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Neuroscience

Phrenic मोटर न्यूरॉन्स के चूहों में प्रतिगामी Neuroanatomical अनुरेखण

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56758

Summary

यहाँ, हम fluorophore संयुग्मित हैजा विष उपइकाई बीटा के intrapleural वितरण के बाद चूहों में phrenic मोटर न्यूरॉन्स की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. दो तकनीकों फुफ्फुस गुहा सुई की तुलना में कर रहे हैं: transdiaphragmatic बनाम transthoracic दृष्टिकोण ।

Abstract

Phrenic मोटर न्यूरॉन्स ग्रीवा मोटर ंयूरॉंस सबसे स्तनधारी प्रजातियों में C3 से सी 6 के स्तर से उत्पंन कर रहे हैं । Axonal अनुमानों श्वसन डायाफ्राम innervating phrenic नसों में एकाग्र । रीढ़ की हड्डी के स्लाइस में, phrenic मोटर न्यूरॉन्स रूपात्मक या जैव रासायनिक मानदंडों पर अन्य मोटर न्यूरॉन्स से पहचाना नहीं जा सकता. हम phrenic मोटर न्यूरॉन सेल निकायों में चूहों visualizing के लिए प्रक्रियाओं का विवरण प्रदान करते हैं, हैजा विष उपइकाई बीटा के intrapleural इंजेक्शन निम्नलिखित (CTB) एक fluorophore करने के लिए संयुग्मित. इस फ्लोरोसेंट neuroanatomical अनुरेखक को डायाफ्राम neuromuscular जंक्शन पर पकड़ा जा करने की क्षमता है, प्रतिगामी phrenic axons साथ किया जा सकता है और phrenic सेल निकायों तक पहुंचने । intrapleural CTB डिलीवरी के दो methodological दृष्टिकोण की तुलना में हैं: transdiaphragmatic बनाम transthoracic इंजेक्शन । दोनों दृष्टिकोण सफल रहे है और CTB के समान संख्या में परिणाम-phrenic मोटर ंयूरॉंस लेबल । अंत में, इन तकनीकों को कल्पना या इस तरह डायाफ्राम-phrenic सर्किट पर ध्यान केंद्रित उन के रूप में विभिंन प्रायोगिक अध्ययन में phrenic मोटर ंयूरॉंस मात्रा लागू किया जा सकता है ।

Introduction

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अध्ययन का उद्देश्य माउस रीढ़ की हड्डी वर्गों पर phrenic मोटर न्यूरॉन्स (PhMN) की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय विधि पेश करने के लिए है. फुफ्फुस गुहा में एक फ्लोरोसेंट neuroanatomical अनुरेखक के इंजेक्शन डायाफ्राम पर phrenic neuromuscular अनुमानों तक पहुँचने और axons सेल निकायों लेबल करने के लिए phrenic phrenic साथ प्रतिगामी परिवहन का उपयोग करने के लिए वितरण विधि के रूप में चुना गया था । intrapleural डिलीवरी की दो तकनीक बताई गई हैं: transdiaphragmatic बनाम transthoracic ।

Phrenic मोटर न्यूरॉन्स रीढ़ रिले कोशिकाओं जिसका axons Phrenic नसों, जो अंततः डायाफ्राम अंदर आना में एकाग्र कर रहे हैं । ये कम मोटर न्यूरॉन्स bulbar श्वसन केंद्रों से inspiratory ड्राइव प्राप्त कर रहे हैं और यह डायाफ्राम न्यूरो पेशी जंक्शनों (NMJ) के लिए रिले । PhMN दो मोटर कॉलम, प्रत्येक hemicord के लिए एक, मध्य ग्रीवा रीढ़ के साथ चल रहा में संरचित कर रहे हैं । मनुष्यों सहित स्तनधारी प्रजातियों में से अधिकांश में, phrenic मोटर कॉलम C3 से सी 6 सी1,2,3के स्तर से फैल गया । हम और दूसरों की पुष्टि की है कि PhMN में ध्यान केंद्रित C3-C5 स्तर में चूहा और माउस रीढ़ की हड्डी में4,5,6,7,8। phrenic कोशिकाओं के स्थलाकृतिक वितरण यादृच्छिक पर नहीं है; मोटर न्यूरॉन्स डायाफ्राम के स्टर्नल हिस्सा innervating phrenic मोटर पूल (C3) के कपाल भाग में और अधिक घनी वितरित कर रहे हैं, जबकि मोटर न्यूरॉन्स innervating crural हिस्सा अधिक caudal (C5)9हैं । इसके अलावा, PhMN ventral सींग ग्रे मामले में विभिंन संकुल रहे हैं । C3 के स्तर पर, phrenic कोशिकाओं के समूहों बाद में झूठ बोलते हैं, तो वे एक ventrolateral दिशा में बदलाव और सबसे caudal स्तर पर ventromedially पाया जाता है10,11.

प्रेरणा के दौरान उनकी महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, यह अत्यंत महत्व का सही है स्वस्थ रीढ़ की हड्डी में PhMN की पहचान करने के लिए, लेकिन यह भी रोग की स्थिति के दौरान उनके भाग्य का पालन करें, इस तरह के अपक्षयी रोगों या रीढ़ की हड्डी की दर्दनाक चोटों के रूप में । चूंकि PhMN अंय गर्भाशय ग्रीवा मोटर ंयूरॉंस से आकृति विज्ञान अलग नहीं है, PhMN की पहचान neuroanatomical अनुरेखकों के लक्षित वितरण पर निर्भर करता है या तो प्राथमिक श्वसन केंद्रों के स्तर पर 8, या डायाफ्राम NMJ 7 या में phrenic तंत्रिका4। अनुरेखक तंत्रिका तंतुओं द्वारा लिया जाता है और ग्रीवा रीढ़ है, जहां यह प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष जांच प्रणालियों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है में phrenic सेल निकायों के लिए किए गए । प्रतिगामी या anterograde अनुरेखकों conjugates की एक व्यापक रेंज के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. ध्यान देने योग्य, प्रत्येक अनुरेखक नहीं, कम या ट्रांस synaptic अनुरेखण के लिए उच्च क्षमताओं के साथ संपंन है ।

वर्तमान अध्ययन में, हम हैजा विष (CTB) Alexa Fluor ५५५ के साथ कार्यात्मक के बीटा उपइकाई चुना (इसके बाद CTB के रूप में निर्दिष्ट-fluorophore) एक फ्लोरोसेंट लेबल के रूप में, जमे हुए रीढ़ की हड्डी के वर्गों पर PhMN का सीधा दृश्य की अनुमति । CTB आमतौर पर एक monosynaptic अनुरेखक के रूप में वर्णित है, हालांकि प्रयोगात्मक डेटा के लिए एक transneuronal गद्यांश12दिखा देते हैं. CTB के पास तंत्रिका को समाप्त करने की प्लाज्मा झिल्ली पर ganglioside GM1 बाँधने की क्षमता है. CTB clathrin-निर्भर या स्वतंत्र तंत्र और यातायात ट्रांस Golgi नेटवर्क के माध्यम से एक प्रतिगामी फैशन में endoplasmic जालिका में13,14के माध्यम से आंतरिक है । internalization और प्रतिगामी परिवहन के लिए actin cytoskeleton15,16 के साथ ही microtubule नेटवर्क पर17पर निर्भर होने लगते हैं ।

एक प्रतिगामी neuroanatomical अनुरेखक लेबलिंग डायाफ्राम-PhMN सर्किट के रूप में CTB की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, CTB-fluorophore intrapleurally दिया गया था. CTB दो तकनीकों का उपयोग कर प्रशासित किया गया था: पहले एक laparotomy और कई transdiaphragmatic इंजेक्शन शामिल; दूसरा एक, कम इनवेसिव, एक अनूठा transthoracic इंजेक्शन का इस्तेमाल किया । चार दिन बाद, फ्लोरोसेंट-लेबल PhMNs से दोनों स्वस्थ और से रीढ़ की हड्डी में ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में quantified थे-घायल (C4) जानवरों ।

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Protocol

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प्रायोगिक प्रोटोकॉल पशु प्रयोग के लिए यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देशों के अनुपालन में आयोजित किया गया था (2010/63/यूरोपीय संघ, 86/609/EEC और 87-848/EEC) और ही णम्र विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (नीति परियोजना n ° 17-284 ). चित्र 1 दो संबंधित दृष्टिकोणों को दर्शाया गया है: transdiaphragmatic या transthoracic इंजेक्शन । अध्ययन में 3 से 4 महीने की आयु वर्ग के पुरुष C57bl/6J चूहों (n = 18) का उपयोग करें ।

1. CTB समाधान की तैयारी

  1. transdiaphragmatic इंजेक्शन के लिए:
    1. ०.२% (डब्ल्यू/वी) की एकाग्रता के लिए बाँझ पानी में CTB शक्ति भंग.
    2. लोड ७.५ µ l CTB समाधान (०.२% w/v) एक बाँझ 10-µ l-microsyringe के साथ एक संलग्न ३३-गेज सुई (कुंद या कम बेवल) प्रत्येक माउस के लिए.
  2. transthoracic इंजेक्शन के लिए:
    1. ०.१% (डब्ल्यू/वी) की एकाग्रता के लिए बाँझ पानी में CTB शक्ति भंग.
    2. CTB समाधान (०.१% डब्ल्यू/वी) के 20 µ एल लोड एक बाँझ ५०० में-µ एल इंसुलिन सिरिंज प्रत्येक माउस के लिए एक बेवल 27-गेज सुई के साथ.
      नोट: आसुत और बाँझ पानी का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें और ठीक से CTB पाउडर भंग. समाधान एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है (फ्रीज नहीं है) । कुछ दिनों के बाद एक हाला के रूप हो सकता है । कमरे के तापमान के समाधान लाओ और अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले एक पिपेट का उपयोग कर मिश्रण ।

2. Intrapleural इंजेक्शन से पहले तैयारी

  1. शल्य चिकित्सा उपकरण शल्य चिकित्सा से पहले, आटोक्लेव या कांच-मनका नसबंदी का उपयोग कर निष्फल । सर्जरी करने के लिए और शल्य चिकित्सा उपकरणों को निपटाने के लिए एक साफ बेंच कोट तैयार करें ।
    नोट: शल्य प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किसी भी सामग्री बाँझ होना चाहिए. उपकरण है कि इस तरह के microsyringe के रूप में निष्फल नहीं किया जा सकता है एक विसंक्रमित (chlorhexidine) के साथ नीचे नष्ट किया जाना चाहिए या एकल उपयोग केवल होना चाहिए । सर्जन सर्जरी की शुरुआत से पहले एक संक्रमित (chlorhexidine सफ़ाई) के साथ उसके हाथ धोने चाहिए । सर्जन बाँझ दस्ताने, एक facemask, और एक साफ गाउन पहनना चाहिए ।
  2. पशु वजन, और संज्ञाहरण की एक उचित खुराक प्रशासन: संवेदनाहारी कॉकटेल के intraperitoneal इंजेक्शन (जैसे ketamine १०० मिलीग्राम/kg और xylazine 5 मिलीग्राम/
  3. चुटकी पैर और/या palpebral पलटा के नुकसान के लिए जांच करने के लिए निर्धारित अगर माउस ठीक से anesthetized है । कॉर्निया की रक्षा के लिए एक पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
  4. ध्यान से ventral त्वचा (transdiaphragmatic प्रक्रिया के लिए) या सही पक्षीय वक्ष त्वचा (transthoracic प्रक्रिया के लिए) दाढ़ी, बिजली के बाल कतरनी का उपयोग कर । अच्छी तरह से दाढ़ी और पर्याप्त व्यापक सर्जरी के क्षेत्र में हो रही बालों को रोकने के लिए ।
  5. मुंडा क्षेत्र पर 10% आयोडीन समाधान के सामयिक आवेदन द्वारा अपूतित शर्तों सुनिश्चित करें । आयोडीन समाधान के साथ सर्जिकल साइट सफ़ाई, परिधि की ओर साइट के केंद्र से साफ़ करने के लिए सावधान किया जा रहा.
  6. पशुओं के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए सर्जरी भर में एक homeothermic पैड का प्रयोग करें ।

3. Intrapleural इंजेक्शन Transdiaphragmatic दृष्टिकोण का उपयोग

  1. एक हीटिंग पैड पर लापरवाह स्थिति में anesthetized माउस लेट । जानवर की गर्दन के नीचे एक लुढ़का हुआ धुंध पैड रखें । एक वयस्क माउस के लिए, मोटाई में ०.५ इंच की एक लुढ़काया धुंध पैड का उपयोग करें । अगर कोई भी मूवमेंट से बचने के लिए इस पैड को सर्जरी बोर्ड को टेप करें ।
  2. एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, midline के साथ ventral त्वचा incise: नाल क्षेत्र को असिरूप प्रक्रिया से एक चीरा जबकि दूसरे हाथ से त्वचा को तना हुआ बनाने के साथ बाद में चमड़ी खींच । हानिकारक अंतर्निहित अंगों से बचने के लिए ब्लेड पर बहुत अधिक दबाव लागू न करें ।
  3. छोटे कैंची का प्रयोग, ध्यान से चीरा के आसपास पेट की मांसपेशियों से त्वचा को अलग. यह प्रक्रिया सर्जरी के अंत में मांसपेशियों और त्वचा के अलावा सिलाई पर मदद मिलेगी ।
  4. छोटे कैंची का उपयोग कर laparotomy प्रदर्शन । नाभि के स्तर पर एक फंदा चीरा प्रदर्शन करके उदर गुहा खोलें । Incise व्हाइट लाइन ("लीनिया अल्बा") असिरूप प्रक्रिया को ऊपर के साथ पेट की मांसपेशियों को ।
  5. आदेश में डायाफ्राम के उदर की सतह कल्पना, पेट की मांसपेशियों को वापस लेने के लिए वाणिज्यिक या घर का बना ट्रैक्टर का उपयोग कर ।
    नोट: इन reट्रेक्टरों एल-हुक19में आकार का मिडी आकार के कागज क्लिप से बनाया जा सकता है ।
  6. laparotomy के दोनों ओर बाहर खिंचाव, और पीठ कोट करने के लिए ट्रैक्टर नीचे टेप । देखने के क्षेत्र की रोशनी का अनुकूलन ताकि डायाफ्राम के पेट की सतह penumbra में कोई और अधिक है । इस प्रयोजन के लिए सबसे शक्तिशाली प्रकाश उपकरण एक ओरिएंट प्रकाश बीम के साथ एक एलईडी लैंप है ।
  7. एक हाथ में नरम चिमटी का प्रयोग, xyphoid परिशिष्ट ऊपर उठा और जिगर के पार्श्व पालियों नीचे खींच (चित्रा 2a). दूसरे हाथ में छोटे कैंची का प्रयोग, ध्यान से पित्ताशय की थैली या डायाफ्राम (चित्रा बी) को नुकसान पहुँचाए बिना, suspensory बंधन काट ।
  8. एक हाथ में नरम चिमटी का उपयोग कर, xyphoid परिशिष्ट उठा । दूसरे हाथ में हैमिल्टन सिरिंज समझ । सही hemidiaphragm में इंजेक्शन के तीन साइटों को लक्षित क्रमशः स्टर्नल, औसत दर्जे का और crural क्षेत्रों (चित्रा 3, चित्र बीमें इनसेट) को कवर किया ।
  9. के रूप में डायाफ्राम मोटाई चूहों7में ०.३७ mm के आसपास है, डायाफ्राम शीट से परे सुई नहीं 1 या 2 मिमी डालने के लिए सांस लेने के दौरान फेफड़ों के नुकसान को रोकने के । प्रत्येक साइट (चित्रा 4B) पर सही डायाफ्राम के माध्यम से CTB समाधान (०.२% डब्ल्यू/वी) के २.५ µ एल उद्धार । डायाफ्राम के स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है ।
  10. इंजेक्शन की तीन ipsilateral साइटों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ (चित्र 1a), और PhMN पूल के एक द्विपक्षीय लेबलिंग के लिए contralaterally.
  11. laparotomy साइट बंद करने के लिए, resorbable 4-0 सीवन के साथ सीवन पेट की मांसपेशियों । 3 मिमी द्वारा अंतरिक्ष में बाधित टांके का प्रयोग करें. स्टेपल त्वचा ९.० mm घाव क्लिप के साथ बंद कर दिया । प्रधानों बंद खींच से पशु को रोकने के लिए स्टेपल कस । अंतरिक्ष स्टेपल लगभग 5 मिमी के अलावा । घाव क्लिप्स को अधिक मजबूत न करें, क्योंकि यह ख़राब चिकित्सा का कारण बन सकता है ।
  12. कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए आसुत जल के साथ स्वच्छ माइक्रो सिरिंज । धीरे से आकर्षित और 2-3 बार निष्कासित । सिरिंज में हवा आकर्षित मत करो ।

4. Intrapleural इंजेक्शन Transthoracic दृष्टिकोण का उपयोग

नोट: इस विधि से प्रेरित है चूहों में वर्णित प्रक्रिया4 और माउस के लिए अनुकूलित किया गया था ।

  1. बाएँ पार्श्व decubitus स्थिति में anesthetized माउस लेट, एक हीटिंग पैड पर (चित्र 4a).
  2. कोहनी क्षेत्र के तहत छठी और सातवीं पसलियों की पहचान करें मैनुअल टटोलने का कार्य (चित्रा 4B) ।
  3. जबकि एक सहायक सही सामने फैली-और हिंद अंग (चित्रा 5 ए), और छठे या सातवीं रिब, 3 mm त्वचा से गहरी, नीचे बेवल के साथ (आंकड़ा 1b और चित्रा 5B) के तहत कपाल उंमुख सिरिंज और tangentially डालें ।
  4. सुई धीरे से पुष्टि करने के लिए तरक्की, पसलियों ऊपर उठाने के द्वारा, कि यह अच्छी तरह से वक्ष गुहा में तैनात है (चित्रा 5C, चित्र 1bमें presets).
  5. छाती की दीवार पर दो उंगलियों के साथ मामूली दबाव लागू करने से छाती के श्वास आंदोलनों स्थिर ।
  6. जबकि दूसरे हाथ में सिरिंज पकड़े, CTB समाधान के 20 µ एल उद्धार (०.१% डब्ल्यू/वी) एक इंजेक्शन में ।

5. पोस्ट को-ऑपरेटिव केयर

  1. तुरंत प्रक्रिया के बाद, वसूली के लिए एक homeothermic पैड पर सही पार्श्व decubitus स्थिति में माउस करना । यह अनुरेखक फुफ्फुस गुहा के दाईं ओर फैला है और जानवरों की सांस लेने की निगरानी के लिए अनुमति देता है सुनिश्चित करता है ।
  2. प्रशासन 1 मल बाँझ खारा समाधान आईएफसआई के चमड़े के नीचे । पालन इंजेक्शन प्रदान करें यदि पशु निर्जलित दिखाई देता है और/
  3. प्रशासन के चमड़े के नीचे ०.१ मिलीग्राम/buprenorphine के किलो, पहले दो दिनों के बाद सर्जरी के दौरान एक दिन में दो बार, किसी भी संभावित दर्द को कम करने के लिए ।
    नोट: कई संस्थानों आक्रामक प्रक्रियाओं के लिए multimodal analgesia की सिफारिश करेंगे, जैसे यहां चित्रित laparotomy । इस चीरा साइट पर एक गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ (NSAID) दवा और/या एक स्थानीय संवेदनाहारी एजेंट का उपयोग शामिल हो सकते हैं । इन दवाओं आमतौर पर पहले चीरा से पहले हवा में दर्द को कम करने के लिए दिया जाता है ।
  4. इच्छामृत्यु पर रोजाना जानवरों की निगरानी करें ।

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Representative Results

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पुरुष C57bl/6J चूहों (n = 18), 3 से 4 महीने की आयु वर्ग के अध्ययन में शामिल थे । प्रयोग के 0 दिन में, 8 चूहों एक एकतरफा C4 contusion, ठीक पक्षीय, प्रकाशित प्रोटोकॉल7,18के अनुसार गुजरा । शम प्रक्रिया के रूप में, 10 चूहों contusion बिना C4 के शीर्ष पर एक laminectomy गुजरा । 3 दिन में, चूहों ऊपर वर्णित दो अलग प्रक्रियाओं के अनुसार CTB-fluorophore के intrapleural इंजेक्शन के लिए तैयार थे. 7 दिन में, सभी चूहों संज्ञाहरण निम्नलिखित euthanized थे (ketamine १०० मिलीग्राम/kg और xylazine 5 mg/) और exsanguination.

पूरे रीढ़ की हड्डी काटा गया था, paraformaldehyde और cryoprotected में 30% मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुसार सुक्रोज में तय की । ग्रीवा वृद्धि अलग था, O.C.T. में एंबेडेड और cryosectioned longitudinally या transversally 30 µm की मोटाई पर ।

अनुदैर्ध्य रीढ़ की हड्डी वर्गों प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए फ़िल्टर घन से सुसज्जित एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ मनाया गया (उत्तेजना: 560/20nm; उत्सर्जन: 635/30nm/ ventral सींग में फ्लोरोसेंट मोटर न्यूरॉन्स C3 से C5 स्तर तक कोशिकाओं के एक रेखीय स्तंभ के रूप में पहचाने गए थे (चित्रा 6A, ऊपरी पैनल). सभी लेबल किए गए कक्ष ipsilateral ग्रे मैटर में स्थित थे और मोटर न्यूरॉन्स (फिगर घमण्ड) के अनुरूप आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया गया. घायल जानवरों में, लेबल PhMN के एक हड़ताली नुकसान C4 स्तर पर मनाया गया था, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में व्यवधान के साथ एक साथ ( चित्रा 6A और 6Cमें तारांकन चिह्न). CTB+ PhMNs मैंयुअल रूप से हर पांचवें अनुप्रस्थ खंड (१५० µm द्वारा स्थान) में घायल और C4-घायल रीढ़ की हड्डी (चित्रा 6C) गिना रहे थे । लेबल किए गए PhMNs की कुल संख्या का एक अनुमान परिकलित CTB+ कक्षों की संख्या को गुणा करके 5 से गणना की गई थी । घायल स्वस्थ चूहों में, PhMNs प्रति hemicord लेबल की कुल संख्या १५१ ± 9 में अनुमान किया गया था जब transdiaphragmatic (TDia) दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, १७८ ± 9 की तुलना में जब transthoracic (तथो) दृष्टिकोण (चित्रा 6D) का उपयोग कर. C4 चोट के बाद, इन नंबरों को क्रमशः ५९ ± 14 और ७० ± 10 गिरा दिया । इस अध्ययन में, कोई सांख्यिकीय मतभेद intrapleural वितरण के दो तरीकों के बीच सबूत थे (पी > 0.05, मान-Whitney यू परीक्षण; TDia बनाम तथो) ।

Figure 1
चित्र 1. transdiaphragmatic या transthoracic इंजेक्शन का उपयोग कर Intrapleural इंजेक्शन । Transdiaphragmatic दृष्टिकोण एक laparotomy, डायाफ्राम के पेट की सतह के जोखिम (गुलाबी रंग में) और स्टर्नल, औसत दर्जे का और crural क्षेत्रों में तीन इंजेक्शन शामिल हैं । transthoracic दृष्टिकोण के लिए, माउस बाएं पार्श्व decubitus स्थिति में रखी है । छठी और सातवीं पसलियों मैनुअल टटोलने का कार्य बीद्वारा कोहनी क्षेत्र के तहत पहचाने जाते हैं । सुई त्वचा के माध्यम से डाला जाता है, चमड़े के नीचे ऊतक, वक्ष मांसपेशियों, पसलियों के बीच की मांसपेशियों और पार्श्विका फुफ्फुस फुफ्फुस गुहा (asterix) तक पहुँचने के लिए । एस, स्टर्नल; मी, औसत दर्जे का; ग, crural; S/SC, त्वचा और चमड़े के नीचे ऊतक; TM, वक्ष मांसपेशियों; आईसी, पसलियों के बीच की मांसपेशियों; पीपी; पार्श्विका फुफ्फुस; एल, लंग. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. जिगर, पित्ताशय की थैली और डायाफ्राम के पेट के चेहरे पर एक दृश्य के साथ सर्जिकल क्षेत्र । A. पित्ताशय की थैली और डायाफ्राम के बीच suspensory बंधन नोट । ख. बंधन ध्यान से काट रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. डायाफ्राम पर देखें । स्टर्नल (एस), औसत दर्जे का (एम) और crural (ग) क्षेत्रों की सही hemidiaphragm में पहचान की जाती है । A. ध्यान दें कि crural क्षेत्र जिगर पालियों के पीछे है । ख. फुफ्फुस अंतरिक्ष में CTB इंजेक्षन करने के लिए, सुई 1 mm सही hemi-डायाफ्राम के माध्यम से गहरी डालें । औसत दर्जे का क्षेत्र में इंजेक्शन सचित्र है कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. Transthoracic दृष्टिकोण. माउस बाएं पार्श्व decubitus Aमें तैनात है । डायाफ्राम और कोहनी क्षेत्र की लागत मार्जिन की पहचान । B. छठे और सातवें पसलियों के बीच रिक्त स्थान कोहनी क्षेत्र के लिए गहरी पहचान कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. छठे और सातवें पसलियों के बीच रिक्त स्थान कोहनी क्षेत्र के लिए गहरी पहचान कर रहे हैं । A. हले-और हिंद-अंग विस्तारित हैं । B. सिरिंज कपालीय उंमुख है और tangentially के तहत डाला छठे या सातवीं रिब, 3 मिमी गहरी पसलियों के बीच की मांसपेशियों के साथ, ऊपर बेवल उल्टा के साथ. C. सुई धीरे ऊंचा है और पसलियों सुई अच्छी तरह से वक्ष गुहा में तैनात है की पुष्टि करने के लिए उठा रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. CTB+ कोशिकाओं के ventral सींग ग्रे बात में intrapleurally इंजेक्शन चूहों । A. रीढ़ की हड्डी में घायल माउस, CTB+ phrenic मोटर न्यूरॉन्स स्तर C3 के लिए C5 से गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के साथ वितरित. contused माउस में, ऊतक व्यवधान एकतरफा CTB+ phrenic मोटर न्यूरॉन्स C4 स्तर (asterix) में कमी के साथ मनाया जाता है. B. लेबल CTB+ कक्ष ipsilateral धूसर पदार्थ में स्थित थे और मोटर न्यूरॉन्स के साथ संगत आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया गया. C. रीढ़ की हड्डी के अनुप्रस्थ वर्गों के लिए (बाएं) और घायल (दाएं) चूहों घायल में रीढ़ की हड्डी के साथ विशिष्ट दूरी पर CTB+ कोशिकाओं की संख्या यों तो इस्तेमाल किया गया । घ. ठहराव में CTB+ कोशिकाओं के ipsilateral hemicord में पाए जाने वाले घायल या घायल चूहों के transdiaphragmatic (TDia) या transthoracic (तथो) के दृष्टिकोण intrapleural CTB प्रसव के अनुसार. सलाखों के प्रतिनिधित्व २५० µm. Data मतलब (SEM) के अर्थ ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किया गया । n = 5-7 प्रत्येक TDia समूह में चूहों; n = प्रत्येक तथो समूह में 3 चूहे । गैर-parametrical मान-Whitney U परीक्षणों का प्रदर्शन किया गया और परिणाम p < 0.05 के लिए काफी भिंन माने गए थे । घायल बनाम C4 इंजरी के लिए < 0.001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के किसी भी तनाव के लिए लागू किया जा सकता है या किसी भी प्रयोगात्मक प्रतिमान जिसमें डायाफ्राम-PhMN सर्किट की अखंडता का मूल्यांकन किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) और गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट (cSCI) PhMN हानि, anterograde phrenic और बाद में श्वसन समझौता के उत्थान के साथ जुड़े शर्तों रहे हैं । ALS या cSCI के पशु मॉडल histopathological और कार्यात्मक श्वसन घाटे की नकल मानव रोगों में मनाया । इन मॉडलों में, ऊतकवैज्ञानिक तकनीक अक्सर PhMN neuroprotection18,20,21पर लक्ष्य विभिंन चिकित्सीय हस्तक्षेप के बाद PhMN अस्तित्व का मूल्यांकन करने के लिए लागू कर रहे हैं । डायाफ्राम NMJ या axonal परिवहन निस्संदेह CTB की मात्रा में न्यूरॉन्स कोशिका निकायों में संचित समझौता होगा पर लेने की कोई परेशानी । phrenic axons या PhMN अध की हानि स्पष्ट रूप से रीढ़ की हड्डी में CTB retrotransported की मात्रा में कमी होगी ।

intrapleural प्रशासन के प्रत्येक दृष्टिकोण अपने स्वयं के पेशेवरों और बुरा है । Transdiaphragmatic इंजेक्शन काफी आक्रामक हैं, necessitating laparotomy और सावधान सिलाई सभी त्वचा परतों के dehiscence और अंग की दखलंदाजी को रोकने के लिए । Laparotomy सामांय श्वसन22 के साथ हस्तक्षेप और एक बाहर शासन नहीं है कि यह PhMN गतिविधि या रेट्रो परिवहन क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, इंजेक्शन के दौरान डायाफ्राम के प्रत्यक्ष दृश्य फुफ्फुस अंतरिक्ष के सफल लक्ष्यीकरण हर समय सुनिश्चित करता है । Transthoracic इंजेक्शन transdiaphragmatic इंजेक्शन की तुलना में न्यूनतम इनवेसिव कर रहे हैं और इस प्रकार शोधन के लिए एक प्रक्रिया के रूप में माना जा सकता है, "तीन रुपए" अवधारणा की नस में. एक दोष एक अनुभवहीन उपयोगकर्ता के लिए रवाना होने की वृद्धि की संभावना है (जैसे चमड़े के नीचे ऊतक में या छाती की दीवार में) ।

intrapleural फ्लोरोसेंट-CTB प्रशासन के बाद, यह संभावना है कि किसी भी मोटर न्यूरॉन फुफ्फुस गुहा अस्तर की मांसपेशियों पर पेश कर रहा है, PhMN सहित लेबल किया जाएगा, पसलियों के बीच मोटर न्यूरॉन्स या brainstem मोटर न्यूरॉन्स के विभिन्न आबादी. वयस्क चूहों में, Mantilla एट अल. प्रदर्शन किया कि पसलियों के बीच मोटर न्यूरॉन्स भी वक्ष रीढ़ की हड्डी के ventral सींग में लेबल थे, साथ ही साथ कुछ पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि न्यूरॉन्स4. हम चूहों में गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी से अन्य साइटों में CTB-लेबल कोशिकाओं की उपस्थिति की जाँच नहीं की है.

प्रयोगात्मक सेटिंग्स/मॉडल के आधार पर, परिणाम उपायों ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के साथ PhMNs की स्तंभ व्यवस्था शामिल कर सकते हैं, प्रत्येक PhMN की स्थिति के बारे में ज्यामितीय डेटा का विस्तृत विश्लेषण या, के रूप में यहां वर्णित, PhMN के ठहराव संख्या. कुल PhMN संख्या का सटीक मूल्यांकन तकनीकी विचार और अंतर-विश्लेषक विश्वसनीयता पर निर्भर करता है; CTB प्रतिदीप्ति तीव्रता की परिवर्तनशीलता के कारण, ंयूरॉन सोमा आकार या पृष्ठभूमि धुंधला । CTB-fluorophore के transdiaphragmatic इंजेक्शन का उपयोग करते हुए हमारे अनुभव में, हम १२० और १८० कोशिकाओं के बीच एक सीमा में माउस hemicord प्रति PhMN की संख्या का अनुमान लगाया है, अन्य समूहों8से डेटा से थोड़ा कम की एक संख्या. दरअसल, अध्ययन की दो सीमाएं हैं । सबसे पहले, जानवरों की एक सीमित संख्या transthoracic दृष्टिकोण का उपयोग कर इंजेक्शन रहे हैं और दूसरा वहाँ PhMN पूल की पूरी लेबलिंग पर एक अनिश्चितता है । Phrenic तंत्रिका डुबकी (तंत्रिका transection के बाद) या फ्लोरोसेंट neuroanatomical अनुरेखक के साथ intraneural इंजेक्शन पूरक तकनीक है कि और अधिक सही सभी PhMNs लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भविष्य के अध्ययन के लिए, यह stereology के रूप में निष्पक्ष तरीके से PhMNs गिनती की सिफारिश की है ।

हमारे अनुभव में, हम किसी भी स्पष्ट श्वसन घाटे या जटिलताओं (श्वसन संकट) ऐसे रक्तस्राव या वातिलवक्ष इस प्रक्रिया के बाद के रूप में कभी नहीं मनाया है । हालांकि, अगर डायाफ्राम transdiaphragmatic इंजेक्शन के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया है, छोटे व्यास या तेज बेवल के साथ की एक सुई का उपयोग करने पर विचार करें ।

के दौरान या सर्जरी के बाद पशु मौत से बचने के लिए ध्यान से संवेदनाहारी कॉकटेल में प्रत्येक घटक की सांद्रता की जांच करें । जिगर की सतहों पर चोटों बनाने से बचें, आंत, पित्ताशय की थैली या डायाफ्राम.

PhMN का कोई या कम लेबलिंग कई समस्याओं के कारण हो सकता है । यदि transthoracic इंजेक्शन फुफ्फुस गुहा याद करता है, पुनः करते है और मैनुअल टटोलने का कार्य है कि सुई पसलियों के नीचे डाला जाता है या त्वचा के माध्यम से बाहर पॉप नहीं की जांच करें । कोई बुलबुले CTB समाधान के इंजेक्शन पर फार्म चाहिए । यह भी याद रखें कि तंत्रिका कोशिका में CTB के internalization पीएच निर्भर करता है23: अम्लीय और तटस्थ पीएच इष्टतम हैं, जबकि बुनियादी पीएच विष की अधिकता को बाधित. यह पानी में CTB पाउडर, खारा में या पंजाबियों बफर में reसस्पैंड करने के लिए सिफारिश की है । न्यूरॉन कोशिका शरीर में लेबल विष के हठ समय पर विचार करें । हमारे अनुभव में, हम चार दिनों और intrapleural प्रसव के बाद दो सप्ताह के बीच एक समय विंडो में CTB-लेबल कोशिकाओं का पता लगा सकता है । प्रतिगामी परिवहन के लिए आवंटित समय को कम करने या intrapleural वितरण और बलिदान के बीच समय में वृद्धि ऊतक में फ्लोरोसेंट-CTB का इष्टतम पता लगाने से समझौता हो सकता है ।

प्रतिदीप्ति लुप्त होने से बचने के लिए उचित निर्धारण विधि का उपयोग करें । हम perfusing के साथ पशु के शरीर का सुझाव 4% paraformaldehyde । एक बार रीढ़ की हड्डी काटा जाता है, एक ही निर्धारण रातोंरात में गर्मी । Cryoprotect ७२ घंटे के लिए सुक्रोज 30% समाधान में गर्भनाल डूब जब तक, तो O.C.T. माध्यम में ग्रीवा वृद्धि (के बारे में 8 मिमी) एंबेड । निर्जलीकरण या तेल में नमूना एंबेड नहीं है । पूरे बाद प्रसंस्करण के दौरान प्रकाश से रीढ़ की हड्डी के नमूनों या ऊतक वर्गों की रक्षा करना । फिक्स्ड पूरे रीढ़ की हड्डी में रखा जा सकता है 4 महीने के लिए ° c अगर thimerosal cryoprotectant समाधान करने के लिए जोड़ा जाता है (सोडियम azide नहीं जोड़ के रूप में यह प्रतिदीप्ति लुप्त होती भड़काना होगा) । ऊतक वर्गों प्रकाश से दूर महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है । अंत में, हम एक विरोधी लुप्त होती रिएजेंट के साथ स्लाइड माउंट करने की सलाह । यदि प्रतिदीप्ति फीका है, यह अभी भी immunohistochemistry का उपयोग कर CTB का पता लगाने के लिए संभव है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनके तकनीकी समर्थन के लिए रॉबर्ट Graffin और Pauline Duhant के आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250 Keller 31-101
Small scissors F.S.T. 14058-00
Soft tweezers F.S.T. 11042-08
Scalpel blades Swann Morton No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 Life Technologies C22843 Bring at room temperature before use 
10ul Hamilton syringue, removable needle Sigma-Aldrich 701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 Filter Service 7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge Terumo BS05M2713
Orientable LED lamp V.W.R. 631-0995
Resorbable 4/0 sutures S.M.I. AG 15151519
Needle holder F.S.T. 12002-14
9mm autoclips Bioseb 205016
Autoclip 9mm applier Bioseb MikRon 9mm

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References

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Phrenic मोटर न्यूरॉन्स के चूहों में प्रतिगामी Neuroanatomical अनुरेखण
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Vandeweerd, J. M., Hontoir, F., De Knoop, A., De Swert, K., Nicaise, C. Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice. J. Vis. Exp. (132), e56758, doi:10.3791/56758 (2018).More

Vandeweerd, J. M., Hontoir, F., De Knoop, A., De Swert, K., Nicaise, C. Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice. J. Vis. Exp. (132), e56758, doi:10.3791/56758 (2018).

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