensaio. Da mesma forma, fará com que muito pouco vírus utilizado no ensaio de sinais fracos VC e planos de fundo elevados (CC) e resultados falso-positivos. Assim, é importante incluir o soro controle positivo e negativo apropriado em ensaios para monitorar o desempenho. Ao comparar respostas de anticorpos a vários vírus, usando o mesmo sera, é fundamental para garantir que trás as titulações de todos os vírus estão dentro do intervalo aceitável.

O ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 é sensível e específico na detecção de respostas de anticorpos para 3C.2a contemporânea e 3C.3a A(H3N2) vírus da gripe em soros humanos, incluindo antigenicamente derivou de vírus A(H3N2)6. Este ensaio tem sido usado para avaliar soros humanos vacinados painéis para 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus seguindo inactivados gripe vacinação5,17,18. No entanto, como tem de gripe vírus continuam a adquirir mutações que podem alterar a antigenicidade e propriedades de ligação do receptor do vírus e causar deriva antigênica, contínuos são necessários esforços para otimizar ensaios de sorologia de gripe existente a fim de manter a sensibilidade e especificidade necessárias para caracterizar o novo vírus da gripe emergentes.

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Disclosures

Os autores não relatam nenhum conflito de interesses. Os resultados e conclusões contidas nesta publicação são as dos autores e não representam necessariamente as opiniões dos centros para controle de doenças e prevenção e a agência de financiamento.

Acknowledgments

Agradecemos o Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu e MS. Ashley Burroughs da divisão da gripe do CDC para sua revisão crítica e assistência na preparação deste manuscrito. Agradecemos o Dr. Adrian Reber da divisão da gripe do CDC por sua assistência na preparação os gráficos da Figura 3. Por último, agradecemos o Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemanha para fornecer as células MDCK-SIAT1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

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References

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