Summary
Aquí, describimos un protocolo para la identificación de las neuronas de motor frénicas en ratones después entrega intrapleural de fluoróforo conjugada beta de la subunidad de la toxina de cólera. Se comparan dos técnicas para inyectar en la cavidad pleural: transdiaphragmatic versus enfoques transtorácicos.
Abstract
Neuronas motoras frénicas son las neuronas de motor cervicales origina de C3 a C6 niveles en especies de mamíferos más. Proyecciones axonales convergen en nervios frénicos que inervan el diafragma respiratorio. En cortes de médula espinal, las neuronas de motor frénicas no puede ser identificadas desde otras neuronas del motor en criterios morfológicos o bioquímicos. Ofrecemos la descripción de procedimientos para la visualización de cuerpos celulares de neuronas motoras frénicas en ratones, siguiente inyección intrapleural de cólera toxina subunidad beta (CTB) conjugado con un fluoróforo. Este trazador fluorescente neuroanatomical tiene la capacidad de ser cogido para arriba en la Unión neuromuscular del diafragma, retrogradely a lo largo de los axones frénicos y llegar a los cuerpos celulares frénicos. Se comparan los dos enfoques metodológicos de la entrega CTB intrapleural: transdiaphragmatic versus inyecciones transtorácicas. Ambos métodos son exitosos y resultan en similar número de neuronas de motor frénicas CTB-labeled. En conclusión, estas técnicas pueden ser aplicadas para visualizar o cuantificar las neuronas motoras frénicas en varios estudios experimentales como los que se centra en los circuitos de frénico diafragma.
Introduction
El objetivo del estudio es presentar un método confiable para identificar las neuronas motoras frénicas (PhMN) en las secciones de la médula espinal de ratón. Inyección de un trazador fluorescente neuroanatómicas en la cavidad pleural fue elegida como el método de entrega para alcanzar las proyecciones neuromusculares frénicas hacia el diafragma y utilizar transporte retrógrado a lo largo de los axones frénicos a frénicos cuerpos celulares de la etiqueta. Se describen dos técnicas de entrega intrapleural: transdiaphragmatic versus transtorácico.
Frénico las neuronas motoras son las células espinales relé cuyos axones convergen en los nervios frénicos, que en última instancia inervan el diafragma. Estas son las neuronas motoras inferiores reciben la impulsión inspiratoria de los centros respiratorios bulbares y retransmisión a las uniones neuro-musculares del diafragma (NMJ). PhMN se estructuran en dos columnas motor, uno para cada hemicord, a lo largo de la mediados de-cervicales de la espina dorsal. En la mayoría de especies de mamíferos incluyendo a seres humanos, las columnas motor frénicas separada de niveles C3 a C61,2,3. Nosotros y otros hemos confirmado que PhMN concentrados en los niveles de C3-C5 en rata y ratón de la médula espinal4,5,6,7,8. La distribución topográfica de las células frénicas no es al azar; las neuronas motoras que inervan la parte esternal del diafragma están distribuidas más densamente en la parte craneal de la piscina de motor frénica (C3), mientras que las neuronas motoras que inervan la parte crural son más caudal (C5)9. Además, PhMN se agrupan vario en el cuerno ventral gris materia. Nivel C3, los racimos de células frénicos se encuentran lateralmente, luego que se muevan en una dirección ventrolateral e iliacos se encuentran en la más caudal niveles10,11.
Dado su papel vital durante la inspiración, es de suma importancia para identificar con precisión PhMN en la médula espinal sana pero también seguir su destino durante condiciones patológicas, tales como enfermedades degenerativas o lesiones traumáticas de la médula espinal. Desde PhMN no difieren morfológicamente de otras neuronas motoras cervicales, identificación de PhMN se basa en la entrega específica de neuroanatomical marcadores ya sea a nivel de centros respiratorios primarios8, o en el diafragma NMJ7 o en el nervio frénico4. El palpador es tomado por las fibras nerviosas y llevaron hasta el frénicos cuerpos celulares en la columna cervical, donde pueden visualizarse utilizando sistemas de detección directa o indirecta. Retrógrada o anterógrada trazadores son comercialmente disponibles con una amplia gama de conjugados. Notable, cada indicador está dotado no, bajas o altas capacidades seguimiento sináptica trans.
En el estudio actual, hemos elegido la subunidad beta de la toxina del cólera (CTB) funcionalizada con Alexa Fluor 555 (en adelante denominado CTB-fluoróforo) como una etiqueta fluorescente, que permite una visualización directa de PhMN en secciones congeladas de la médula espinal. CTB se describe generalmente como un trazador monosynaptic, aunque datos experimentales tienden a mostrar un paso transneuronal de12. CTB tiene la capacidad de enlazar el gangliósido GM1 en la membrana plasmática de la terminación nerviosa. CTB es internalizado a través clathrin-dependiente - independiente o mecanismos y transitan por la red trans-Golgi en el retículo endoplásmico en una manera retrógrada13,14. La internalización y el transporte retrógrado parecen ser dependiente en el citoesqueleto de actina15,16 , así como en la red de microtúbulos17.
Para demostrar la utilidad de la CTB como trazador neuroanatomical retrógrada etiquetado diafragma PhMN circuitos, CTB-fluoróforo entregaron intrapleural. CTB se administró dos técnicas: la primera de ellas incluye una laparotomía y múltiples inyecciones transdiaphragmatic; el segundo, menos invasiva, utiliza una única inyección transtorácica. Cuatro días más tarde, marcada con fluorescencia PhMNs fueron cuantificados en la médula espinal cervical, tanto de sanos y de animales (C4) spinally heridos.
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Protocol
El protocolo experimental se llevó a cabo en cumplimiento de las directivas de Consejo de las comunidades europeas para experimento de Animal (2010/63/UE, 86/609/CEE y 87-848/CEE) y fue aprobado por el Animal ética Comité de la Universidad de Namur (ética proyecto n ° 17-284 ). La figura 1 muestra los dos enfoques respectivos: transdiaphragmatic o inyecciones transtorácicas. Utilizar ratones C57bl/6J machos (n = 18), edad de 3 a 4 meses en el estudio.
1. preparación de solución de CTB
- Para transdiaphragmatic inyecciones:
- Disolver el poder de la CTB en agua estéril a la concentración de 0.2% (p/v).
- Carga 7.5 μl de solución de CTB (0.2% w/v) en un 10-μl-microjeringa estéril con una aguja de calibre 33 fija (bisel embotado o corta) para cada ratón.
- Para inyección transtorácica:
- Disolver el poder de la CTB en agua estéril a la concentración de 0.1% (p/v).
- Carga 20 μl de solución de CTB (0,1% p/v) en una jeringa estéril de 500 μl de insulina con una aguja de calibre 27 biselada para cada ratón.
Nota: Asegúrese de usar agua destilado y estéril y disolver bien el polvo CTB. La solución puede conservarse a 4 ° C durante un mes (no congelar). Puede formar un precipitado después de pocos días. Llevar la solución a temperatura ambiente y mezclar con una pipeta antes de su uso.
2. preparación antes de la inyección Intrapleural
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía, uso de Esterilizador autoclave o bolas de cristal. Preparar una capa de banco limpio de realizar la cirugía y a disponer de las herramientas quirúrgicas.
Nota: Cualquier material utilizado durante el procedimiento quirúrgico debe estar estéril. Instrumentos que no pueden ser esterilizados como la microjeringa debe limpiarse con un desinfectante (clorhexidina) o se debe usar una única. El cirujano debe lavar sus manos con un desinfectante (clorhexidina scrub) antes del comienzo de la cirugía. El cirujano debe usar guantes estériles, una máscara y una bata limpia. - Peso animal y administrar una dosis adecuada de anestesia: inyección intraperitoneal de anestésico cóctel (p. ej. ketamina 100 mg/kg y xilacina 5 mg/kg).
- Pellizque el dedo del pie o Compruebe la pérdida de reflejo palpebral para determinar si el ratón correctamente está anestesiado. Aplique un ungüento veterinario para proteger la córnea.
- Cepille con cuidado la piel ventral (para transdiaphragmatic procedimiento) o la derecha torácica piel (para procedimiento transtorácico), utilizando podadoras de pelo eléctricas. Cepille bien y suficientemente amplia para evitar que el pelo en el campo de la cirugía.
- Asegurar condiciones de asepsia por aplicación tópica de solución de yodo 10% en el área depilado. Limpiar el sitio quirúrgico con solución de yodo, cuidando de limpiar desde el centro del sitio hacia la periferia.
- Use una almohadilla homeotérmicos a lo largo de la cirugía para mantener la temperatura corporal del animal.
3. Intrapleural inyecciones usando acercamiento Transdiaphragmatic
- Colocar el ratón anestesiado en posición supina sobre una almohadilla de calefacción. Colocar una gasa enrollada debajo del cuello del animal. Para un ratón adulto, utilice una gasa enrollada de 0,5 pulgadas de espesor. La cinta esta tecla a la Junta de cirugía para evitar el movimiento eventualmente.
- Usando una hoja de bisturí, haga una incisión en la piel ventral a lo largo de la línea media: hacer una incisión desde el proceso xifoides a la región umbilical mientras estira la piel lateralmente con la otra mano para hacer la piel tensa. No aplique demasiada presión sobre la cuchilla para no dañar órganos subyacentes.
- Con unas tijeras pequeñas, cuidadosamente separe la piel de los músculos abdominales alrededor de la incisión. Este procedimiento ayudará a coser los músculos y la piel aparte al final de la cirugía.
- Realizar laparotomía con unas tijeras pequeñas. Abrir la cavidad abdominal mediante la realización de una incisión de ojal a nivel del ombligo. Haga una incisión en los músculos abdominales a lo largo de la línea blanca ("linea alba") hasta el proceso del xiphoid.
- Para poder visualizar la superficie abdominal del diafragma, retraer músculos abdominales usando retractores comerciales o caseros.
Nota: Estos retractores pueden hacerse de tamaño midi clips de papel en forma de gancho en L19. - Se extienden a ambos lados de la cinta hacia abajo de los retractores para la capa de banco y laparotomía. Optimizar la iluminación del campo de visión de modo que la superficie abdominal del diafragma no es más en la penumbra. El más de gran alcance dispositivo de iluminación para este propósito es una lámpara LED con un haz de luz orientable.
- Con suaves pinzas en una mano, levante el apéndice de la xyphoid y tire hacia abajo de los lóbulos laterales del hígado (figura 2A). Con pequeñas tijeras en la otra mano, cuidadosamente cortado el ligamento suspensorio, sin dañar la vesícula biliar o el diafragma (figura 2B).
- Con suaves pinzas en una mano, levante el apéndice de la xyphoid. Sujete la jeringa Hamilton en la otra mano. Objetivo tres sitios de la inyección en el hemidiaphragm correcto para cubrir respectivamente la esternal, la medial y las regiones crurales (Figura 3A, la inserción en la figura 3B).
- Como el espesor de la membrana alrededor de 0,37 mm en ratones7, inserte la aguja no más de 1 o 2 mm más allá de la hoja del diafragma para evitar daños de pulmón durante la respiración. Entregar 2.5 μl de solución de CTB (0.2% w/v) a través del diafragma derecho en cada sitio (Figura 4B). Estabilización de la membrana no es necesario.
- Repita este procedimiento para los tres sitios ipsolaterales de la inyección (figura 1A) y contralateral para un etiquetado bilateral de la piscina PhMN.
- Para cerrar el sitio de laparotomía, la sutura los músculos abdominales con reabsorbible sutura 4-0. Uso interrumpidos puntadas espaciadas por 3 mm. piel de grapa cerrada con clips de 9,0 mm de la herida. Apretar las grapas para evitar que el animal tira de grapas. Espacio grapas aproximadamente 5 mm de separación. No apriete demasiado los clips de la herida, esto puede llevar a cicatrización deteriorada.
- Limpieza micro jeringa con agua destilada para evitar impurezas. Poco a poco elaborar y expulsar a 2 - 3 veces. No introducir aire en la jeringa.
4. Intrapleural inyección usando acercamiento transtorácico
Nota: Este método está inspirado en el procedimiento descrito en ratas4 y fue adaptado al ratón.
- Colocar el ratón anestesiado en posición de decúbito lateral, sobre un cojín de calefacción (Figura 4A) de la izquierda.
- Identificar las costillas sexta y séptima en la región del codo mediante palpación manual (Figura 4B).
- Mientras que un ayudante se extiende derecho delantero - y -extremidades posteriores (figura 5A), inserte la jeringa cranially y orientada tangencialmente en la sexta o la séptima costilla, 3 mm de profundidad de la piel con el bisel hacia abajo (figura 1B y figura 5B).
- Elevar la aguja suavemente para confirmar, levantando las costillas, que está bien posicionada en la cavidad torácica (figura 5, inserciones en la figura 1B).
- Estabilizar los movimientos del tórax la respiración aplicando ligera presión con dos dedos en la pared torácica.
- Sosteniendo la jeringa en la otra mano, entregar 20 μl de solución de CTB (0,1% p/v) en una sola inyección.
5. postoperatorio cuidado
- Inmediatamente después del procedimiento, coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho en una plataforma para la recuperación de homeotérmicos. Esto asegura el palpador para untar en la parte derecha de la cavidad pleural y permite la monitorización de la respiración del animal.
- Administrar por vía subcutánea 1 mL de solución salina estéril intraperitoneal. Proporcionar seguimiento inyecciones si el animal aparece deshidratada y apática.
- Administrar por vía subcutánea 0,1 mg/kg de buprenorfina, dos veces al día durante los primeros dos días después de la cirugía, para reducir al mínimo cualquier dolor potencial.
Nota: Muchas instituciones recomendaría multimodal analgesia para procedimientos invasivos, como la laparotomía representado aquí. Esto puede incluir el uso de un no esteroides anti-inflamatorios (AINE) o un agente anestésico local en el sitio de la incisión. Estos medicamentos típicamente se entregan antes de la primera incisión para minimizar el dolor de la cuerda. - Seguimiento de animales todos los días hasta la eutanasia.
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Representative Results
Ratones C57bl/6J machos (n = 18), edad de 3 a 4 meses se incluyeron en el estudio. En el día 0 del experimento, 8 ratones experimentaron una contusión unilateral de C4, lado derecho, según el protocolo publicado7,18. Como procedimiento simulado, 10 ratones experimentaron un laminectomy encima de C4 sin contusión. En el día 3, ratones fueron preparados para la inyección intrapleural de CTB-fluoróforo según los dos procedimientos diferentes descritos anteriormente. En el día 7, todos los ratones fueron sacrificados después de anestesia (ketamina 100 mg/kg y xilacina 5 mg/kg) y la exsanguinación.
Se cosecharon todo médulas espinales, fijadas en paraformaldehido y cryoprotected en sacarosa al 30% según procedimientos de laboratorio estándar. Ampliación cervical fue aislada, encajado en la O.C.T. y cryosectioned longitudinalmente o transversalmente a un espesor de 30 μm.
Secciones longitudinales de la columna vertebral se observaron con un microscopio epifluorescente equipado con cubos de filtro para análisis de fluorescencia (excitación: 560/20nm; Emisión: 635/30nm). Fluorescente las neuronas motoras en el cuerno ventral se identificaron como una columna lineal de células de C3 a C5 los niveles (figura 6A, panel superior). Todas las células marcadas fueron localizadas en la materia gris ipsolateral y exhibieron morfología compatible con las neuronas motoras (Figura 6B). En animales heridos, se observó una pérdida llamativa de etiquetado PhMN nivel C4, junto con la interrupción del tejido espinal (asterisco en la figura 6A y 6C). CTB+ PhMNs fueron contados manualmente cada sección transversal Quinta (espaciado por 150 μm) en médulas espinales lesionadas y lesionados de C4 (figura 6). Una estimación del número total de etiquetado PhMNs se calculó multiplicando el número de células contadas de CTB+ por 5. En ratones sanos ileso, el número total de etiquetado PhMNs por hemicord se estimó en 151 ± 9 cuando se utiliza el acercamiento transdiaphragmatic (TDia), en comparación con 178 ± 9 cuando se utiliza el acercamiento transtorácico de (TTho) (figura 6). Tras lesión de C4, estas cifras bajaron respectivamente a 59 14 y 70 ± 10. En este estudio, no se evidencia diferencias estadísticas entre los dos métodos de entrega intrapleural (p > 0,05, prueba U de Mann-Whitney; TDia versus TTho).
Figura 1. Intrapleural inyecciones usando inyecciones transtorácicas o transdiaphragmatic. Acercamiento transdiaphragmatic incluye una laparotomía, la exposición de la superficie abdominal del diafragma (en color rosa) y tres inyecciones en las regiones esternales y mediales crurales A. Para acercamiento transtorácico, el ratón se coloca en posición decúbito lateral izquierdo. Las costillas sexta y séptima son identificadas en la región del codo mediante palpación manual B. La aguja se inserta a través de la piel, tejido subcutáneo, la musculatura torácica, los músculos intercostales y la pleura parietal hacia la cavidad pleural (Astérix). S, esternal; m, intermedio; c, crural; S/SC, la piel y tejido subcutáneo; TM, los músculos torácicos; IC, músculos intercostales; PP; pleura parietal; L, pulmón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Campo quirúrgico con una opinión sobre hígado, vesícula biliar y la cara abdominal del diafragma. A. Nota del ligamento suspensorio entre la vesícula biliar y el diafragma. B. el ligamento es cortado con cuidado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Vista en el diafragma. La esternal (s), intermedio (m) y crurales (c) áreas se identifican en el hemidiaphragm correcto. A. nota que la región crural es posterior a los lóbulos del hígado. B. para inyectar el CTB en el espacio pleural, introducir la aguja de 1 mm de profundidad a través del hemi-diafragma derecho. La inyección en el área medial es ilustrado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Acercamiento transtorácico. Ratón se coloca en decúbito lateral izquierdo A. Identificar el margen costal de la membrana y la región del codo. B. los espacios intercostales sexto y séptimo se identifican profundamente a la región del codo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Los espacios intercostales sexto y séptimo se identifican profundamente a la región del codo. A. extremidades delantera y traseras son extendidos. B. la jeringa es cranially orientada y tangencialmente se inserta debajo de la sexta o la séptima costilla, 3 mm de profundidad a través de los músculos intercostales, con el bisel al revés. C. la aguja está ligeramente elevada y las costillas se levantan para confirmar que la aguja está bien posicionada en la cavidad torácica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Células CTB+ en el cuerno ventral de la materia gris de ratones inyección intrapleural. A. en ratón spinally ileso, las neuronas motoras frénicas CTB+ distribuir a lo largo de la médula espinal cervical de nivel C3 a C5. En ratón contusionado, interrupción de tejido se observa unilateralmente con la pérdida de las neuronas de motor frénicas CTB+ a nivel de C4 (Astérix). B. las células etiquetadas CTB+ se encontraban en la materia gris ipsolateral y exhibieron morfología compatible con las neuronas motoras. C. secciones transversales de médulas espinales fueron utilizadas para cuantificar el número de células CTB+ a distancias específicas a lo largo de la médula espinal en ileso (izquierda) y ratones (derecha) lesionados. D. células de cuantificación de CTB+ encontradas el hemicord ipsolateral en ratones ileso o heridos, según la transdiaphragmatic (TDia) o transtorácica (TTho) enfoque de entrega CTB intrapleural. Barras representan 250 μm. los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). n = 5-7 ratones cada grupo TDia; n = 3 ratones de cada grupo TTho. Se realizaron pruebas de U de Mann-Whitney no paramétrica y resultados se consideraron como significativamente diferentes para p < 0.05. p < 0,001 para ileso versus lesión de C4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito en este documento puede aplicarse a cualquier cepa de ratones adultos o a cualquier paradigma experimental en el que se debe evaluar la integridad de los circuitos de diafragma PhMN. Por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y lesión de la médula espinal cervical (cSCI) son condiciones asociadas con pérdida de PhMN, degeneración anterógrada de axones frénicos y posterior compromiso respiratorio. Modelos animales de ELA o cSCI mímico histopatológicos y funcionales respiratorios déficits observados en enfermedades humanas. En estos modelos, a menudo se aplican técnicas histológicas para evaluar PhMN siguiente de supervivencia diferentes intervenciones terapéuticas con el objetivo de PhMN neuroprotección18,20,21. Problemas de absorción en el diafragma NMJ o transporte axonal sin duda afectarán la cantidad de CTB acumulado en los cuerpos celulares neuronales. Pérdida de axones frénicos o degeneración PhMN obviamente disminuirá la cantidad de retrotransported CTB en la médula espinal.
Cada enfoque de la administración intrapleural tiene sus propios pros y contras Transdiaphragmatic inyecciones son bastante invasivas, haciendo necesario laparotomía y sutura cuidadosa de todas las capas de la piel para prevenir la dehiscencia y protrusión de órganos. Laparotomía interfiere con la respiración normal22 y uno no puede descartar que puede afectar PhMN eficiencia actividad o retro-transporte. Sin embargo, la visualización directa del diafragma durante la inyección asegura éxito atacar todo el tiempo el espacio pleural. Las inyecciones transtorácicas son mínimamente invasiva en comparación con las inyecciones transdiaphragmatic y pueden considerarse un procedimiento de refinamiento, en el sentido del concepto de "Tres Rs". Una desventaja es el aumento de la probabilidad de ser objetivo para un usuario inexperto (por ejemplo, en el tejido subcutáneo o en la pared torácica).
Después de la administración de intrapleural fluorescente-CTB, es probable que cualquier neurona motora proyectar sobre los músculos que recubren la cavidad pleural será marcada, incluyendo PhMN, neuronas motoras intercostales o diferentes poblaciones de las neuronas motoras del tronco encefálico. En ratas adultas, Mantilla et al demostró que neuronas motoras intercostales también fueron etiquetadas en el cuerno ventral de médula espinal torácica, así como algunos de las neuronas de ganglio de raíz dorsal4. Nunca hemos comprobado la presencia de células CTB-etiquetados en otros sitios de la médula espinal cervical en ratones.
Dependiendo de los ajustes experimentales y modelos, las medidas de resultado incluyen la disposición columnar de PhMNs a lo largo de la médula espinal cervical, análisis detallado de datos geométricos sobre la posición de cada PhMN o, como describen aquí, la cuantificación de PhMN número. La evaluación precisa del número total de PhMN depende de consideraciones técnicas y confiabilidad inter-evaluador; debido a la variabilidad de la intensidad de la fluorescencia de CTB, tamaño del soma de la neurona o la tinción de fondo. En nuestra experiencia usando inyecciones transdiaphragmatic de CTB-fluoróforo, hemos estimado la cantidad de PhMN por ratón hemicord en un rango entre 120 y 180 células, una cantidad un poco inferior a los datos de otros grupos8. De hecho, hay dos limitaciones del estudio. En primer lugar, un número limitado de animales es inyectado con el acercamiento transtorácico y en segundo lugar hay una incertidumbre en el etiquetado completo de PhMN piscina. Inmersión del nervio frénico (después de la transección del nervio) o inyección intraneural con palpador neuroanatomical fluorescente es técnicas complementarias que pueden utilizarse para identificar con mayor precisión PhMNs todos. Para estudios futuros, es aconsejable contar PhMNs por métodos imparciales como la estereología.
En nuestra experiencia, no hemos observado nunca ninguna evidente déficit respiratorio o complicaciones (dificultad respiratoria) como sangrado o neumotórax siguiendo este procedimiento. Sin embargo, si el diafragma se ha dañado durante las inyecciones transdiaphragmatic, considere el uso de una aguja de diámetro más pequeño o con bisel más agudo.
Para evitar muerte de animales durante o después de la cirugía Revise cuidadosamente las concentraciones de cada componente en el cóctel de anestésico. Evitar lesiones en las superficies del hígado, el intestino, la vesícula biliar o el diafragma.
No o bajo etiquetado de PhMN podría ser debido a varias cuestiones. Si la inyección transtorácica no asiste a la cavidad pleural, volver a hacer y comprobar por palpación manual que se inserta la aguja debajo de las costillas o no estallar hacia fuera a través de la piel. Burbujas no forman con inyección de solución CTB. Recuerda también que la internalización de la CTB en la célula nerviosa es dependiente del pH23: pH ácido y neutro son óptimas, mientras que pH básico deteriora la absorción de la toxina. Se recomienda para Resuspender el polvo de la CTB en agua, solución salina o tampón PBS. Considerar el tiempo de persistencia de la toxina marcada en el cuerpo neuronal de la célula. En nuestra experiencia, podríamos detectar células CTB-etiquetados en una ventana de tiempo entre cuatro días y dos semanas después del parto intrapleural. Disminuyendo el tiempo asignado a la retrógrada transporte o aumentar el tiempo entre la entrega intrapleural y sacrificio podría comprometer la detección óptima de fluorescente-CTB en el tejido.
Para evitar fluorescencia decoloración utilice el método fijador adecuado. Le sugerimos que inunda el cuerpo del animal con paraformaldehído al 4%. Una vez que se cosecha la médula espinal, incubar en el mismo fijador durante una noche. Cryoprotect la cuerda en la solución de sacarosa al 30% por 72 horas hasta que se hunde, luego incorporar la ampliación cervical (aprox. 8 mm) en medio O.C.T.. No deshidratar o embeber la muestra en parafina. Proteger muestras espinales o secciones de tejido de luz durante el proceso post entero. Fijadas todo espinal cordones puede conservarse a 4 ° C durante meses si el timerosal se agrega a la solución de crioprotector (no agregar azida sódica como provocará decoloración de fluorescencia). Las secciones de tejido pueden conservarse a-20 ° C durante meses lejos de la luz. Por último, aconsejamos montar el portaobjetos con un reactivo anti-se descolora. Si la fluorescencia se ha desvanecido, es posible detectar CTB usando immunohistochemistry.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Robert Graffin y Pauline Duhant su soporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
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