Summary
Burada, sonra intrapleural teslim fluorophore kolera toksini alt birim beta Birleşik frenik motor nöronlar farelerde belirlenmesi için bir protokol açıklayın. İki teknik plevral boşluğu enjekte etmek için karşılaştırılır: Transtorasik yaklaşımlar karşı transdiaphragmatic.
Abstract
Frenik motor nöronlar servikal motor nöronlar en memeli türlerinde C6 düzeylere C3 kaynaklanan vardır. Aksonal projeksiyonlar solunum diyafram innerve frenik sinir gidiyor. Spinal kord dilimler halinde frenik motor nöronlar diğer motor nöronlar üzerinde morfolojik veya biyokimyasal ölçüt üzerinden tanımlanamıyor. Biz fare, bir fluorophore Birleşik kolera toksini alt birim beta (CTB) aşağıdaki intrapleural enjeksiyonu frenik motor nöron hücre gövdelerinde görüntülenmesi için yordamlar açıklamasını sağlar. Bu floresan nöroanatomik izleyici diyafram nöromüsküler kavşak yakalanmış, retrogradely frenik akson yapılacak ve frenik hücre cesetleri ulaşmak için yeteneği vardır. İntrapleural CTB teslimat iki metodolojik yaklaşım karşılaştırılır: Transtorasik iğne karşı transdiaphragmatic. Her iki yaklaşımın başarılı ve frenik motor nöronlar CTB etiketli benzer sayıda neden. Sonuç olarak, bu tekniklerin görselleştirmek veya bu diyafram frenik devre üzerinde duruldu gibi çeşitli deneysel çalışmalar frenik motor nöronlarda ölçmek için uygulanır.
Introduction
Çalışmanın amacı frenik motor nöronlar (PhMN) fare omurilik bölümlerinde tanımlamak için güvenilir bir yöntem sunmaktır. Bir floresan nöroanatomik izleyici plevral boşluğunda enjeksiyon frenik akson boyunca retrograd taşıma frenik hücre organları etiketlemek için kullanın ve frenik nöromüsküler projeksiyonlar üzerine diyafram ulaşmak için Teslimat yöntemi olarak seçildi. İntrapleural teslimat iki teknikleri açıklanmıştır: Transtorasik karşı transdiaphragmatic.
Frenik motor nöronlar olan akson sonuçta diyafram innervate frenik sinir yakınsama spinal geçiş hücrelerdir. Bu alt motor nöronlar inspiratory sürücü dan bulber solunum merkezlerinin alma ve diyafram sinir-kas kavşak (NMJ) geçişi vardır. PhMN içine iki motor sütun, bir Servikal Omurga çalışan her hemicord için yapılandırılmış. Memeli tür insanlar dahil çoğunda, frenik motor sütunları C3 düzeylerinden C61,2,3' e yaymak. Biz ve diğerleri PhMN C3-C5 düzeylerinde fare ve fare omurilik4,5,6,7,8yoğunlaşmıştır doğruladı. Topografik dağıtım frenik hücre değil rastgele; motor nöronlar krural bölümü innerve daha Kaudal (C5)9ise motor nöronlar diyafram göğüs parçası innerve daha yoğun frenik tamirhanede (C3), kafatası parçası olarak dağıtılır. Ayrıca, PhMN kümelenmiş değişik ventral boynuz bu gri konuda. C3 düzeyinde frenik hücre kümeleri yanal yalan, daha sonra ventrolateral bir yönde kayması ve en Kaudal düzeyleri10,,11ventromedially bulunur.
Kendi hayati rol ilham sırasında göz önüne alındığında, bu doğru bir şekilde PhMN sağlıklı omurilik tanımlamak ama Ayrıca dejeneratif hastalıklar veya omurilik travmatik yaralanmalar gibi patolojik koşulları sırasında kendi kaderini takip için son derece önemlidir. Beri morfolojik servikal diğer motorlu neurons PhMN farklı değildir, PhMN tanımlaması nöroanatomik izleyicileri ya düzeyinde birincil solunum merkezleri8, ya da diyafram NMJ7 ya da hedeflenen teslimini kullanır frenik sinir4. İzleyici sinir lifleri tarafından alınan ve Servikal Omurga frenik hücre gövdelerinde kadar yapılan doğrudan veya dolaylı tespit sistemleri kullanarak görüntülenmeyecektir nerede. Retrograd veya anterograd izleyiciler ticari geniş conjugates bir ile mevcuttur. Önemli, her izleyici no ile donatılmış olan trans sinaptik izleme için düşük veya yüksek yetenekleri.
Mevcut çalışmada, Alexa Fluor (bundan böyle CTB-fluorophore da adlandırılır) 555 ile functionalized kolera toksini (CTB) beta altünitesi floresan bir etiket olarak PhMN donmuş omurilik bölümlerinde doğrudan bir görselleştirme izin seçtik. Deneysel verilerin bir transneuronal geçit12göstermek eğiliminde olmasına rağmen CTB genellikle monosynaptic bir izleyici tanımlanır. CTB GM1 gangliosid sinir biten plazma zarı bağlamak için yeteneğine sahiptir. CTB clathrin bağımlı - bağımsız mekanizmaları ve trans-Golgi ağ üzerinden trafik üzerinden bir retrograd moda13,14endoplazmik retikulum içine içselleştirilmiş. İçselleştirilmesi ve retrograd taşıma bağımlı aktin sitoiskeleti15,16 yanı sıra Mikrotubul ağ17gibi görünüyor.
CTB kullanışlılığı diyafram-PhMN devresi etiketleme retrograd nöroanatomik izleme aygıtı olarak göstermek CTB-fluorophore intrapleurally teslim edildi. CTB yönetilen iki teknikleri kullanarak: İlki dahil laparatomi ve birden çok transdiaphragmatic iğneleri; İkincisi, daha az invazif bir benzersiz Transtorasik iğne kullanılır. Dört gün sonra fluorescently etiketli PhMNs servikal spinal kord her iki sağlıklı ve spinally yaralı (C4) hayvanlardan sayılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokol Avrupa Toplulukları Konsey direktifleri ile uyumlu hayvan için (2010/63/AB, 86/609/EEC ve 87-848/EEC) yapılan ve hayvan Etik Komitesi, üniversite Namur tarafından (etik proje n ° 17-284 kabul edildi ). Şekil 1 gösterir iki ilgili yaklaşımlar: transdiaphragmatic veya Transtorasik iğne. Erkek C57bl/6J fareler kullanın (n = 18), 4 ay çalışma 3 yaşında.
1. CTB çözüm hazırlanması
- Transdiaphragmatic enjeksiyon için:
- %0,2 (w/v) konsantrasyonu için steril su CTB iktidarda geçiyoruz.
- CTB çözüm (% 0,2 w/v) 7.5 µL bir steril 10-µL-microsyringe içinde her fare için ekli bir 33'lik iğne (künt veya kısa konik) yükleyin.
- Transtorasik enjeksiyon için:
- Steril su konsantrasyonu % 0.1 (w/v) CTB iktidarda geçiyoruz.
- CTB çözüm (% 0,1 w/v) steril bir 500-µl-insülin şırınga 20 µL eğimli 27 lik bir iğne her fare için yükleyin.
Not: distile ve steril su kullanmaya dikkat edin ve düzgün CTB toz geçiyoruz. Çözüm 4 ° C'de bir ay tutulabilir (değil dondurma). Birkaç gün sonra bir çökelti şeklinde. Çözüm oda sıcaklığına getirmek ve iyi bir pipet kullanmadan önce kullanarak karıştırın.
2. Intrapleural enjeksiyonu öncesinde hazırlık
- Otoklav veya cam boncuk Sterilizatör kullanarak ameliyat öncesi cerrahi .aletleri sterilize. Bir temiz tezgah kat ameliyatı yapmak ve cerrahi araçlar imha etmek hazırlamak.
Not: cerrahi işlem sırasında kullanılan herhangi bir malzeme steril olmalıdır. Microsyringe bir dezenfektan (klorheksidin) silmiş ya da olması gerektiği gibi sterilize cant araçlar tek sadece kullanımı. Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin bodur) ile onu/onun ellerini yıkamalısın. Cerrah steril eldiven, bir sağlamlılık ve temiz bir elbise giymek gerekir. - Hayvan tartmak ve anestezi uygun bir doz: anestezi kokteyl mayi enjeksiyon (örneğin ketamin 100 mg/kg ve xylazine 5 mg/kg).
- Ayak çimdik ve/veya fare düzgün anestezi olup olmadığını belirlemek için palpebral refleks kaybı için kontrol edin. Kornea korumak için bir veteriner merhem uygulamak.
- Dikkatle ventral cilt (için transdiaphragmatic yordam) veya elektrikli saç kesme makineleri kullanarak sağ taraflı göğüs cilde (Transtorasik yordam), tıraş. İyi ve yeterince geniş saç cerrahisi alanına alma önlemek için tıraş.
- Aseptik koşullar traş alan üzerinde % 10 iyot çözümün topikal uygulama tarafından emin olun. Cerrahi sitesi çevre doğru sitesinin Merkezi'nden fırçalayın için dikkatli olmak iyot solüsyonu ile fırçalayın.
- Hayvanın vücut ısısını korumak için ameliyat homeothermic takımını kullanın.
3. Intrapleural Transdiaphragmatic yaklaşımı kullanarak enjeksiyonları
- Bir Isıtma yastığı sırtüstü pozisyonda imzalat fare yatırmak. Hayvan boyun altında bir haddelenmiş gazlı bez yastık yerleştirin. Yetişkin bir fare için bir haddelenmiş gazlı bez takımını 0,5 inç kalınlığında kullanın. Hareket varsa önlemek için ameliyat yönetim kurulu bu yastık teyp.
- Bir neşter bıçak kullanarak deşmek orta çizgi boyunca ventral Cilt: deri gerin için yanal diğer el ile cilt germe sırasında xiphoid işleminden göbek bölgesine bir kesi yapmak. Çok fazla baskı üzerinde bıçak temel organlara zarar görmesini önlemek için geçerli değildir.
- Küçük makas kullanırken, dikkatle cilt kesi çevresinde karın kasları bağlantısını kesin. Bu yordam, kasları ve ameliyat sonunda ayrı deri dikiş yardımcı olur.
- Laparotomi küçük makas kullanarak gerçekleştirin. Karın boşluğu bir ilik kesi abdomenden düzeyde gerçekleştirerek açın. Beyaz hattı boyunca karın kasları deşmek ("linea alba") xiphoid süreci kadar.
- Diyafram karın yüzeyine görselleştirmek için karın kasları ticari veya ev yapımı traktör kullanarak geri çek.
Not: Bu makaralara MIDI-boyut ataç L-kanca19şeklinde yapılabilir. - Laparotomi ve bantlar makaralara tezgah kat için aşağı her iki uzatmayayeltenmişti. Görüş alanı aydınlatma diyafram karın yüzeyine penumbra içinde daha fazla en iyi duruma. Bu amaçla en güçlü aydınlatma aygıtının yönlendirilebilir bir ışık demeti ile LED Lamba vardır.
- Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldırın ve karaciğer (şekil 2A) yan lobları çekin. Diğer elinde küçük makas kullanırken dikkatle kesin suspensory bağ safra kesesi veya diyafram (şekil 2B) zarar vermeden.
- Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldır. Öte yandan Hamilton şırıngada kavramak. Üç siteleri değil hemidiyafram sırasıyla sternal, kapsayacak şekilde yerleştirmeye medial ve krural bölgeler (şekil 3A,) şekil 3B' iç metin hedef.
- Diyafram kalınlığı 0.37 mm fareler7civarında, iğne en fazla 1 veya 2 mm ötesinde sırasında nefes akciğer zararları önlemek için diyafram sayfası eklemek. 2.5 µL CTB çözüm (% 0,2 w/v), her sitede (şekil 4B) doğru diyafram aracılığıyla teslim. Diyafram istikrar gerekli değildir.
- Üç Ipsilateral siteleri enjeksiyon (şekil 1A) ve contralaterally bir ikili PhMN havuzu etiketleme için bu yordamı yineleyin.
- Laparotomi sitesini kapatmak için 4-0 dikiş karın kasları ile tekrar Emilebilen dikiş. Kesintiye uğramış dikiş 3 mm. tarafından elyaf cilt aralıklı kullanım 9.0 mm yara klipleri ile kapalı. Zımba zımba çekerek hayvan önlemek için sıkın. Alanı yaklaşık 5 mm ayrı zımba. Bu Engelli şifa için açabilir gibi yara klipler, aşırı sıkın değil.
- Temiz mikro şırınga tıkanma distile su ile. Yavaş yavaş çizme ve sınırdışı 2 - 3 kez. Hava şırınga çekiyor mu.
4. Intrapleural Transtorasik yaklaşımı kullanarak enjeksiyon
Not: Bu yöntem fareler4 ' te açıklanan yordamı gelen ilham ve fare için uyarlanmıştır.
- İmzalat fareyi sol yanal dekübitus getirin, bir Isıtma yastığı (şekil 4A) yatırmak.
- Altıncı ve yedinci kaburga dirsek bölgesi altında el ile palpasyonla (şekil 4B) tanımlayın.
- Asistan sağ ön ve arka bacaklarda (şekil 5A) genişletir iken, şırınga cranially odaklı ve yüzeysel altıncı veya yedinci kaburga, 3 mm derin (şekil 1B ve şekil 5B) aşağı eğim ile deri altında yerleştirin.
- Yavaşça, kaburgaları kaldırarak bu iyi göğüs boşluğuna (şekil 5C, insets içinde şekil 1B) içine konumlandırılmış onaylamak için iğne yükseltmek.
- Göğüs duvarı üzerinde iki parmak ile hafif basınç uygulayarak göğüs hareketleri nefes stabilize etmek.
- Şırınga diğer elinde tutarak, tek bir enjeksiyon CTB çözüm (% 0,1 w/v) 20 µL teslim.
5. ameliyat sonrası bakım
- İşlemden sonra hemen, fareyi sağ yanal dekübitus pozisyonda kurtarma için homeothermic bir yastık üzerinde yatıyordu. Bu plevral boşluğu sağ tarafta yayıldı izleme sağlar ve hayvanın nefes izlenmesi için izin verir.
- 1 mL steril serum fizyolojik çözüm ı.p. subkutan yönetmek. Hayvan susuz ve/veya ilgisiz görüntülenirse takip enjeksiyon sağlar.
- Subkutan 0.1 mg/kg buprenorfin, yönetmek herhangi bir potansiyel ağrı en aza indirmek için ilk iki gün sonrası ameliyat sırasında günde iki kez.
Not: Birçok kurum multimodal analjezi burada tasvir laparotomi gibi invaziv prosedürler için tavsiye ederim. Bu bir non-steroid anti-enflamatuar (NSAİİ) ilaç ve/veya lokal anestezik Ajan kesi yerinde kullanımı içerebilir. Bu ilaçlar genellikle kurmalı ağrı en aza indirmek için belgili tanımlık ilk kesme önce teslim edilir. - Hayvanlar her gün ötenazi kadar izlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erkek C57bl/6J fareler (n = 18), 4 ay 3 yaşlı çalışmaya dahil edildi. Denemenin gün 0, 8 fareler yayımlanmış protokolü7,18göre bir tek taraflı C4 kontüzyonu, sağ taraflı uygulandı. Sham prosedür olarak C4 üzerine bir laminektomi kontüzyonu olmadan 10 fareler uygulandı. Gün 3, fareler CTB-fluorophore intrapleural enjeksiyonu için yukarıda açıklanan iki farklı yordamlara göre hazırlanmıştır. Gün 7, tüm fareler anestezi euthanized (ketamin 100 mg/kg ve xylazine 5 mg/kg) ve kan kaybı.
Bütün spinal kordonlar, paraformaldehyde ve cryoprotected içinde % 30 Sükroz standart laboratuvar yordamlara göre sabit hasat edildi. Servikal genişleme, O.C.T. ve cryosectioned boyuna veya transversally 30 µm kalınlığında katıştırılmış izole edildi.
Uzunlamasına omurga bölümleri Floresans analiz için filtre küp ile donatılmış bir epifluorescent mikroskobu ile gözlendi (uyarma: 560/20nm; Emisyon: 635/30nm). Ventral boynuz floresan motor nöronlarda doğrusal sütun C3 hücre C5 düzeyleri (şekil 6A, üst panel) olarak tespit edilmiştir. Tüm etiketli hücreleri Ipsilateral bu gri konuda bulunmaktaydı ve Morfoloji (şekil 6B) motor nöronlar ile tutarlı sergiledi. Yaralı hayvanlarda etiketli PhMN çarpıcı bir kaybı ile birlikte spinal doku bozulması (yıldız şekil 6A ve 6 C) C4 düzeyde gözlenmiştir. CTB+ PhMNs el ile (150 µm tarafından aralıklı) her beşinci enine bölümünde zarar görmemiş ve C4 yaralı spinal kabloları (şekil 6C) sayıldı. Bir tahmini etiketli PhMNs toplam sayısı 5 tarafından sayılan CTB+ hücre sayısı çarpılarak hesaplanır. Zarar görmemiş sağlıklı farelerde etiketli PhMNs hemicord başına toplam sayısı 151 ± 9 transdiaphragmatic (TDia) yaklaşım, 178 ± 9 Transtorasik (TTho) yaklaşımı (şekil 6D) kullanarak karşılaştırıldığında kullanırken tahmin edilmiştir. C4 yaralanma bu rakamlar sırasıyla 59 14 ve 70 ± ± 10 düştü. Bu çalışmada, intrapleural teslim iki yöntem arasında istatistiksel fark kanıtlanan (p > 0,05, Mann-Whitney U testi; TDia TTho karşı).
Şekil 1. Transdiaphragmatic veya Transtorasik iğne kullanarak Intrapleural enjeksiyonları. Transdiaphragmatic yaklaşımı laparatomi, pozlama diyafram (pembe renkte) karın yüzey ve üç iğne göğüs, medial ve krural bölgelerde Aiçerir. Transtorasik yaklaşım için fareyi sol yanal dekübitus bulunduğu atıldı. Altıncı ve yedinci kaburga altında dirsek bölgesi manuel palpasyonla Btarafından tanımlanır. İğne deri, subkutan doku, göğüs kasları, interkostal kaslara ve plevral boşluğu (Asteriks) ulaşmak için parietal plevra eklenir. Lar, göğüs; m, medial; c, krural; S/SC, deri ve subkutan doku; TM, göğüs kasları; IC, interkostal kaslara; PP; parietal plevra; L, akciğer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Karaciğer, safra kesesi ve diyafram karın karşısında bir görünüm ile cerrahi alan. A. safra kesesi ve diyafram arasında suspensory bağ unutmayın. B. belgili tanımlık kiriş dikkatli bir şekilde kesilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Görünümü diyafram '. Sternum (s), medial (m) ve krural (c) alanlarında doğru hemidiyafram tanımlanır. A. krural bölge için karaciğer LOB posterior olduğuna dikkat edin. B. CTB plevral boşlukta enjekte için iğne 1 mm sağ hemi-diyafram ile derin ekleyin. Orta alanda enjeksiyon olduğunu resimli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Transtorasik yaklaşım. Fare sol yanal dekübitus Aiçinde yer alıyor. Diyafram ve dirsek bölgesi kostal marjı tanımlayın. B. altıncı ve yedinci interkostal boşluk derin dirsek bölgesine tanımlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Altıncı ve yedinci interkostal boşluk derin dirsek bölgesine tanımlanır. A. genişletilmiş ön ve arka bacaklarda. B. şırınga cranially odaklı ve yüzeysel altıncı veya yedinci kaburga, 3 mm eğim ters ile interkostal kasları ile derin altında eklenmiş. C. iğneyi yavaşça yükselmiş ve kaburga iğne göğüs boşluğuna iyi konumlandırılmış onaylamak için kalkar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Ventral boynuz gri madde intrapleurally enjeksiyonlu fare hücrelerinde CTB+ . A. spinally yaralanmamış fare, C5 için servikal spinal kord düzeyinde C3 gelen boyunca CTB+ frenik motor nöronlar dağıtın. Berelenmiş fare, doku bozulması CTB+ frenik motor nöronlar C4 düzeyinde (Asteriks) kaybı ile tek taraflı olarak görülmektedir. B. CTB+ etiketli hücreleri Ipsilateral bu gri konuda bulunmaktaydı ve Morfoloji motor nöronlarile tutarlı sergiledi. C. spinal iplerden transvers kesitler CTB+ hücreleri zarar görmemiş (sol) ve yaralı (sağda) fareler spinal kord boyunca belirli mesafelerde ölçmek için kullanılmıştır. Ö. CTB miktar+ hücre transdiaphragmatic (TDia) veya intrapleural CTB teslimat Transtorasik (TTho) yaklaşım göre zarar görmemiş ya da yaralı farelerde Ipsilateral hemicord bulundu. Çubukları temsil 250 µm. veri (SEM) ortalama ortalama ± standart hatasını ifade. n = 5-7 fareler her TDia grubunda; n = 3 fareler her TTho grup. Sigara Lameller Mann-Whitney U testi gerçekleştirilen ve sonuçları kabul kadar önemli ölçüde farklı p için < 0,05. p < 0,001 için C4 yaralanma karşı yaralanmamış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol yetişkin fareler herhangi bir zorlanma veya diyafram-PhMN devresi bütünlüğünü değerlendirilmelidir deneysel herhangi bir paradigma için uygulanabilir. Örneğin, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve servikal Medulla Spinalis Yaralanmalarında (CSCI) PhMN kaybı, frenik akson ve sonraki solunum uzlaşma anterograd dejenerasyonu ile ilişkilendirilmiş koşullardır. ALS veya CSCI hayvan modelleri insan hastalıkları gözlenen histopatolojik ve fonksiyonel solunum açıkları taklit. Bu modellerinde, histolojik teknikler genellikle PhMN hayatta kalma şu PhMN neuroprotection18,20,21, yönelik çeşitli tedavi müdahaleler değerlendirmek için uygulanır. Herhangi bir sorun alımı, NMJ diyafram veya aksonal transport şüphesiz CTB nöronal hücre gövdelerinde birikmiş miktarını tehlikeye sokacaktır. Frenik aksonlar veya PhMN dejenerasyon kaybı belli ki omurilik CTB retrotransported miktarını azaltacaktır.
Her bir yaklaşım intrapleural idarenin kendi artıları ve inşaat Transdiaphragmatic enjeksiyonları laparotomi ve dikkatli yırtılması ve organ çıkıntı önlemek için tüm deri katmanları dikiş gerektiren oldukça invaziv vardır. Laparotomi ile normal solunum22 engelleyen ve bir PhMN aktivite veya retro-aktarım verimliliği etkileyebilir göz ardı edemeyiz. Ancak, diyafram doğrudan görselleştirme enjeksiyon sırasında başarılı plevral boşluğu her zaman hedefleme sağlar. Transtorasik iğne transdiaphragmatic enjeksiyonu için göre minimal invaziv ve böylece bir prosedür olarak arıtma için "Üç Rs" kavramı ven düşünülebilir. Bir dezavantajı olma artış olasılığı kapalı-hedef bir deneyimsiz kullanıcı için (örneğin subkutan doku veya göğüs duvarı).
İntrapleural floresan CTB yönetim herhangi bir motor nöron plevral boşluğu astar kaslar projelendirme, PhMN, interkostal motor nöronlar veya beyin sapı motor nöronların farklı topluluklarda da dahil olmak üzere etiketi olur ki olasıdır. De yetişkin, fareler, Mantilla vd. interkostal motor nöronlar da torasik spinal kord yanı sıra bazı dorsal kök gangliyon nöronlar4ventral boynuz etiketli gösterdi. Biz asla CTB etiketli hücreleri servikal spinal kord farelerde daha diğer sitelerdeki varlığı kontrol ettirin.
Bağlı olarak deneysel ayarları/modeller, sonuç ölçümleri PhMNs sütunlu yerleşimi boyunca servikal spinal kord, geometrik veri her PhMN konumu hakkında ayrıntılı çözümlemesi içerebilir veya, burada, PhMN miktar olarak açıklanan numarası. Toplam PhMN sayısı doğru değerlendirilmesi teknik konuları ve arası değerlendirici güvenilirlik bağlıdır; CTB floresan yoğunluğu, nöron soma boyutu veya arka plan boyama değişkenlik nedeniyle. Transdiaphragmatic enjeksiyonu CTB-fluorophore kullanarak deneyim, biz fare hemicord 120 ve 180 hücreler, biraz daha az veri diğer grupları8daha bir dizi arasında bir aralıktaki başına PhMN sayısı tahmini. Gerçekten de, çalışmanın iki sınırlamalar vardır. İlk olarak, sınırlı sayıda hayvan, Transtorasik yaklaşımı kullanarak enjekte edilir ve ikinci bir belirsizlik PhMN havuzu tam etiketleme var. (Sonra sinir transeksiyon) frenik sinir daldırma veya floresan nöroanatomik izleyici ile intraneural enjeksiyonları tüm PhMNs daha doğru bir şekilde etiketlemek için kullanılan tamamlayıcı teknikler vardır. Gelecekteki çalışmaları için bu PhMNs saymak için stereology gibi tarafsız yöntemler tarafından tavsiye edilir.
Deneyim, biz asla herhangi bir bariz solunum eksikliği ya da karışıklık (solunum) kanama veya aşağıdaki yordamı pnömotoraks gibi gözlemledim. Ancak, diyafram transdiaphragmatic enjeksiyon sırasında zarar görmüş bir iğne daha küçük çaplı veya daha net eğim ile kullanmaya dikkat edin.
Hayvan ölüm sırasında veya ameliyat sonrası önlemek için dikkatli kokteyl anestezi her bileşenin konsantrasyonları kontrol. Karaciğer, bağırsak, safra kesesi veya diyafram yüzeylerin üzerine yaralanmaları yapmaktan kaçının.
Hayır ya da düşük PhMN etiketleme çeşitli sorunları nedeniyle olabilir. Transtorasik enjeksiyon plevral boşluğu kaçırırsa, yeniden yapmak ve kontrol tarafından el ile palpasyonla iğne kaburga altında eklenir veya yok dışarı deri yoluyla açılır. Hava kabarcığı yok CTB çözüm enjeksiyon oluşturmalıdır. Ayrıca sinir hücresindeki CTB içselleştirilmesi pH bağımlı23olan hatırlıyorum: asidik ve nötr pH en uygun temel pH toksin alımını azaltır iken. Bu CTB tozu su, tuz veya PBS arabellek resuspend için tavsiye edilir. Sebat sürenin nöronal hücre vücuttaki etiketli toksini. Deneyim, bir zaman penceresi dört gün ve iki hafta sonra intrapleural teslim arasındaki hücrelerde CTB etiketli tespit olabilir. Taşıma retrograd için ayrılan süreyi kısaltır veya zaman intrapleural teslimat ve kurban arasındaki artan floresan-CTB doku optimal algılama tehlikeye atabilir.
Önlemek için solma Floresans uygun sabitleştirici yöntemini kullanın. Biz hayvanın vücut tamponlu %4 paraformaldehyde ile Ventriküler öneririz. Bir kez omurilik hasat edilir, aynı sabitleştirici gecede kuluçkaya. Cryoprotect kablosu batan kadar 72 saat boyunca Sükroz % 30 çözümde sonra O.C.T. orta servikal büyütme (yaklaşık 8 mm) gömün. Kurutmak veya örnek parafin içinde gömmek değil. Omurilik örnekleri veya doku bölümleri ışıktan bütün sonrası işleme sırasında koruma. Sabit bütün spinal kordonlar saklamadığını 4 ° C'de aylardır thimerosal cryoprotectant çözüme eklenir mı (floresan solma tahrik edecek gibi sodyum azid eklemeyin). Doku bölümler-20 ° C'de ay ışıktan uzak tutulabilir. Son olarak, bir anti-solma reaktif slaytlarla takmak için tavsiye ederiz. Floresans soluk olan ise, immünhistokimya kullanarak CTB algılamak mümkün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Teknik destek için Robert Graffin ve Pauline Duhant için sana şükrediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
